Поиск Кабинет

Тканевая инженерия кровеносных сосудов: способы совмещения клеток и носителя

Гены & Клетки: Том IX, №1, 2014 год, стр.: 23-34

 

Авторы

Насрединов А.С., Лаврешин А.В.

ДЛЯ ТОГО ЧТОБЫ СКАЧАТЬ СТАТЬЮ В ФОРМАТЕ PDF ВАМ НЕОБХОДИМО АВТОРИЗОВАТЬСЯ, ЛИБО ЗАРЕГИСТРИРОВАТЬСЯ

Одним из ключевых моментов создания тканеинженерных конструкций является заселение клеток на биодеградируемый носитель. В попытке добиться быстрого, эффективного и надежного результата совмещения клеток и носителяисследователи в области тканевой инженерии кровеносныхсосудов стали использовать преимущества полой трубчатой структуры матрикса в сочетании с действием различных физических сил: разницы давлений, центробежных, электростатических, магнитных сил и их комбинаций.

В данном обзоре описаны основные тренды и проблемы в разработке носителей, основные клеточные типы, использующиеся для совмещения с носителями с целью создания графтовсосудов, а также различные способы совмещения носителейи клеток, их достоинства и недостатки.

Аутогенные нативные сосуды остаются золотымстандартом при использовании в качестве шунтовв реконструктивной сердечно-сосудистой хирургии,однако их применение часто ограничено вследствиеих патологических изменений или недостаточногоколичества. В таких случаях успешно используютсясинтетические протезы из таких недеградируемыхполимеров как экспандированный политетрафторэ тилен (эПТФЭ, Тефлон, GoreTex) и полиэтиленте рефталат (Дакрон, Лавсан) с диаметром более 6мм. Однако при меньшем диаметре результаты опе раций остаются неудовлетворительными вследствиеразвития гиперплазии интимы в области анастомо зов и тромбоза шунта [1–3].

Прошло более 3 десятков лет с тех пор, какM. Herring et al. (1978) впервые описали одноэтап ную технику заселения сосудистых протезов эндоте лиальными клетками [4]. Эндотелиоциты соскребалискальпелем с внутреннего просвета участка подкож ной вены и переносили на внутреннюю поверхностьсосудистого протеза из дакрона диаметром 6 мм.Однако уже тогда было очевидно, что для улучшенияотдаленных результатов реконструктивных операцийнеобходимы функционально активные клетки, обла дающие антитромбогенными свойствами [5].

В последующем были исследованы различныеспособы получения «эндотелизированных» про тезов на основе синтетических недеградируемыхматериалов, но по-настоящему успешных методикразработано не было. Например, было показано,что через 24 ч после имплантации протеза 95%эндотелиальных клеток, совмещенных с ПТФЭ про тезом, смывались потоком крови [6].

В последние годы получила развитие тканеваяинженерия кровеносных сосудов, на которую воз лагают большие надежды в качестве альтернативыиспользующимся синтетическим протезам [7, 8].

Тканевая инженерия сосудов в своем классиче ском виде основана на заселении клетками реципи ента пористого биодеградируемого носителя в форметрубки нужной длины и диаметра из различных при родных и синтетических полимерных материалов,который играет роль временной основы для клеток,пока те под действием внешних факторов не сфор мируют собственный внеклеточный матрикс [9, 10].

Образование собственного внеклеточного матриксапроисходит в результате активации клеток под дей ствием сигналов, передаваемых имплантированнымносителем, который подвергается биохимическим ифизическим воздействиям. «Искусственный» сосудin vivo испытывает внешние воздействия, такие какдавление, напряжение сдвига, растяжение; крометого, в новый сосуд проникают макрофаги, которыевысвобождают ангиогенные вещества, и все это по степенно приводит к формированию зрелого сосуда[9–11]. Так, известно, что аутовенозный шунт послеимплантации приобретает многие свойства артерии:в нем увеличивается количество и размеры гладко мышечных клеток (ГМК) среднего слоя, за счет чегоутолщается вся стенка шунта [12].

Таким образом, основу тканевой инженерии со судов составляют четыре основных компонента:

  1. носитель, подходящий для совмещения с кле тами;
  2. клетки, которые могут быть эффективносовмещены с носителем;
  3. способ совмещения носителя и клеток;
  4. гуморальные и механические влияния окружа ющей среды, межклеточные взаимодействия.

Все эти факторы оказывают значительное вли яние на создание высокорганизованной сосудистойстенки.

