Поиск Кабинет

Тканевая инженерия клапанов сердца: децеллюляризация алло- и ксенографтов

Гены & Клетки: Том VII, №1, 2012 год, стр.: 34-39

 

Авторы

Курапеев Д.И., Лаврешин А.В., Анисимов С.В.

ДЛЯ ТОГО ЧТОБЫ СКАЧАТЬ СТАТЬЮ В ФОРМАТЕ PDF ВАМ НЕОБХОДИМО АВТОРИЗОВАТЬСЯ, ЛИБО ЗАРЕГИСТРИРОВАТЬСЯ

Имеющиеся осложнения, связанные с протезированием клапанов сердца, диктуют необходимость разработки новых методов создания протезов клапанов. Одним из таких методов является тканевая инженерия клапанов сердца. Клапаны, изготовленные с помощью тканеинженерного подхода, являются биосовместимыми, прочными, длительно служащими, не требуют антикоагулянтной терапии, а главное, способны к регенерации и росту вместе с ростом сердца реципиента. Наиболее развитым направлением тканевой инженерии клапанов сердца является их децеллюляризация, то есть создание бесклеточного матрикса, который можно заселить клетками-предшественницами пациента и трансплантировать. В данном обзоре рассмотрены основные способы и методы децеллюляризации, их качество и способность влиять на структурные и биомеханические свойства алло- и ксенографтов.

Операции по поводу заболеваний клапанного аппарата сердца занимают весомую долю среди всех кардиохирургических вмешательств. Так, число пациентов по всему миру, нуждающихся в протезировании клапанов сердца, в 2005 г. составило 290 тыс. человек. Ожидается, что эта цифра должна утроиться к 2050 г. и составить 850 тыс. человек [1]. При этом финансовая сторона вопроса, мягко говоря, впечатляет – мировые продажи на рынке протезов клапанов возросли с 910 млн долларов в 2002 г. до 1 млрд долларов в 2005 г. Несмотря на то, что качество, дизайн и свойства протезов клапанов сердца постоянно совершенствуются, они не могут сравниться по своим свойствам с нативными клапанами. Наиболее частыми осложнениями после имплантации механических протезов являются тромбоэмболии, предупреждение которых требует постоянной антикоагулянтной терапии, кровотечения, сопряженные с этой терапией, плохие гемодинамические параметры и протезный эндокардит. Биологические протезы решают некоторые из этих осложнений, однако имеют ряд своих серьезных проблем, главными из которых являются кальцификация и биодеградация, требующие репротезирования через 10–15 лет, отсутствиевозможности роста и протезный эндокардит [6]. Необходимость устранения указанных осложнений, а также максимального приближения к структуре и функции естественных клапанов сердца определяет потребность в осуществлении следующего шага в разработке и производстве протезов клапанов сердца, связанного с достижениями тканевой инженерии [2].

Создание клапана с помощью «инструментов» тканевой инженерии сопряжено с комплексом сложных задач, ключом к решению которых служит полное и глубокое понимание структуры и функции клапана. Нормальный клапан состоит из специализированных клеток и экстрацеллюлярного матрикса (ЭЦМ), способных к ремоделированию в ответ на различные механические нагрузки и воздействия [3]. Открываясь и закрываясь 40 млн раз в год, клапан сердца от раза к разу подвергается изменениям в форме и размерах, нагрузке на створки и поддерживающие клапан структуры [4]. Клапан сердца, изготовленный посредством тканевой инженерии, должен не только успешно адаптироваться к этим деформациям, но также обладать оптимальными гибкостью и прочностью, быть легко имплантируемым, долговечным, устойчивым к инфекции, атромбогенным и, что особенно актуально для детской кардиохирургии, обладать способностью к ремоделированию и росту вместе с ростом других структур сердца (табл).

