Поиск Кабинет

Тканеинженерная конструкция на основе мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани, полилактидных носителей и тромбоцитарного геля

Гены & Клетки: Том VIII, №4, 2013 год, стр.: 61-69

 

Авторы

Бухарова Т.Б. , Волков А.В., Антонов Е.Н., Вихрова Е.Б, Попова А.В., Попов В.К., Гольдштейн Д.В.

ДЛЯ ТОГО ЧТОБЫ СКАЧАТЬ СТАТЬЮ В ФОРМАТЕ PDF ВАМ НЕОБХОДИМО АВТОРИЗОВАТЬСЯ, ЛИБО ЗАРЕГИСТРИРОВАТЬСЯ

Показана эффективность применения тканеинженерной конструкции для восстановления костной ткани, полученной на основе мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани, преддифференцированных в остеогенном направлении, полилактидных носителей, полученных методом поверхностно-селективного лазерного спекания, и тромбоцитарного геля, на модели гетеротопического остеогенеза у крыс.

Одним из наиболее перспективных подходов для обеспечения регенерации костной ткани при лечении таких заболеваний, как неконсолидирующиеся переломы, обширные костные дефекты, пороки развития, является трансплантация в область костного дефекта тканеинженерных конструкций на основе собственных остеопрогениторных клеток пациента. Ключевыми задачами при разработке стратегий тканевой инженерии костной ткани являются выбор клеточных культур с высоким остеогенным потенциалом, получение носителей для иммобилизации клеток, их адресной доставки в зону костного дефекта и повышения выживаемости при трансплантации, а также включение в состав конструкции биологически активных факторов для создания оптимального микроокружения[1, 2].

В настоящее время одной из наиболее привлекательных культур для целей тканевой инженерии являются мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки (ММСК), полученные из жировой ткани (ЖТ). Как и ММСК из других источников (костного мозга, пуповины, пульпы зуба), эта культура характеризуется высокой пролиферативной активностью

и обладает выраженным остеогенным потенциалом[3, 4]. Преимуществами использования культур клеток из выбранного источника (жировой ткани) являются невысокая инвазивность процедуры забора ткани (путем липоаспирации), большое количество первичного материала, сравнительно более высокая концентрация в нем ММСК, по сравнению с фракцией мононуклеаров костного мозга[5], а также более высокий ангиогенный потенциал культур ММСК ЖТ по сравнению с культурами из костного мозга[6].

К числу наиболее перспективных материалов для получения матриксов-носителей тканеинженерных конструкций (ТИК) относятся синтетические полимеры на основе эфиров органических кислот – молочной, гликолевой и др. Для получения трехмерной пористой структуры могут быть использованы различные методы, одним из которых является поверхностно-селективное лазерное спекание. Метод позволяет на основе данных компьютерной томографии костного дефекта создать трехмерную компьютерную модель и затем послойно изготовить ее трехмерную копию. Таким образом, изготавливаемая матрица в точности соответствует геометрии восстанавливаемого дефекта, что при трансплантации обеспечит интеграцию трансплантата. Геометрия укладки материала внутри слоя и толщина слоев задаются с помощью программного обеспечения, что позволяет сформировать внутри матриц требуемую структуру и обеспечивает высокую воспроизводимость заданных параметров.

Для оценки эффективности применения ТИК для регенерации костной ткани используют различные экспериментальные модели остеогенеза, в том числе трансплантацию конструкции на основе клеток человека иммунодефицитным животным. Однако такие модели не всегда дают адекватные результаты, поскольку в отсутствие Т- и В-лимфоцитов, непосредственных участников иммунного ответа, не может быть оценено перекрестное взаимодействие трансплантированных донорских ММСК и иммунных клеток реципиента, что играет ключевую роль в определении успешности ММСК-опосредованной костной регенерации[7]. В настоящей работе исследование неоостеогенеза и оценку эффективности ТИК проводили на модели гетеротопического остеогенеза у крыс при внутримышечной трансплантации конструкции на основе аутологичного клеточного материала. Целью работы являлось получение, характеристика и обоснование применения тканеинженерной конструкции на основе ММСК ЖТ, биорезорбируемых полилактидных носителей, полученных методом поверхностно-селективного лазерного спекания, и тромбоцитарного геля для регенерации костной ткани.

