Поиск Кабинет

Трансплантация аутогенных мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток на деминерализованном костном матриксе при лечении ложных суставов длинных трубчатых костей

Гены & Клетки: Том II, №3, 2007 год, стр.: 67-74

 

Авторы

Щепкина Е.А., Кругляков П.В., Соломин Л.Н., Зарицкий А.Ю., Назаров ВА, Вийде С.В., Шведова Е.В., Тихилов Р.М., Полынцев Д.Г.

ДЛЯ ТОГО ЧТОБЫ СКАЧАТЬ СТАТЬЮ В ФОРМАТЕ PDF ВАМ НЕОБХОДИМО АВТОРИЗОВАТЬСЯ, ЛИБО ЗАРЕГИСТРИРОВАТЬСЯ

Представлены результаты клинической апробации метода лечения ложных суставов [приоритет от 23.05.06 г., регистрационный номер 2006117605} с использованием биотрансплантата, изготавливаемого путем заселения аутогенными мультипотентными мезенхимальными стромальными клетками [ММСК] деминерализованного костного аллотрансплантата с плотностью 7-10 млн на 1 см3. Проведено лечение ложных суставов бедренной и большеберцовой костей у 10 пациентов, во всех случаях использовали чрескостный остеосинтез. При неосложненном течении послеоперационного периода сроки демонтажа аппарата и восстановления опороспо-собности конечности составили от 3 до 5 месяцев, что сравнимо со сроками сращения переломов этой же локализации. По данным рентгенографии и компьютерной томографии плотность трансплантата прогрессивно нарастала без предварительной фазы резорбции, сращение происходило преимущественно через трансплантат, что позволяет предположить не только его остеоиндуктивное воздействие, но и его остеокондуктивную роль.

Введение

Проблема лечения ложных суставов до настоящего мо мента остается актуальной для современной травматологии и ортопедии. Повышение хирургической активности в после дние десятилетия не только не решило, но и не уменьшило проблему несращения переломов. На настоящий момент можно выделить следующие направления в лечении лож ных суставов: 1) применение чрескостного остеосинтеза с направленным механическим (компрессия дистракция) воздействием на патологический очаг [1 6]; 2) совершен ствование методов свободной костной пластики ауто и ал лотрансплантатами [7 10]; 3) пластика кровоснабжаемыми комплексами тканей [11]; 4) применение клеточных техно логий. В частности, предложена стимуляция процессов кос теобразования путем введения в область ложного сустава клеточного эмбрионального ксенотрансплантата [12], ауто трансплантация костного мозга [13, 14], введение протеи новых субстанций [15, 16], культивированных фибробластов и мезенхимальных стволовых клеток (мультипотентных ме зенхимальных стромальных клеток, ММСК) [17 19].

Основной проблемой при инъекционном введении кле точного материала является то, что для дифференцировки клетки нуждаются в наличии поверхности для прикрепле ния, обладающей высокоадгезивными свойствами, и сре де для осмотического питания, которые отсутствует в руб цово измененных тканях ложного сустава. Вследствие этого большая часть клеток гибнет или мигрирует за пре делы области мишени. Процессы костеобразования и пе рестройки при различных вариантах ауто и аллопластики протекают длительно; при этом происходит прорастание новообразованной костной ткани в область пластики со стороны костных отломков, аутотрансплантаты и алло трансплантаты проходят стадию частичной резорбции [20, 21 ]. Представляется целесообразным совместить свойства деминерализованных костных трансплантатов и клеточного материала. Трансплантаты на основе деминерализованно го костного матрикса и культивированных костномозговых фибробластов использовались с положительным резуль татом в эксперименте [13] и клинике [17]. На современном этапе наиболее целесообразным представляется исполь зование иммобилизированных ММСК на различных по ристых матрицах [22, 23].

В эксперименте было получено костеобразование в де минерализованном трансплантате при заселении его син генными ММСК [25]. Это явилось основой для разработки метода лечения ложных суставов путем трансплантации аутогенных ММСК с применением биотрансплантата на основе деминерализованного костного матрикса [приори тет от 23.05.06 г., регистрационный номер 2006117605). Исследование утверждено ученым советом ФГУ «РНИИТО им. P.P. Вредена Росздрава» (г. Санкт Петербург) и разре шено этическим комитетом.

Предлагаем результаты клинической апробации предло женного метода, который в клинических условиях включал подготовку биотрансплантата, хирургический этап лечения и послеоперационный период.