Структура клапана сердца

Микроскопически створки клапана сердца состоят из трех слоев: желудочкового, в состав которого входят радиально ориентированные волокна эластина; фиброзного, состоящего из коллагеновых волокон, ориентированных по окружности; и расположенного между ними губчатого слоя, богатого гликозамино-гликанами. Вместе коллаген, эластин и гликозаминогликаны образуют ЭЦМ, который определяет длительность работы и биофизические свойства клапана [5]. Комплексная перестройка слоев во время сердечного цикла позволяет компенсировать нагрузки, обусловленные кровяным давлением и изменением формы и размеров при движении створок. Коллагеновые волокна фиброзного слоя составляют наиболее жесткую часть створки, ответственную за противостояние нагрузкам во время диастолы, а также за кооптацию створок во время диастолы, когда поверхность створки максимальна. Коллагеновые волокна являются неэластичными и неспособными выдерживать нагрузки на растяжение, поэтому макроскопически они имеют складки, позволяющие увеличивать площадь створки с минимальным стрессом во время закрытия клапана. В открытом состоянии эластин растягивается, в то время как коллагеновый слой образует складчатую структуру, при закрытии клапана коллагеновые волокна расправляются и нагрузка смещается от эластина к коллагену. Эластин восстанавливает сокращенную конфигурацию створок во время систолы. Губчатый слой является своеобразной подушкой, которая принимает, абсорбирует и гасит энергию удара струи крови во время систолы [6].

Клеточный состав клапанов сердца включает эндотелиальные (ЭК) и интерстициальные клетки (ИК) (фибробласты, миофибробласты, лейомиоциты, нервные клетки). ЭК создают атромбогенную поверхность клапана и контролируют иммунные и воспалительные реакции. Клапанные ЭК отличаются от сосудистых реакцией на механический стресс – в сосудах клетки эндотелия залегают параллельно потоку крови, в клапанах – перпендикулярно [7].Кроме того, ЭК способны модулировать функцию интерстициальных клеток [8].

ИК – наиболее многочисленная гетерогенная группа клеток, осуществляющих синтез компонентов ЭЦМ и его ремоделирование за счет продукции протеолитических ферментов (матриксные металлопротеиназы, ММП) и их ингибиторов. ИК являются динамической популяцией, включающей различные клеточные типы, морфофункциональная активность которых определяется условиями микроокружения [9]. При этом доминирующими клетками являются фибробласты, характеризующиеся наличием виментина, низким содержанием α-гладкомышечного актина, ММП-13 и немышечного миозина тяжелых цепей (SMemb) [10], а также миофибробласты, участвующие в процессах ремоделирования ЭЦМ, репаративной регенерации и контракции [11]. Оба этих фенотипа вместе обеспечивают стабильность и целостность структуры клапана.

Тканеинженерные подходы к созданию клапанов сердца

Первые попытки создания клапанов с помощью методов тканевой инженерии связаны с исследованиями M. Grimm et al. (1991). Эта научная группа университета Вены занималась исследованием роста ЭК на бычьем перикарде, фиксированном в глутаральдегиде [12]. Было показано, что инактивация глутарового альдегида L-глутаминовой кислотой улучшает результаты экспансии ЭК на поверхности перикарда, что может служить основой для новых технологий производства биопротезов с улучшенными свойствами. Однако дальнейшее развитие эта работа не получила.

Классическая технология тканевой инженерии включает в себя этапы создания каркасной основы (носителя), совмещение её с клетками, инкубирование полученного материала in-vitro для формирования прототипа (эквивалента) ткани в условиях, моделирующих особенности микроокружения in vivo, последующая трансплантация в организм реципиента, где трансплантат вовлекается в стадию роста и ремоделирования [13]. Ключевыми физиологическими процессами, происходящими in vitro и in vivo, являются пролиферация и миграция клеток, продукция и организация ЭЦМ, биодеградация носителя и ремоделирование ткани. Также существует альтернативная парадигма тканевой инженерии, включающая в себя создание матрицы, незаселенной клетками, однако снабженной специфическими факторами для in vivo привлечения, адгезии и развития на своей поверхности клеток реципиента [6].