Материал и методы

Культуру ММСК ЖТ человека выделяли из липоаспирата, полученного у взрослых здоровых доноров, подписавших добровольное информированное согласие. Липоаспирацию проводили по стандартной методике под местной инфильтрационной анестезией в области передней брюшной стенки. Липоаспират промывали раствором Хэнкса (ПанЭко, Россия) и дезагрегировали в растворе Версена с добавлением 0,25% трипсина (ПанЭко, Россия) при 37°С в течение 1,5 ч. Клетки осаждали центрифугированием в течение 10 мин при 1100 об/мин. Осадок разводили ростовой средой: DMEM/F12 (ПанЭко, Россия) с 10% эмбриональной телячьей сывороткой (ЭТС) (PAA, Австрия) и 0,1 мг/мл амикацина (Синтез, Россия), переносили в чашки Петри и инкубировали при стандартных культуральных условиях (температура 37°С, 5% СО2, насыщающая влажность). Плотность посева составляла 1,5–2,0 тыс. кл/см2. Ростовую среду меняли каждые 3 сут.

Для индукции остеогенной дифференцировки культуры ММСК ЖТ на 3-4 пассаже при 80% конфлуентности монослоя инкубировали 14 сут. в остеогенной среде: DMEM (ПанЭко, Россия) с 10% ЭТС, 0,1 мг/мл амикацина, 50 мг/л L-аскорбиновой кислоты (Sigma, Германия), 10 мМ/л β-глицерофосфата натрия (Sigma, Германия) и 10 нМ 1α,25дигидроксикальциферола (Roshe, Швейцария). Среду меняли каждые 3 сут.

Для получения культур ММСК ЖТ крыс у животных забирали фрагменты жировой ткани, промывали в растворе Хэнкса и перед ферментной обработкой измельчали ножницами. Дальнейшие действия по выделению, культивированию и индукции остеогенной дифференцировки проводили так же, как с культурами человека.

Матриксы-носители были изготовлены из полилактида (Poly(D,L)-lacticacid, PDL 04, Purac, Нидерланды) методом поверхностно-селективного лазерного спекания (ПСЛС)[8]. Гранулы полилактида размером ~200 мкм спекали послойно по заданной программе на установке селективного лазерного спекания СЛС-100 (ИПЛИТ РАН, Шатура). В качестве источника излучения использовали одномодовый волоконный лазер с длиной волны λ = 1,06 мкм и мощностью до 10 Вт (ИРЭ-Полюс, Россия). В качестве сенсибилизатора излучения к порошку полилактида добавляли 0,1 весовых % сферических кварцевых наночастиц со специальным покрытием, размером ~100 нм. Скорость сканирования пучка лазерного излучения по поверхности порошка составляла 20 мм/с, ширина спеченных треков ~0,8 мм. Матрицы формировали в виде дисков диаметром 12 мм и высотой 4 мм, с трехмерной ячеистой структурой (рис. 1). Размер ячеек составлял ~0,6×0,6 мм.

Матриксы-носители стерилизовали гамма облучением в дозе 2,5 мРад и промывали физиологическим раствором. Для заселения материалов клетками готовили суспензию ММСК с концентрацией 2×106 кл/мл среды, наносили по 100 мкл на образец и инкубировали в течение 1 ч для инициации прикрепления клеток к гранулам полилактида, после чего добавляли культуральную среду. Клетки на носителях культивировали при стандартных условиях, меняя ростовую среду каждые 2 сут.