Считается, что именно совмещение клеток с носителем является ключевым моментом создания тканеинженерных кровеносных сосудов (ТИКС)[13–16]. В нескольких исследованиях было доказано, что независимо от типа основы будущегососуда наличие клеток улучшает его проходимость[17–19]. В настоящее время нет единого стандартизированного подхода к способу заселения клеткамитрехмерного матрикса. За последние три десятилетия было предложено множество способов, но большинство из них слишком длительны, связаны с нежелательным воздействием на клетки и применимытолько в эксперименте [20, 21]. Для возможностиполучения необходимого для удовлетворения клинических потребностей количества сосудистых заменителей малого диаметра (менее 6 мм), которыесчитаются утопией, «Священным Граалем» тканевойинженерии сосудов [22, 23], необходимо разработать надежный, недорогой и эффективный способсовмещения клеток и носителя [24]. При этом, следует иметь в виду, что нельзя рассматривать способы заселения носителей клетками, не обсуждая приэтом сами носители и клетки. В настоящей работепредставлен обзор исследований, посвященных использованию клеток в тканевой инженерии сосудовмалого калибра и различным способам заселенияими матрикса сосудов.Основные тренды и проблемы в разработкеносителейБиодеградируемый полимерный носитель выполняет роль временной трехмерной основы для клеток,пока они не сформируют свой собственный внеклеточный матрикс. Это очень важная часть будущего сосуда, которая выполняет несколько функций.Во-первых, она позволяет расположить клеточныйкомпонент в трехмерном пространстве. Во-вторых,он задает механические свойства сосуда, такие какпрочность и форма [9, 10].

Для создания ТИКС можно использовать носители как из синтетических биосовместимых и биодеградируемых полимеров [25–27], так и из естественных материалов [28–31], к которым относятсядецеллюляризованные артерии [32–34].Носители на основе синтетическихматериаловНосители из синтетических биодеградируемыхматериалов могут быть синтезированы в любом количестве, различных форм и размеров. Кроме того,они обладают высокой прочностью, могут быть простерилизованы и храниться в стандартных условияхдостаточно долгое время без потери своих свойств[10, 22, 28, 35–38]. Наиболее часто используемый полимер для создания сосудистых матриксов –полигликолевая кислота (ПГК). Носители из ПГК теряют свою прочность в течение 4 нед. и полностьюрезорбируются к 4–6 мес. [9, 25, 35].

Одна из проблем трансплантатов, созданных наоснове синтетических биодеградируемых полимеров, заключается в скорости биодеградации, котораядолжна точно соответствовать скорости образования собственного внеклеточного матрикса сосуда[9, 22]. Необходимо учитывать, что скорость продукции компонентов внеклеточного матрикса клетками вариабельна, особенно в зависимости от возраста пациентов. Если разрушение носителя произойдетбыстрее, чем сформируется нормальная стенкасосуда, то это создаст риск разрыва трансплантатаи кровотечения.Скорость биодеградации можно варьировать, образуя комбинации ПГК с другими полимерами, например,с полигидроксиалканоатами [39–41], полимолочнойкислотой (ПМК) [42, 43], поли(ε-капролактоном)[7, 42] и полиэтиленгликолем [44]. Полученный материал, из которого изготавливают носители, определяет и механические свойства каркаса, и регулируетфенотип клеток, с ним совмещенных [36].

Стоит отметить, что, несмотря на то, что самаПГК обладает хорошей биосовместимостью, продукты ее распада могут вызвать воспалительный ответ[45, 46]. Носители из ПГК подвергаются гидролизус образованием воды и углекислого газа [9, 25, 35].

T. Higgins et al. (2005) обнаружили, что углекислота,образующаяся в результате деградации ПКГ, можетпривести к дедифференцировке и снижению пролиферативной активности гладкомышечных клеток[38].Степень пористости, как и размер пор синтетического носителя, очень важны, и этот вопрос обсуждается в литературе. Большинством исследователейоптимальным размером пор носителя считается100–150 мкм [47–49]. Размер пор определяет нетолько способ совмещения носителя с клетками и егоэффективность, но также влияет на поведение клеток после заселения [36, 48, 49]. Чем крупнее порыносителя, тем проще, быстрее и равномернее можнопроизвести заселение его клетками [9, 50]. Также этоспособствует более легкому совмещению клеток сносителем, лучшей диффузии питательных веществпосле имплантации и последующей неоваскуляризации. Для того, чтобы крупнопористые графты могливыдержать давление кровотока и не «протекать» после трансплантации, проводится предварительноеинкубирование in vitro, как правило, в специальном биореакторе, чтобы клетки могли сформировать свой собственный внеклеточный матрикс [51].

Методика желирования клеточной суспензии послесовмещения с носителем не используется.Таким образом, главное преимущество носителей из синтетических биодеградируемых материалов заключается в удобстве и воспроизводимостиих создания с заданными параметрами, такимикак диаметр, толщина стенки, скорость деградации, пористость и размер пор. Это, в совокупностис биосовместимостью материалов, обеспечивающей рост клеток на них и отсутствие реакции состороны реципиента, а также их достаточной механической прочностью, обеспечило их широкоеприменение в разработке ТИКС. Примерами успешного использования ТИКС на основе носителей изсинтетических материалов как в эксперименте,так и в клинике могут служить работы L. Niklasonet al. (1999) [37], D. Shum-Tim et al. (1999) [39] иT. Shin’oka et al. (2005) [7].

Носители на основе натуральных (естественных) материалов

Носители на основе коллагена

Очевидны преимущества применения естественных полимеров для создания основы будущего сосуда, из которых наиболее широко используетсяколлаген [52]. Первыми, кто сообщил о созданиисосуда in vitro, были C. Weinberg и E. Bell в 1986 г.[53]. Многослойная структура графтов напоминала структуру артерии. Для создания ТИКС были использованы коллаген, фибробласты, лейомиоцитыи эндотелиальные клетки бычьей аорты. Для усиления механической прочности в стенку протеза помещалась сетка из дакрона. Сосудистые кондуиты,созданные без такой сетки, расширялись и разрывались при очень низких внутрипросветных давлениях(10 мм рт. ст.). У протеза с одной сеткой прочностьна разрыв была 40–70 мм рт. ст., тогда как три слояколлагена, чередующиеся с двумя сетками, обеспечивали прочность на разрыв до 120–180 мм рт. ст.