Основные тренды разработок носителей в рамках тканевой инженерии клапанов сердца сводятся к децеллюляризации тканей, производству синтетических рассасывающихся матриксов, а также полимеризованных биологических экстрацеллюлярных носителей, содержащих клетки [14]. В настоящей статье мы остановимся более подробно на создании клапанов методом децеллюляризации.

Децеллюляризация клапанов сердца

Идея данного подхода к изготовлению клапанов сердца является осознание того факта, что основную антигенную нагрузку алло- и ксенографтов несет в себе клеточный компонент. Несоответствие по комплексам гистосовместимости более актуально для имплантируемых ксенографтов, чем для аллографтов [14]. Кроме того, ксенографты необходимо фиксировать в глутаровом альдегиде, который является причиной цитотоксических и других побочных реакций. Длительность работы биопротезов, фиксированных в глутаровом альдегиде, ограничена процессами кальцификации и деградации. Клетки и клеточные мембраны ксенографтов провоцируют раннюю кальцификацию биопротеза [15], при этом установлена прямая связь между специфическим иммунным ответом в организме рецепиента посредством антител и кальцификацией [16]. Концепция децеллюляризации направлена на то, чтобы решить эту проблему.

Человеческие аллографты, имплантируемые в настоящее время, не проходят процедуру индивидуального подбора совместимости с реципиентом, однако демонстрируют «срок службы» в течение 15–20 лет. Это объясняется возможным особым положением клапана в организме – в высокоскоростном потоке крови, при котором моноциты и другие клетки иммунной системы не могут в достаточной мере связываться с антигенами структур клапана [14]. Однако многие исследования демонстрируют активацию анти-HLA антител у пациентов после имплантации человеку аллографтов [17, 18]. Децеллюляризация человеческих гомографтов позволяет снизить антигенную нагрузку и уменьшить иммунный ответ по сравнению с обычными криоконсервированными гомографтами [19]. Отсутствие макрофагальной и Т-клеточной инфильтрации децеллюляризованных клапанов по сравнению с криоконсервированными способствует улучшению результатов лечения с использованием подобных клапанов в отдаленном периоде [20]. Кроме того, децеллюляризованный клапан служит матрицей для репопуляции клетками хозяина. Этап рецеллюляризации осуществим как до введения клапана – в условиях in vitro, так и после имплантации бесклеточного носителя – посредством заселения ее циркулирующими прогениторными клетками [21]. Тканеинженерный клапан становится полностью невидим для иммунной системы реципиента, поскольку покрыт собственными ЭК, идентифицируемыми как «свои», и постепенно ремоделируется, деградирует и замещается компонентами ЭЦМ, синтезируемыми ИК.

Основной задачей децеллюляризации является устранение клеток и клеточного дебриса при полном сохранении структуры ЭЦМ и его биофизических свойств. Сам процесс создания бесклеточного носителя складывается из этапа разрушения клеточных мембран и рибонуклеиновых кислот и этапа их экстракции при помощи различных детергентов [14]. Детергенты, используемые большинством исследователей, включают в себя анионные (SDS – додецилсульфат натрия), цвиттерионные (CHAPS и CHAPSO – сульфобетаиновые производные холиевых кислот), неионные (Тритон Х-100, bigCHAP) вещества, энзимы (трипсин), а также большое количество других реагентов. Энзимы, добавляемые к детергентам в процессе децеллюляризации, необходимы для расщепления и удаления ДНК и РНК, являющихся частью клеточного дебриса. Из-за того, что перечисленные вещества могут повреждать матрикс, некоторые исследователи используют ингибиторы ферментов, например, ингибитор трипсина для децеллюляризации [22]. Важно отметить, что компоненты, используемые для экстракции клеток, могут наносить серьезный ущерб структуре ЭЦМ: способствуют разрушению или денатурации матриксных протеинов, являются причиной наличия токсических остатков или остаточных изменений, что может значимо повлиять на механическую функцию или клеточный ответ. Основными параметрами, которые изменяются исследователями, являются виды используемых специфических детергентов, последовательность шагов в процессе децеллюляризации и длительность экспозиции реагентов. При этом чаще всего варьирует микроскопическая структура полученного матрикса, часто характеризующаяся пористостью, или наоборот – коллапса структур ЭЦМ, микроразрывов или полной деградации. В настоящее время насчитываются десятки, если не сотни протоколов по созданию бесклеточного матрикса, что свидетельствует о продолжающемся поиске оптимального варианта.