Для изучения цитотоксического действия материала носителей проводили МТТ-тест. Клетки ММСК ЖТ высевали в лунки 96-луночного планшета (Nunc, Дания) в плотности 5–10 тыс. на лунку. Через сутки в лунки помещали образцы и инкубировали клетки в их присутствии 1 и 7 сут. Контролем служили лунки с клетками без образцов. Затем в лунки добавляли МТТ (ПанЭко, США) в концентрации 0,5 мг/мл и инкубировали в течение 2 ч при 37°С, визуально контролируя развитие окраски. Среду с МТТ удаляли, кристаллы формазана экстрагировали из клеток с помощью ДМСО (ПанЭко, США). Поглощение формазана оценивали, измеряя оптическую плотность элюата при длине волны 570 нм за вычетом фонового значения при 620 нм. Измерения проводили на планшетном ридере «AnthosReader 2020»(AnthosLabtec, Австрия).

Для оценки динамики пролиферации ММСК ЖТ на поверхности носителей образцы заселяли клетками и инкубировали в 24-луночных планшетах (Nunc, Дания) в течение 1, 4, и 7 сут. Затем проводили МТТ-тест.

Витальное мечение клеток проводили с помощью мембранной флуоресцентной метки PKH26 (red fluorescent cell linker kit, Sigma, США), согласно инструкции производителя. Анализ полученных образцов проводили c помощью инвертированного светового микроскопа Olуmpus CK 40 с аппаратнопрограммным комплексом Olуmpus camedia С-5050 (Olуmpus, Япония).

Для морфологической характеристики клеток, прикрепленных к полилактидным гранулам матриксов-носителей, образцы заселяли клетками и культивировали на разных сроках, после чего готовили препараты для сканирующей электронной микроскопии (СЭМ). Образцы промывали фосфатно-солевым буфером (рН 7,2–7,4; ПанЭко, Россия), фиксировали 2,5% раствором глютарового альдегида (Panreac, Испания) в течение 24 ч и обезвоживали. Для высушивания использовали гексаметилдисилазан. Образцы напыляли слоем золота (10 нм) в аппарате EikoIB 3 (Eiko, Япония). Анализ полученных препаратов проводили с помощью сканирующего электронного микроскопа S-570 (Hitachi, Япония) при ускоряющем напряжении 15 кВ.

Для получения плазмы, обогащенной тромбоцитами (platelet-richplasma, PRP), кровь донора, подписавшего добровольное информированное согласие, собирали в пробирки с ЭДТА, центрифугировали при 1100 об/мин. в течение 10 мин. Тромбоциты, содержащиеся в супернатанте, осаждали при 3600 об/мин в течение 15 мин. Осадок ресуспензировали в половине объема супернатанта. По аналогичному протоколу получали PRP крыс для проведения экс- периментального исследования.

Для получения тканеинженерной конструкции преддифференцированные в остеогенном направлении ММСК снимали с культурального пластика 0,02% раствором Версена (ПанЭко, Россия) с добавлением 0,25% раствора трипсина (ПанЭко, Россия) и центрифугировали 10 мин при 1100 об/мин. Осадок ресуспензировали в требуемом объеме PRP с получением клеточной суспензии, которую наносили на матрицы из расчета 0,5 мл/см3 образца. Для образования фибрина из содержащегося в PRP фибриногена в систему добавляли по каплям тромбин (Cormay, Польша), растворенный в 10% растворе хлорида кальция (ДальХимФарм, Россия). Полимеризация происходила в течение 3–5 мин.

Для оценки жизнеспособности клеток внутри ТИК в условиях in vitro конструкции, содержащие 1, 4 и 7 млн. кл/см3 ТИК, после сборки инкубировали в ростовой среде при стандартных условиях в течение 7 сут., меняя среду каждые 2 сут. Затем фибрин деполимеризовали с помощью фибринолизина (Биофарма, Украина). Прикрепившиеся к носителю клетки снимали с помощью раствора Версена с добавлением 0,25% трипсина. Клетки в суспензии окрашивали 0,4% раствором трипанового синего (ПанЭко, Германия). в течение 5 мин. Долю жизнеспособных клеток определяли путем подсчета количества неокрашенных клеток в камере Горяева (МиниМед, Россия).