Причинами недостаточных механических свойствпротезов, по мнению авторов, явились отсутствиеэластина, продольная (вместо циркулярной) ориентация гладкомышечных клеток, низкая плотностьлейомиоцитов и коллагена. Однако наличие высокодифференцированных гладкомышечных клеток ифункционального эндотелия, который синтезировалфактор фон Виллебранда и простациклины, привлекло внимание к данному виду протезов кровеносныхсосудов, что стало причиной дальнейших исследований в этой области.

J. Hirai et al. (1994, 1996) заливали раствор,содержащий гладкомышечные клетки собачьейяремной вены и коллаген I типа, в стекляннуюформу, получая при этом гибридную ткань в видетрубки, внутренняя поверхность которой была засеяна эндотелиоцитами яремной вены собаки[54, 55]. Получившийся ТИКС был вшит в нижнююполую вену собаки. Несмотря на низкое давление ввене, протез разорвался в течение нескольких днейпосле операции. Последующие протезы были обернуты сеткой из дакрона, чтобы предотвратить разрыв, их проходимость при этом составила 64% через6 мес. О полной перестройке графта свидетельствовало образование продольно-ориентированногоэндотелиального монослоя на внутренней поверхности, наличие циркулярно-ориентированных лейомиоцитов контрактильного фенотипа в субинтимальномслое, вросших фибробластов по всей толще сосудистой стенки, сети волокон коллагена в межклеточномпространстве и образование мембраны из эластинав субинтимальном слое. Однако синтезировать достаточно протяженную конструкцию из коллагена соструктурой нативного сосуда пока не удается. Крометого, до сих пор не решена проблема недостаточной механической прочности искусственных сосудовс основой из коллагена [22].

Носители на основе децеллюляризованныхсосудов

Интересным выглядит предложение использовать в качестве биодеградируемого носителя аллогенный или ксеногенный кровеносный сосуд, удаливиз него все клеточные элементы, оставив тольковнеклеточный матрикс [32, 34, 56, 57]. Этот процесс называется децеллюляризация и заключаетсяв наиболее полном удалении клеток и их остатков(клеточного дебриса) с минимальным повреждением соединительнотканного каркаса сосуда, которыйдолжен быть пригоден для дальнейшего заселенияклетками реципиента (рецеллюляризации).

Преимущества внеклеточного матрикса кровеносных сосудов, полученных методом децеллюляризации, заключаются в их естественной структуре,сохраненной механической прочности, отсутствиисинтетических материалов, минимальных иммуногенных свойствах, максимально благоприятныхусловиях для роста клеток реципиента [57–59].

В связи с этим не удивительно, что в настоящее время большинство стратегий создания искусственногососуда направлены на получение децеллюляризированного соединительнотканного каркаса сосуда,который может быть засеян клетками реципиентаin vitro до трансплантации [16, 22, 58, 60, 61].

Однако мелкопористая структура внеклеточногоматрикса артерии затрудняет активное заселениеклеток вглубь сосудистой стенки [62].

Основные типы клеток,совмещаемые с носителями с целью созданияграфтов сосудов

Наличие в составе тканеинженерного эквивалентаоптимального количества функционально активныхклеток, способных поддерживать соответствующийфенотип и выполнять конкретные биологическиефункции, является одним из основных факторовуспеха [16, 34, 40, 57, 63]. Клетки пролиферируюти продуцируют компоненты внеклеточного матрикса(в частности, коллаген) соответствующей организации и структуры, выделяют цитокины и другие биологически активные вещества, а также взаимодействуют с соседними клеткам или тканями. Вариантыклеток, применяющихся для создания ТИКС, весьмамногочисленны.

Эндотелиальные и гладкомышечные клетки

Логичным выглядит предложение использоватьвысокодифференцированные клетки сосудистойстенки, а именно эндотелиоциты и гладкомышечные клетки, для получения графта сосуда. Однакоих основные недостатки, такие как ограниченныйпролиферативный потенциал, требовательность кпитательной среде и условиям культивирования,значительно затрудняют их использование [13, 21,64, 65].

Стволовые и прогениторные клетки

Существуют и другие потенциальные клеточныесубстраты, в том числе стволовые и прогениторные клетки различных типов. При этом ключевымитребованиями, предъявляемыми к таким клеточнымпопуляциям, являются относительная доступностьтканевого источника их получения, возможность ихэффективной экспансии in vitro с наработкой значительного числа клеток в течение короткого времени,возможность заселения такими клетками носителейс сохранением механических свойств и, наконец, ихфункциональность in vivo [18, 59]. Учитывая совокупность перечисленных выше критериев, наиболее перспективными клеточными типами являются эндотелиальные прогениторные клетки (ЭПК)и мультипотентные мезенхимальные стромальныеклетки (ММСК), полученные из различных источников [64–67].