Материал и методы

Способ апробирован при лечении ложных суставов большеберцовой и бедренной костей у 9 пациентов на 10 сегментах. Все пациенты давали добровольное информи рованное согласие на участие в клинической апробации.

В исследование включены пациенты в возрасте от 25 до 59 лет. У трех пациентов образование ложного сустава про изошло после консервативного лечения перелома, у 7 па циентов - после хирургического лечения, при этом пациенты переносили от одной до четырех операций остеосинтеза (погружного и внеочагового) на поврежденном сегменте. Длительность заболевания составляла от 6 месяцев до 4 лет. У трех пациентов в анамнезе имелись указания на хрони ческий остеомиелит. У них лечение ложного сустава произво дилось при достижении стойкой ремиссии после радикальной хирургической обработки очага остеомиелита. Критерием для включения пациента в исследование была длительность ремиссии более 6 месяцев.

Аллергических и пирогенных реакций на введение кле точного материала не отмечено. Температурная реакция в послеоперационном периоде колебалась в пределах суб фебрильной в течение 3 5 дней. Отек на уровне послеопера ционной раны в первую неделю был незначительный: +1 3 см; за исключением одного пациента с сопутствующей сердеч но сосудистой патологией, у которого отек на 1 2 сутки после операции составил +5 см. Сроки демонтажа аппарата внеш ней фиксации при стандартном неосложненном течении пос леоперационного периода составили от 3 до 5 месяцев с восстановлением опороспособности конечности. В двух слу чаях при смещении трансплантата в результате последую щих манипуляций фиксация продолжалась 7 месяцев. Гипсовая иммобилизация после демонтажа аппарата внеш ней фиксации не использовалась.

Выделение и культивирование ММСК

Получение костного мозга производили путем пункции подвздошной кости. Забирали 15 30 мл костного мозга, из которого выделяли аутогенные ММСК. Для этого образец костного мозга фракционировали методом центрифугиро вания на фиколле (плотность 1077 г/л), отбирали мононукле арную фракцию. Отобранный клеточный материал отмывали от фиколла питательной средой DMEM (HyClone, Новая Зе ландия) методом центрифугирования, клеточный осадок по мещали в среду культивирования, содержащую DMEM (Hyclone, Новая Зеландия), с 20% сыворотки эмбрионов коров (Hyclone, Новая Зеландия) и 100 мкг/мл пенициллина/стреп томицина (Hyclone, Новая Зеландия) и высевали на посуду для культивирования с плотностью 1,27x102 кл/сма. Клетки культивировали в монослое, культуру пересевали каждые сева культуры ММСК использовали раствор трипсина и ЭДТА (Hyclone, Новая Зеландия). Замену питательной среды про водили каждые 3 суток.

Фенотипирование ММСК

Фенотипирование ММСК проводили на проточном ци тофлюориметре Coulter Epics XL (Beckman, Coulter США). ММСК окрашивали антителами против негативных марке ров CD45 и CD34 (Beckman, Coulter США) и антителами против позитивных маркеров CD44, CD90, CD 105, CD 106 (Beckman, Coulter США) (рис. 1).

Для окрашивания антителами против поверхностных маркеров клетки снимали с чашек раствором трипсина и ЭДТА (Hyclone, Новая Зеландия), промывали два раза PBS, затем на 1 ч переносили в раствор моноклональных анти тел, конъюгированных с флюорохромом, в разведении 1:20. Далее клетки промывали два раза PBS и оценивали интенсив ность свечения. Фенотипирование проводили после второго пересева культуры и перед подготовкой биотрансплантата.

Подготовка биотрансплантата

В качестве матрикса использовали цельные фрагменты деминерализованных костных аллотрансплантатов из труб чатой кости которые изготавливают по стандартным серти фицированным методикам в отделении консервации тканей ФГУ «РНИИТО им. P.P. Вредена Росздрава». Перед работой с клеточным материалом трансплантаты предварительно от мывали в среде Хенкса в течение 24 48 часов для создания необходимого pH среды. Аутогенные ММСК заселялись на поверхность деминерализованных костных аллотрансплан татов в течение 24 72 часов в среде с аутосывороткой с плотностью заселения 7 10 млн на 1 сма трансплантата (рис. 2). Транспортировка трансплантатов в операционную производилась в стерильных флаконах в среде на аутосы воротке при температуре +18°... +22°С.