Способы децеллюляризации матрикса

Додецилсульфат натрия (SDS) во многих работах до недавнего времени описывался как эффективный детергент по удалению клеток, применяемый для обработки как сосудистых кондуитов [23], так и створок клапанов сердца [24]. Однако в последнее время большинство исследований демонстрируют дестабилизирующее действие SDS на матрикс. По данным V. Samouillan с соавт. (1999) SDS дестабилизирует тройной спиральный домен коллагена и вызывает набухание сетчатой структуры эластина, разрушая таким образом ЭЦМ [25]. После обработки клапанов SDS изменяются их биофизические свойства: повышается растяжимость, изменяется форма кривой эластиновой и коллагеновой фаз при тесте растяжение-сдавление [26]. Кроме того, после совмещения обработанных SDS створок клапана с человеческими ЭК или миофибробластами происходит массивный лизис клеток спустя 24 ч после культивирования [27]. Интересно, что при использовании SDS для создания бесклеточных матриц сосудов многие исследователи отмечают удовлетворительные механические характеристики, хорошие результаты по удалению клеток и сохранению структуры ЭЦМ [28].

Использование гипо- и гипертонических растворов сравнительно эффективно удаляет интактные клеточные элементы, однако при последующем исследовании с антителами к главному комплексу гистосовместимости (MHC) определяется положительная реакция, которая коррелирует с интенсивностью инфильтрации матрикса Т-клетками in vivo [29]. Очевидно, что водные гипо- и гипертонические растворы не способны элиминировать связанные с мембранами антигены МНС после осмотического лизиса клеток. Однако такая относительно мягкая техника децеллюляризации характеризуется более полным сохранением структур ЭЦМ.

Множество исследований посвящены децеллюляризации на основе протоколов с использованием трипсина. Практически во всех работах авторы сообщают о массивной деструкции коллагеновых и эластиновых компонентов ЭЦМ клапана, что коррелирует с его ранней кальцификацией и сказывается на длительности «службы» клапана [27, 29–31]. Кроме того, использование трипсина негативно влияет на репопуляцию клапана клетками хозяина как in vitro, так и in vivo. В принципе, деструктивный эффект этого протокола децеллюляризации вполне закономерен: коллаген типа I составляет большую часть коллагена клапанов сердца [32], и, как минимум в своей денатурированной форме, коллаген является субстратом трипсина. Кроме того, трипсин разрушает нефибриллярные белки, гликозаминогликаны и протеогликаны. Потеря гликозаминогликанов ведет к потере тургора тканей [33]. Использование энзиматического метода децеллюляризации демонстрирует худшие результаты, чем применение детергентов, поскольку может вызывать полную деструкцию матрикса и неудовлетворительные механические свойства графта [34]. Таким образом, дальнейшее применение трипсина для децеллюляризации требует доработки и оптимизации подобных протоколов.

Тритон Х-100 (октилфенилполиоксиэтилен) – неионный детергент, используемый в биохимических реакциях как вещество для солюбилизации мембран. Структура тритона Х-100 очень похожа на структуру IGEPAL CA630, и эти два названия часто используются как синонимы. Однако молекула тритона обладает более выраженными гидрофильными свойствами, поэтому для многих реакций они не являются взаимозаменяемыми. Тритон Х-100 является детергентом выбора, так как обладает способностью мягко солюбилизировать мембраны клеток без денатурирующей активности. Для децеллюляризации используется 0,5% или 1% раствор.