Эндотелиальные прогениторные клеткиК настоящему времени идентифицировано несколько популяций ЭПК, в первую очередь, циркулирующие ЭПК периферической крови. Однако безпроведения процедуры мобилизации костного мозга, имеющей высокую стоимость и связанной с рискомразвития осложнений, число выделяемых из умеренного объема периферической крови ЭПК крайненевелико, а их экспансия in vitro малоэффективнаиз-за относительно низкого пролиферативного потенциала таких клеток [65].

С этих позиций, более оптимальной альтернативой является применение эндотелиальных клетокпупочной вены человека (HUVEC), совокупностьбиологических свойств которых соответствует ЭПК[68]. Такие клетки широко используются в качествемодели ЭПК, при этом они являются относительнодоступным типом клеток, а их высокая пролиферативная активность обеспечивает эффективнуюэкспансию in vitro в относительно простых условиях.Заселение внутренней поверхности носителей клетками первичных культур HUVEC позволит придать сосудам необходимые биологические характеристики,однако следует учитывать наличие у таких клетокиммуногенных свойств. Аллогенное происхождение HUVEC делает необходимым проведение иммуносупрессивной терапии, имеющей высокую стоимость исвязанной с риском развития ряда побочных явленийи осложнений. До настоящего времени, применениеаллогенных клеток, в том числе прогениторных клеток пуповины человека, а также специализированныхклеток сосудов пуповины, таких как эндотелиоцитыи гладкомышечные клетки, ограничено их использованием только в доклинических исследованиях вкачестве моделей для отработки способов совмещения клеток и носителей и оценки работы сосудистыхграфтов в эксперименте [65, 67 ,68].

Мультипотентные мезенхимальныестромальные клетки

ММСК обладают такими ключевыми свойствами,как высокая пролиферативная активность и способность к дифференцировке в различные типы специализированных клеток. При этом они легко могутбыть получены в необходимом количестве в аутогенном варианте, в отличие от HUVEC и стволовыхклеток пуповинной крови, что в совокупности делаетих использование для создания ТИКС привлекательным для многих исследователей [15, 59]. Наиболеешироко применяются ММСК, полученные из костногомозга (ММСК КМ), где численность их популяции составляет лишь 0,01–0,001% от общего числа ядросодержащих клеток. Однако безопасная эксплантациизначительных объемов костного мозга, а также высокая пролиферативная активность ММСК КМ in vitroобеспечивают быстрое получение необходимого количества функционально активных клеток [65].

Альтернативным костному мозгу тканевым источником ММСК является жировая ткань, аспирациякоторой является еще более легкой и безопаснойпроцедурой, чем пункция костного мозга. Выделениепервичной популяции ММСК жировой ткани (ММСКЖТ), экспансия in vitro до получения необходимогоколичества клеток является на сегодняшний день отработанной и стандартизированной методикой [64,65, 68]. Более того, по данным ряда авторов, ММСКЖТ обладают более высокой пролиферативнойактивностью по сравнению с ММСК КМ того же донора, что делает их применение в создании ТИКСеще более привлекательным [65, 69].Совмещение носителей с ММСК разных типовпозволяет получить ТИКС, функция которого будетопосредована двумя механизмами. Во-первых, ММСК могут дифференцироваться (in vitro и in vivo)в эндотелиоциты (прямой механизм). Во-вторых,ММСК секретируют сложный комплекс цитокинов,в том числе хемоаттрактантов для циркулирующихЭПК и индукторов/регуляторов дифференцировки ЭПК в функциональные эндотелиоциты (паракринный эффект).

Способы совмещения различных носителейи клеток

Статичный метод

В настоящее время обычным способом совмещения клеток с носителем является так называемый статичный (пассивный, гравитационный)метод, заключающийся в нанесении концентрированной клеточной суспензии с помощью пипеткинепосредственно в просвет или на наружную поверхность заселяемого матрикса (рис. 1) [13, 27,34]. Клетки под действием силы тяжести оседаютна матриксе. После этого будущий сосуд помещаютв чашку Петри с ростовой средой и инкубируют отнескольких часов до нескольких дней. Эффективность совмещения оценивается в процентном отношении адгезировавших на матриксе клеток к ихисходному количеству. Для этой методики данныйпоказатель составляет приблизительно 10–25%[70]. Помимо низкой эффективности использования клеточной культуры, что особенно актуальнопри ее ограниченном количестве, применение этойметодики лимитирует минимальное проникновениеклеток вглубь сосудистой стенки, что напрямуюзависит от пористости носителя [13, 17, 25, 71]. С одной стороны, это может быть полезно для заселения эндотелиоцитами просвета мелкопористых носителей, поскольку при этом клетки будутадгезироваться только к внутренней поверхностиграфта, не проникая вглубь его стенки. С другойстороны, при статичном заселении крупнопористыхносителей, наоборот, легче достигается равномерное распределение по всей толще стенки матрикса,что важно для других типов клеток, таких как гладкомышечные клетки, ММСК, фибробласты.