Оценку эффективности ТИК проводили на модели гетеротопического остеогенеза при внутримышечном введении крысам. Содержание и использование лабораторных животных соответствовало правилам, принятым в Российской Федерации, рекомендациям локального этического комитета и национальным законам[9]. В работе использовали половозрелых самцов крыс аутбредной линии Sprague-Dawley (SD), весом 500–600 г. Конструкции изготавливали на основе аутологичных клеток животных и тромбоцитарного геля по вышеописанной методике. В качестве контроля использовали носители с тромбоцитарным гелем без клеток. Операции проводили под внутримышечным комбинированным медикаментозным наркозом (золетил/ рометар). Материалы вводили в межфасциальное пространство сгибательной группы бедренных мышц. На задней поверхности бедра крысы удаляли шерсть и производили продольный разрез длиной 1 см. Тупым способом в толще мышц сгибательной группы формировали карман, куда помещали образец. Рану послойно ушивали. Наркоз и операцию, длившуюся 10 мин, все животные переносили удовлетворительно, без ранних и поздних осложнений. Животных выводили из эксперимента на 30 сут. наблюдения путем передозировки эфирного наркоза (n = 6 в каждой группе).

Выделенные образцы тканей помещали в 10% раствор формалина на фосфатном буфере (pH 7,2; БиоВитрум, Россия), промывали в проточной воде и проводили декальцинирование в смеси 4% растворов муравьиной и соляной кислот (ХимМед, Россия). Заливку фрагментов полученных тканей в парафин (Биовитрум, Россия), и изготовление серийных срезов проводили по стандартной методике. Cрезы окрашивали гематоксилином и эозином по Бокку, Майеру (BioOptica, Италия) и по Масону – Голднеру (BioOptica, Италия). Препараты исследовали с помощью микроскопа Leica DM 2500 с фотокамерой Leica DTC 295.

Результаты

Получены культуры ММСК ЖТ человека и крыс, которые при инкубации в остеогенной среде, содержащей 1α,25-дигидроксикальциферол, дифференцировались в остеогенном направлении (рис. 2).

Полилактидные матриксы-носители, полученные методом ПСЛС, были протестированы на цитотоксичность, способность к поддержанию клеточной адгезии и пролиферации культур ММСК ЖТ человека. Данные МТТ-теста, проведенного после 1 и 7 сут. инкубации клеток в присутствии носителей, не выявили статистически значимых различий между экспериментальными группами и контролем, что свидетельствовало об отсутствии цитотоксического действия образцов в отношении исследуемых куль- тур ММСК ЖТ (рис. 3).

С помощью витального флуоресцентного мембранного красителя PKH26 наблюдали, что после заселения носителей клетки ММСК ЖТ прикреплялись к поверхности гранул материала (рис. 4). Адгезия клеток к поверхности носителя наблюдалась как минимум в течение 3 нед. По микрофотографиям также можно судить о значительном увеличении числа клеток, т.е. об их пролиферации на поверхности носителя.

Более детально изучить клеточную адгезию и морфологию прикрепленных клеток позволяет электронная микроскопия. В первые сутки после заселения на поверхности полилактидных гранул наблюдались, главным образом, одиночные клетки вытянутой формы (рис. 5А). На 4 сут. культивиро- вания обнаруживались скопления плотно расположенных клеток, многие из которых прикреплялись своими отростками к соседним гранулам (рис. 5Б). Отдельные клетки имели шаровидную форму, что может свидетельствовать о вхождении клеток в митоз. К 7 сут. клетки на поверхности носителей образовывали плотные многослойные структуры (рис. 5В).

Оценка динамики пролиферации ММСК ЖТ на полилактидных носителях, проведенная с помощью МТТ-теста, показала статистически значимое увеличение количества клеток, адгезированных на поверхности носителя при культивировании в течение 7 сут. (рис. 6). Результаты теста согласуются с данными электронной микроскопии.