Исследования эффективности децеллюляризации тритоном Х-100 и его влияния на структуру и свойства матрикса многочисленны и во многом противоречивы. Китайские коллеги сообщают, что им удалось достичь полной децеллюляризации при использовании тритона, однако наблюдалось серьезное изменение механических свойств по сравнению с необработанными клапанами и даже по сравнению с обработанными трипсином [35]. Также тритон Х-100 может способствовать обеднению губчатого слоя створок клапана, что вызывает биодеградацию ЭЦМ, повреждение складчатой структуры коллагена и повышает пористость матрикса, изменяя механические свойства и прогноз длительности работы [36]. Однако результаты исследований in vivo свидетельствуют о полном удалении клеточного дебриса, антигенов МНС и, как следствие, снижение иммуногенности обработанных тритоном тканей [29], а исследования D.W. Cortman с соавт. (1995) сообщают о противоположных описанным выше результатах, а именно о сохранении биомеханических свойств тканей, обработанных по данному протоколу [37]. Использование тритона Х-100 в комбинации с SDS позволяет получить матрикс, полностью свободный от клеток и клеточного дебриса, пригодный для заселения клетками человека. При этом отмечается удовлетворительный рост и жизнеспособность миофибробластов и ЭК, а также синтез миофибробластами коллагеновых волокон, которые далее включаются в структуру матрикса [27].

Деоксихолат натрия (SDC) – производное желчных кислот – образуется из холиевых кислот в кишечнике при помощи энзимов кишечных бактерий. Менее половины дезоксихолиевых производных далее всасываются в кишечнике и возвращаются в печень, где проходят процесс конъюгации и поступают в желчный пузырь. В биохимических производствах применяется как водорастворимый ионный детергент, используемый для лизиса клеточных мембран [38]. В последнее десятилетие появилось большое количество протоколов, сообщающих об успешном применении этого детергента для производства бесклеточных матриксов. Впервые деоксихолат натрия применил в практике C. Booth c соавт. (2002). Авторы сообщали о применении комбинации 0,03–1% SDS и 0,5–2% деоксихолиевой кислоты как успешной технике децеллюляризации свиных клапанов сердца [24]. После этого на фоне сообщений о недостатках применения других детергентов использование SDC получило широкое распространение. W. Erdbrügger с соавт. (2006) успешно использовал для имплантации в эксперименте на овцах и в клиническом исследовании свиных клапанов легочной артерии после обработки их 1% дезоксихолиевой кислотой [39]. Аналогичным образом N-T. Fang et al. (2007) успешно децеллюляризировал свиной клапан аорты по протоколу, сочетающему использование дезоксихолата натрия и тритона Х-100, а затем рецеллюляризировал клапаны эндотелиальными прогениторными клетками из пупочного канатика человека [40]. Применение дезоксихолиевой кислоты выглядит перспективным также и с точки зрения влияния на механические свойства ксенографтов. Так, 4% раствор дезоксихолиевой кислоты использовался для децеллюляризации общей сонной артерии собак, при этом не наблюдалось значимых изменений в гибкости и прочности по сравнению с недецеллюляризованными образцами [41]. E. Reider с соавт. (2005) показали эффект децеллюляризации с использованием 0,05% дезоксихолата, 0,05% тритона Х-100 и 0,05% IGEPAL CA 630 на снижение миграции моноцитов к клапану in vivo и снижение иммунного ответа. Также было показано, что воспалительная реакция на децеллюляризованный человеческий клапан менее выражена, чем на ксеногенный клапан аорты, обработанный по тому же протоколу [42].

Использование в клинической практике

Последнее десятилетие стало прорывом в области тканевой инженерии клапанов сердца, что привело к первым результатам использования таких клапанов в клинической практике, в первую очередь в детской кардиохирургии. Следует отметить, что все сообщения подобного характера касаются имплантации бесклеточных матриксов, изготовленных методом децеллюляризации, или трансплантации тканеинженерных клапанов на основе тех же матриксов, совмещенных с клетками.