Трудности с достижением однородности рас пределения клеток по всей поверхности матриксарешаются либо путем периодического переворачи вания конструкции, либо культивированием в тече ние достаточно продолжительного времени [13,70]. Несмотря на то, что длительное время инкуба ции может повысить эффективность метода, это жеможет привести к повышенному риску контамина ции, а также к нежелательной трансформации кле ток [13, 17]. Надо также отметить, что этот методсильно зависит от квалификации оператора, что мо жет сказаться на его воспроизводимости [13].

Таким образом, данный подход может быть ис пользован с любым типом носителя и клеток, но напрактике чаще всего используется для децеллюля ризованных тканей [19, 34, 57, 59]. Это связано,прежде всего, с тем, что все методы активного бы строго внедрения клеток посредством центрифуги рования, вакуумирования и тому подобных процедурпозволяют гораздо быстрее и равномернее совме стить клетки с синтетическими носителями, и в тоже время они не эффективны для децеллюляризо ванных сосудов вследствие огромного гидродинами ческого сопротивления тканей [26, 72].

Использование веществ, улучшающих адгезиюклеток к носителю

Иногда, для улучшения клеточной адгезии и по вышения эффективности совмещения, внутреннююповерхность носителя предварительно покрываютодним или несколькими биологически активнымивеществами, из которых наиболее часто исполь зуют фибронектин, фибрин, коллаген, ламинини плазму [73, 74]. Чаще всего эти вещества ис пользуют с синтетическими матриксами, повы шая биосовместимость носителя. A. Mathewset al. (2012) совмещали мелкопористые синтети ческие носители из поликапролактона, покрытыефибрином, с эндотелиоцитами, получая функцио нально-активный эндотелиальный монослой [63].

Интересно отметить, что децеллюляризованныеартерии, в отличие от синтетических носителей, нетребуют такой обработки, так как они состоят прак тически полностью из коллагена и содержат в оп тимальных количествах фибронектин, являющийсявнеклеточным белком [27]. Методы покрытия ТИКСбиоактивными веществами могут быть различными:от простого погружения протеза в раствор до егоперфузии [17, 75].

Одной из главных проблем использования ве ществ, повышающих адгезию клеток, является ихпотенциальная тромбогенность: если адгезирующи еся клетки не покроют всю внутреннюю поверхностьносителя, то останутся «открытые» участки, доступ ные для прикрепления тромбоцитов и формированиятромба.Кроме того, с целью повышения числа адгези ровавшихся клеток исследуется возможность им мобилизации биоактивных пептидов на заселяемомматриксе. Например, трансформирующий факторроста-β (TGF-β) может быть применен для увели чения синтеза внеклеточных белков гладкомышеч ными клетками и улучшения механических свойствТИКС [76, 77]; некоторые пептиды могут способ ствовать клеточной адгезии и распределению кле ток в толще матрикса [76, 78]. На сегодняшниймомент редкое применение биоактивных пептидовобусловлено недостаточно хорошо изученной без опасностью, возможной иммуногенностью и их по тенциальным нежелательным влиянием на приме няющиеся клетки [13].

Использование веществ, способствующих адге зии клеток, может оказаться полезным совместнос динамическими способами заселения, когда до стигается полное покрытие внутренней поверхностиТИКС клетками.

Динамические методы

Неудовлетворенность исследователей результа тами статичного засевания клеток привела к разра ботке целого ряда способов, основанных на ускорен ной доставке клеток при действии разницы давлений,центробежных, электростатических, магнитных сили их комбинаций. При этом значительно повышает ся эффективность использования клеток, однород ность и глубина внедрения их в структуру носителя.

Полая трубчатая структура матрикса в данном случаеявляется преимуществом и играет ключевую роль вомногих описываемых методах, соответственно ихприменение в тканевой инженерии других тканейограничено.

Механическое перемешивание, вращение

Использование простого механического переме шивания питательной среды, в которой находятсясовмещающиеся носитель и клетки, например, наорбитальном шейкере, позволяет повысить числоконтактов клеток с матриксом [79]. B. Kim et al.(1998) обратили внимание, что таким образом ужечерез 20 ч. количество прикрепившихся гладкомы шечных клеток увеличивалось в 10 раз по сравне нию со статичным заселением [26]

В ряде работ использовалось вращательное дви жение клеточной суспензии при помощи спиннер фласка или магнитного миксера вокруг засеваемо го матрикса, находящегося в центре культуральнойемкости [26, 80, 81]. Клетки, как более тяжелыечастицы, под действием центробежной силы стре мились к центру емкости, образуя, таким образом,высокую концентрацию вокруг носителя, что способ ствовало повышению эффективности использованияклеточной популяции (). Скорость вращениясоставляла около 50 об./мин, продолжительностьв среднем 24 ч. При этом не описаны какие-либовредные воздействия на клетки, но отмечено улуч шение циркуляции питательной среды, повышениечисла контактов клеток с носителем. Тем не ме нее, стоит отметить, что этот способ неэффективенпри низких концентрациях клеток в суспензии [82]. В связи с тем, что использование данного методаприводит к адгезии клеток на внешней стороне носи теля, его применяют только в случае фибробластов,гладкомышечных клеток и ММСК.