Хирургический этап

Производили экономную резекцию костных отломков в области ложного сустава с иссечением склерозированных участков (до кровоточащей кости) и удалением замыкатель ных пластинок из костномозгового канала. При выраженном склерозе в концах костных отломков резецировали их в пре делах здоровой костной ткани. После открытой адаптации через проксимальный и дистальный отломок вырезали паз размером до 5x1,5 см на всю толщину кортикального слоя (рис. ЗА), в который помещали подготовленные трансплантаты, перекрывая зону ложного сустава, с заполнением костно мозгового канала, и дополнительно укладывали трансплан таты параоссально (рис. ЗБ), фиксируя их циркулярными швами. Оставляли активный вакуум дренаж. Во всех случа ях использовали внеочаговую фиксацию (рис. ЗВ). В после операционном периоде дренаж удаляли на 2 е сутки, после чего разрешали ходьбу; швы снимали через 12 18 дней. Дозированную нагрузку на оперированную конечность раз решали после снятия швов, полную после 2 месяцев фикса ции. Проводили динамизацию аппарата внешней фиксации путем модульной трансформации (25). Демонтаж аппарата производили после достижения клинико рентгенологических признаков консолидации после клинической пробы.

После операции и далее ежемесячно проводилась ренге нография, реовазография, денситометрия, компьютерная томография. После 3 месяцев наблюдения компьютерная томография производилась с большим интервалом.

Результаты

При анализе данных рентгенологического исследования и компьютерной томографии у пациентов, оперированных по предложенному способу, во всех случаях выявлялись очаги ко стеобразования в трансплантате. Плотность трансплантата по данным рентгенографии и компьютерной томографии про грессивно нарастала, без предварительной фазы резорбции (рис. 4). В большинстве случаев образование «костной мо золи» на уровне контакта трансплантата с проксимальным и дистальным фрагментом происходило значительно быст рее, чем на стыке фрагментов, следовательно сращение происходило преимущественно через костный трансплан тат (рис. 5, 6). В трансплантате образование компактной кости отмечено раньше, чем в других участках «костной мо золи». Полученные данные позволяют предположить не только остеоиндуктивное воздействие внесенного биотран сплантата, но и его остеокондуктивную роль.

Клинические примеры

Пример 1,

Пациентка П., 43 лет, поступила в клинику с диагнозом «Атрофические ложные суставы обеих большеберцовых костей. Сросшийся с угловой деформацией и укорочением (5 см) перелом левой бедренной кости. Хронический остео миелит левой бедренной кости, фаза ремиссии» (рис. 7). В анамнезе: накостный остеосинтез левой бедренной и ле вой большеберцовой костей и внеочаговый остеосинтез правой большеберцовой кости в раннем периоде после травмы. В последующем - реостеосинтез бедренной кости в связи с переломом пластины, осложнившийся остеомие литом. После санации очага остеомиелита перелом левой бедренной кости сросся в аппарате внешней фиксации с уко рочением на 5 см. На правой и левой голени образование ложных суставов. В последующем - дважды на левой голени и три раза на правой голени выполнялись операции внеоча гового остеосинтеза с исходом в ложный сустав. Пациентке одномоментно выполнена резекция ложных суставов правой и левой большеберцовых костей, резекция правой и левой малоберцовых костей, костная пластика области ложных су ставов деминерализованными костными аллотранспланта тами, заселенными аутогенными ММСК, наложены аппараты внешней фиксации (рис. 8). В послеоперационном периоде при выполнении дополнительных репозиционных меропри ятий произошло смещение трансплантата из костного паза на правой большеберцовой кости. Аппарат внешней фик сации с левой голени демонтирован через 3 месяца после операции, с правой через 7 мес. после операции при клинико рентгенологической картине сращения (рис. 9).

Пример 2.

Пациент P., 47 лет, поступил в клинику с диагнозом «Лож ный сустав правой большеберцовой кости с варусно анте руквационной деформацией, сросшийся с деформацией пе релом правой малоберцовой кости» (рис. 10). После травмы лечился консервативно в гипсовой повязке. Пациенту выпол нена экономная резекция костных фрагментов, одномомент ное устранение деформации в аппарате внешней фиксации, костная пластика ложного сустава деминерализованными костными аллотрансплантатами, заселенными аутогенными ММСК (рис. 11). Аппарат внешней фиксации демонтирован при клинико ренгенологической картине сращения через 5 месяцев после операции (рис. 12).

Таким образом, при использовании трансплантатов, за селенных аутогенными ММСК, в обследованной группе больных консолидация в области ложного сустава в сред нем соответствовала срокам сращения переломов данной локализации. Полученные данные позволяют считать целе сообразным дальнейшие исследования клинического при менения предложенного метода.

Подняться вверх сайта