Широко известная американская компания CryoLife® в 2000 г. начала выпуск децеллюляризированных свиных клапанов аорты под маркой «SynerGraft». Эти клапаны прошли экспериментальную апробацию на овцах в течение года, гидродинамические и иммунологические исследования [43]. Технология изготовления этих клапанов включала множественные циклы заморозки-оттаивания, лизис клеток применением осмотической децеллюляризации, использование ДНК-азы и пролонгированной экстракции водными растворами. Через несколько месяцев появились сообщения о плохом самочувствии детей, получивших этот продукт в качестве имплантата, а через 2 года вышла статья с анализом ситуации. В ней сообщалось, что 1 пациент семи лет умер через 7 сут. после операции, 1 девятилетний пациент умер спустя 6 мес. после операции, еще 1 ребенок умер через год. Причиной смерти послужили клапан-ассоциированные осложнения в виде разрывов створок, воспалительных изменений и стенозов. 1 ребенку потребовалась реоперация спустя двое сут. после первичной операции. На всех клапанах наблюдались воспалительные изменения, фиброз, инкапсуляции, перфорации и износ створок [44]. До конца причины развившихся осложнений остались неясными, но, вероятно, виной всему послужил далекий от оптимального протокол децеллюляризации.

Несмотря на такую громкую неудачу, попытки внедрить метод децеллюляризации продолжались и позже, уже более успешно. В 2005 г. P.M. Dohmen и W. Konertz опубликовали результаты двухлетних наблюдений за пациентами (n = 50, возраст от 17 до 70 лет), перенесшими имплантацию графтов [45, 46]. Согласно результатам исследования, 1 пациент умер в послеоперационном периоде, двоим потребовалась реоперация в связи с клапанассоциированными осложнениями. Состояние остальных пациентов сообщалось как удовлетворительное. Те же исследователи в 2006 г. сообщают уже о 226 прооперированных пациентах, получивших децеллюляризированный ксенографт. Смертность составила 2,7%, из которых всего 5 случаев связаны с клапанными осложнениями (протезный эндокардит), состояние остальных пациентов опасений не вызывало [47].

F.D. Da Costa c соавт. (2005) сообщили об 11 успешно выполненных операциях Росса с использованием децеллюляризованных аллографтов, изготовленных по оригинальной технологии AutoTissue, при этом летальных случаев не отмечалось, 1 пациент реоперирован по поводу кровотечения [48]. У всех пациентов исследовался уровень anti-HLA антител класса I и II, лишь у двоих он был повышен, в то время как у всех пациентов, получивших классический криоконсервированный гомографт, было выявлено выраженное повышение таких антител. Протокол децеллюляризации клапанов является интеллектуальной собственностью компании и засекречен.

В целом, положительные результаты клинического применения децеллюляризованных ксено- и аллографтов вселяют надежду на дальнейшее развитие данного направления в тканевой инженерии и совершенствование протоколов децеллюляризации клапанов сердца, которое позволит более широко использовать материал в лечении пациентов кардиологического профиля.

Заключение

Таким образом, тканеинженерные разработки в части создания клапанов сердца нацелены на получение функционального бесклеточного матрикса с использованием оптимальных протоколов децеллюляризации и его совмещение с ЭК и ИК с получением графта, способного к регенерации и росту и обладающего структурными и биомеханическими свойствами, соответствующими нативному клапану сердца. Однако наличие большого количества протоколов децеллюляризации свидетельствует об отсутствии универсальной оптимальной методики, минимально влияющей на ЭЦМ исходного тканевого материала. Для успешной разработки и внедрения в клиническую практику оптимальных тканеинженерных клапанов необходимо дальнейшее совершенствование протоколов децеллюляризации и накопление опыта исследований in vivo.

Подняться вверх сайта