Кроме того, повысить однородность распреде ления клеток в стенке матрикса можно при помощивращения носителя, заполненного клеточной суспен зией, с небольшой скоростью, от 0,16 до 5 об./мин,в горизонтальном положении [83]. Этот прием мо жет быть использован как с эндотелиоцитами, таки с другими типами клеток, поскольку идет совме щение клеток с носителем в направлении изнутри кнаружи. Так, в исследовании S. Wang et al. (2013)синтетический носитель из ко-полимера молочной кислоты заполняли изнутри суспензией эндотелиоцитов, после чего обеспечивали вращениематрикса в горизонтальном положении со скоростью5 об/мин в течение 7 дней, получая эндотелиальный монослой на внутренней поверхности графта[84]. B. Nasseri et al. (1993) совмещали миофибробласты с носителем из кополимера ПГК, получая к 10 дню полную инфильтрацию стенки носителяклетками [85].

В других исследованиях скорость вращения былагораздо больше – от 1000 до 6000 об./мин [70, 80,86–88]. В данных системах использовалась центробежная сила для улучшения проникновения клетоквглубь стенки носителя. Матрикс, заполненный клеточной суспензией, вращался через свою продольную ось, чем достигалось движение клеток в направлении от условного центра графта к его стенке (рис. 3). Такие системы значительно увеличивали эффективность использования клеток: до 90%культуры проникали и однородно распределялись вструктуре матрикса при небольшой продолжительности центрифугирования [70, 80, 86]. Интересно, чтоклетки не только сохраняли свою жизнеспособность,но и морфологию [86–88]. W. Godbey et al. (2004),в частности, показали, что совмещение гладкомышечных клеток и фибробластов с носителем из ПГК с помощью центрифугирования позволяет втечение 10 мин добиться трехкратного увеличенияэффективности заселения по сравнению со статичным методом или использованием спиннер-фласка[89]. Однако чем меньше диаметр сосуда, тем вышедолжна быть скорость вращения для создания нужной силы относительного ускорения, и тем сложнееподдерживать ось вращения. Кроме того, стандартные центрифуги не подходят для реализации этогометода, что требует либо создания собственных (самодельных) устройств, либо конструирование специального ротора для имеющейся центрифуги [80].

Стоит отметить, что этот способ не применим дляэндотелиоцитов при использовании крупнопористыхсинтетических носителей в связи с их проникновением далеко вглубь стенки матрикса, где они не будутвыполнять свои функции. В то же время центрифугирование может оказаться полезным при эндотелизации децеллюляризованных сосудов и других мелкопористых носителей, так как из-за мелкого размерапор, эндотелиоциты окажутся распластаны на внутренней поверхности графта. Исследования такогорода пока проведены не были, но представляютсявесьма перспективными.

Временное изменение электростатическогозаряда носителя

Для улучшения адгезии эндотелиальных клетокк внутренней поверхности носителей из политетрафторэтилена (ПТФЭ) был предложен способ, основанный на изменении электростатических свойств:заряд стенки матрикса из ПТФЭ, который в норме является отрицательным, меняется на положительныйдля улучшения прикрепления и созревания эндотелиоцитов. Экспозиция клеток всего лишь в течение16 мин в таких системах повышает эффективностьзаселения до 90% [17, 89]. Среди преимуществ такого способа – возможность достичь быстрой морфологической зрелости клеток до трансплантации,что подтверждено результатами сканирующей электронной микроскопии [89, 90]. Улучшение удержания клеток на поверхности носителя подтвержденоисследованием флюоресцентных меток через 1 нед. после имплантации [89]. В отличие от рассмотренных ранее веществ, улучшающих клеточную адгезию, электростатическое воздействие на протез носит временный характер и не связано с повышениемтромбогенности [91]. С другой стороны, этот способне был изучен на современных биодеградируемыхматриксах, например, из ПГК и ее ко-полимеров, чтотребует дальнейших исследований.

Использование вакуума

С середины 1980-х годов исследуются системы,использующие для совмещения носителей с клетками разницу давлений [92]. Они подразумеваютприложение отрицательного давления – вакуума– либо с внутренней стороны [27, 93], либо с наружной стороны [15, 94] носителя для улучшенияпрохождения клеточной суспензии через микропоры материала (рис. 4, 5). При этом жидкая частьклеточной суспензии достаточно свободно проникает сквозь стенку засеваемой основы, которая выполняет роль своеобразного мембранного фильтра,тогда как клетки «застревают» в его порах. Такиесистемы позволяют чрезвычайно быстро, в течение 10 мин, заселить ТИКС с эффективностьюот 60 до 90% [13 ,15, 94]. Более того, в отличиеот статичного совмещения этот метод не зависит отоператора [27]. L. Solchaga et al. (2006) исследовали адгезию человеческих ММСК костного мозгак синтетическому матриксу из ко-полимера ПГКс пористостью 80% и средним размером пор 83мкм [95]. В результате оказалось, что использование вакуума (85 мм рт. ст.) в течение 10 минпозволяет добиться увеличения эффективностиминимум в 2 раза, по сравнению со статичным методом заселения в течение 72 ч. Авторы сделаливывод, что метод является быстрым, воспроизводимым и безопасным. Кроме того, доказано отсутствие негативного влияния на функции и жизнеспособность клеток [95].

Использование сил магнитного притяжения

Интересен способ совмещения клеток с носите лем, основанный на использовании сил магнитногопритяжения для увеличения эффективности засе ления. Одним из вариантов является использованиесуперпарамагнитных одноразмерных полимерныхнаночастиц «dynabeads» (DynaBiotec, Норвегия),способных соединяться с выбранным типом кле ток, молекулой или белком [96]. Клетки, меченныеdynabeads, могут быть засеяны на матрикс с ис пользованием временного магнитного поля менеечем за час с последующим 12-часовым культиви рованием, а эффективность совмещения достигает99% [96, 97]. Другим вариантом является при менение суперпарамагнитных наночастиц оксидажелеза (superparamagnetic iron oxide nanoparticles,SPION), которые внедряются внутрь клетки [98].Клетки с такими частицами засеваются на матрикс,внутрь которого помещают магнит (рис. 6). Черезнесколько мин магнитного воздействия и 24 ч по следующего культивирования количество адгезиро ванных клеток составило более 90% [33, 98, 99].

Магнитные наночастицы могут быть использованыс любыми типами клеток и носителей, в том числес децеллюляризованными артериями [34], что яв ляется несомненным преимуществом. Более того,описано последовательное совмещение фибробла стов, гладкомышечных клеток и эндотелиоцитовс носителем для создания всех трех слоев сосуди стой стенки [99]. Также плюсом является быстротазаселения клеток и воспроизводимость результа тов. Не было выявлено никакого вредного воздей ствия на клетки при малой концентрации частиц,с другой стороны, исследования показали сниже ние пролиферативной активности при использова нии более 100 мкм наночастиц оксида железа наклетку [99] и более 50 dynabeads на клетку [97].Кроме того, пока не изучены отдаленные эффектыприменения таких частиц и не понятно, что с нимипроисходит после трансплантации ТИКС и каковыих возможные негативные влияния местного и об щего характера [13].

Комбинированные способы динамическогосовмещения клеток с носителем

Для крупнопористых носителей из синтетическихко-полимеров, сочетание сразу нескольких опи санных способов воздействия, таких как вращение,разница давлений и другие, несмотря на некотороеусложнение процесса внедрения клеток, приводит клучшим результатам [51, 100].

Одним из таких методов является так называе мое «ротационное вакуумное заселение», основан ное на описанных ранее принципах для эффектив ного, автоматизированного и воспроизводимогосовмещения клеток и носителя [15, 100]. С по мощью специальной канюли через матрикс перфу зируется суспензия прогениторных клеток и одно временно вся конструкция вращается вокруг своейпродольной оси внутри вакуумной камеры. К пре имуществам данного метода относятся: доставкаклеток через всю толщу стенки по всей длине ма трикса, воспроизводимость и автоматизация про цесса. Авторы говорят о 60–90% эффективностиклеточного заселения, и отмечают, что она зави сит от размера пор матрикса, а также от скоростиперфузии. Лучшие результаты были получены применьшем размере пор и низкой скорости потокаклеточной суспензии [100]. Недостатком данногометода можно считать его сложность. При успеш ном применении сочетаются сразу несколько прин ципов засевания клеток с повышенной эффектив ностью. С другой стороны, из-за такого сочетанияснижается надежность метода. Кроме того, в ужеготовом устройстве предусмотрена возможностьиспользования графтов только определенной дли ны и диаметра [101].

Создание ТИКС с использованиемфотополимеризующегося гидрогеля

Известно применение производных фотополиме ризующегося полиэтиленгликоля, с характеристи ками естественного внеклеточного матрикса, длясоздания ТИКС [102]. Этот полимер не оказываетнегативного влияния на клетки и ткани [103, 104].Гидрогель, содержащий клетки, заливается в специ альную форму и под воздействием ультрафиолетаполимеризуется, что позволяет получить однороднозаселенный ТИКС [103]. Этот подход демонстриру ет обнадеживающие результаты в исследованиях invitro в отношении эффективности использованияклеток, сохранения их жизнеспособности и проли феративной активности, несмотря на воздействиеультрафиолета во время процедуры фотополимери зации [102]. Испытания ТИКС, полученных из такихгидрогелей, in vivo пока не проведены, поэтому ещепредстоит выяснить, сможет ли такая конструкциявыдержать артериальное давление и быть устойчивой к тромбообразованию [13].

«Безматриксное» изготовление ТИКС

Альтернативным подходом является использова ние только клеточных популяций и продуцируемогоими в условиях in vitro межклеточного матрикса длясоздания ТИКС. В этом случае, нет необходимостииспользовать носитель для совмещения с клетками:основу ТИКС формируют сами клетки. Такой метод,обозначаемый в зарубежной литературе «cell-sheetengineering» был разработан N. L’Heureux et al.(2007, 1998, 2007, 1993) [8, 105–107]. Вместоиспользования «классического» метода с совмеще нием клеток и носителя, клетки выращивали в моно слое с получением клеточных пластов. Фибробла сты кожи человека культивировали на специальнойподложке в течение 6–8 нед. для создания богатогоколлагеном пласта живых клеток. Полученный пласт 4 раза оборачивали вокруг металлического стержнядиаметром 4,75 мм так, чтобы получилась трубка,которую помещали в питательную среду на 12 нед.,в течение которых все слои фибробластов сраста лись. После этого полученную трубку высушивалина воздухе в течение нескольких часов. Получен ную таким образом девитализованную коллагено вую трубку, выполняющую функцию внутреннеймембраны, четырежды оборачивали пластом живыхаутологичных гладкомышечных клеток и в течение 8–12 нед. культивировали в питательной среде. За7 сут. до трансплантации полученную трубку изнутризаселяли эндотелиоцитами и проводили прекондици онирование полученного графта в биореакторе. Пре имуществами этого метода являются равномерноераспределение клеток в сосудистой стенке, наличиеслоев гладкомышечных и эндотелиальных клеток,высокая механическая прочность. К недостаткамданного подхода относится слишком длительныйсрок изготовления таких сосудов – от 6 до 9 мес.(в среднем 7,5 мес.), а также высокая стоимость. В настоящее время эта техника используется компа нией Cytograft Tissue Еngineering (США) и называет ся Lifeline™. (рис. 7)

Применение биореакторов в тканевой инженериикровеносных сосудов

В создании ТИКС часто используют биореакторыдля воссоздания физиологических условий и био механических воздействий, которые сосуды и клет ки постоянно испытывают in vivo (напряжение сдви га, циклическое растяжение и гидростатическоедавление). Это обеспечивает улучшение клеточнойадгезии, стимуляцию формирования внеклеточно го матрикса и дифференцировки гладкомышечныхклеток и эндотелиоцитов [37, 108, 109]. Однакостоит отметить, что биореактор никогда не приме няется для заселения клеток – только для инкуби рования уже заселенного графта непосредственноперед трансплантацией. Вопросы, связанные сиспользованием биореактора являются темой от дельного обсуждения и выходят за рамки данногообзора.

Заключение

Исследователи в области тканевой инженериикровеносных сосудов сфокусировались на созданиибиодеградируемых носителей и методиках заселе ния их жизнеспособными клетками [8, 13, 16, 21,64, 67]. Было предложено множество материаловдля создания матриксов – ПГК, ПМК, гидрогели,коллагеновые пласты и децеллюляризованные сосу ды [11, 25, 71, 72, 105]. Однако создание носителя– это лишь первый шаг в разработке ТИКС. Его за селение клетками является гораздо более важными решающим этапом в создании функциональныхкровеносных сосудов, и этому посвящены многиеисследования [13, 80, 95, 98, 99]. Являясь ключе вым моментом в создании ТИКС, способ заселениявлияет не просто на количество клеток, изначальноприкрепившихся к матриксу, но и на качество экви валента ткани, получаемого при дальнейшем культи вировании.

Метод клеточного заселения зависит от типаиспользуемых клеток, типов носителей и стоящихклинических задач. Так, следует четко разделятьсовмещение клеток с крупнопористыми искусствен ными носителями и децеллюляризированными кро веносными сосудами. Рутинно использующийся ста тичный метод значительно уступает динамическимспособам совмещения, при которых повышается нетолько число иммобилизованных клеток, но и одно родность их распределения в матриксе [26].

Максимальное использование клеточной попу ляции очень важно, что особенно актуально при еемалом количестве, и этому уделяется значитель ное внимание. Но важно понимать, что максималь ная концентрация клеток в матриксе не являетсясамоцелью. Зависимость между клиническим дей ствием и плотностью клеточного заселения до сихпор не изучена, поэтому еще предстоит ответить навопрос: является ли высокая эффективность кле точного заселения такой уж необходимой? Крометого, еще необходимо разработать единый методколичественного анализа эффективности заселе ния клеток для сравнения различных используемыхметодик.

Требует дополнительного обсуждения выбор типа(или нескольких типов) клеток, наиболее оптималь ных для создания ТИКС. Доказано, что наличие эндотелиоцитов на внутренней поверхности носителя снижает его тромбогенность [17, 63, 85, 92, 93].

Использование лейомиоцитов позволяет получить ТИКС, по своей структуре максимально похожий нанормальную артерию, но критическая потребностьв их наличии в составе графта сосуда не доказана.

Мало изучена возможность одновременного илипоследовательного заселения носителей разнымиклеточными типами. Возможно, сочетание различных способов доставки клеток привело бы к лучшимрезультатам. Многообещающим выглядит предложение использовать прогениторные клетки для заселения ТИКС, из которых наиболее широко используются ММСК [7, 19, 59]. Доказано, что ММСК обладают некоторой антитромбогенной активностью[18], однако их дальнейшая судьба после заселения,их роль и влияние на ремоделирование ТИКС пока доконца не изучены [16].

Таким образом, оптимальная методика совмещения клеток применительно к определенномутипу носителя, которая бы удовлетворяла всемзапросам, до сих пор не разработана, хотя определенный научно-технический задел в данном области уже сформирован, в том числе благодаряфундаментальным и прикладным работам российских исследователей [110–113]. Такой протокол должен быть стандартизированным, быстрым,экономически оправданным, желательно одноэтапным, безопасным, надежным, приводить к высокойэффективности заселения клеток и их однородномураспределению в структуре матрикса.

Подняться вверх сайта