При исследовании жизнеспособности клеток внутри ТИК было показано, что гибель клеток, взятых в концентрации не более 4 млн на 1 см3 конструкции составила около 6%, что характеризует высокую выживаемость (рис. 7). Концентрация клеток 7 млн. приводила к заметной гибели клеток (около 18%), что в 3 раза превышала значения для предыдущей точки.

Разработанная ТИК представляет собой пористый полилактидный носитель, внутри которого заключены преддифференцированные в остеогенном направлении ММСК ЖТ в тромбоцитарном геле. 1 см3 ТИК содержал 4×106 клеток. Выживаемость клеток при культивировании in vitro составляла 94% в течение 7 сут.

При морфологическом исследовании образцов ткани из области введения носителя с тромбоцитарным гелем (контрольная группа) на 30 сут. пространство между гранулами материала было заполнено соединительной тканью с высокой плотностью расположения клеток (рис. 8А, Б). Полилактидные гранулы выявлялись как оптически «пустые» участки характерной округлой формы. Преимущественно обнаруживались клетки веретеновидной формы, расположенные по ходу тонких волокон. Наблюдалась инфильтрация лимфо- и плазмоцитами. Со- единительная ткань вокруг гранул при окрашивании по Масону – Голднеру красно-малинового цвета, что свидетельствует о пропитывании ткани молекулами молочной кислоты. На поверхности гранул находи- лись гигантские многоядерные клетки инородных тел, содержащие до 30–50 ядер. Сосуды полнокров- ные, выражена капиллярная сеть. Местами незначи- тельная отечность.

При исследовании образцов экспериментальной группы через 30 сут после трансплантации ТИК между гранулами материала обнаруживались участки формирующейся костной ткани с центрально расположенным капилляром и структурированным межклеточным веществом (рис. 8 В, Г). Выявлялись остеобласты с гиперхромным ядром и ядрышками и остеоциты. По периферии гранул материала визуализировались гигантские многоядерные клетки инородных тел. Местами вокруг гранул формировалась тонкая соединительнотканная капсула с 1–2 рядами фибробластов. В участках, свободных от клеточного матрикса, наблюдалась инфильтрация лимфо- и плазмоцитами. Местами, главным образом по периферии конструкции, выявлялась рыхлая волокнистая соединительная ткань, местами отечная, с сосудами артериального и венозного типа различного диаметра. Незначительно выражена воспалительная реакция с преобладанием плазмоцитов. В свою очередь, новообразованная костная ткань местами заполняла все пространство между гранулами материала.

Обсуждение

Для получения тканеинженерных конструкций были выделены культуры ММСК ЖТ человека и крыс. Во многих работах было показано, что для успешной стимуляции костной регенерации с помощью ММСК ЖТ необходима их предварительная дифференцировка in vitro в остеогенном направлении[4, 10, 11]. Трансплантация недифференцированных ММСК ЖТ даже непосредственно в область костного дефекта, по данным некоторых авторов, приводит к адипогенезу[12]. В работе мы использовали 1α,25-дигидроксикальциферол (активную форму витамина D3) в качестве основного индуктора остеогенной дифференцировки, эффективность которого была нами показана ранее[13].

Оценка биосовместимости матриксов-носителей является важным и необходимым этапом при разработке стратегий в рамках тканевой инженерии, определяющим эффективность применения данных технологий. В работе было проведено подробное тестирование цитосовместимости матриксов-носителей из полилактида, полученных методом ПСЛС, в условиях in vitro. Было показано, что носители не оказывают токсического действия на ММСК ЖТ, обеспечивают адгезию исследуемых клеток на своей поверхности в течение 3 недель, а также поддерживают пролиферативную активность культур. При внутримышечной имплантации носителей наблюдалась незначительная воспалительная реакция, резорбция материала макрофагами. Вокруг гранул полилактида формировалась тонкая соединительнотканная капсу- ла, что свидетельствует о достаточной биосовместимости материала.

Для иммобилизации клеток на носителе использовали тромбоцитарный гель, получаемый путем активации тромбоцитов в присутствии тромбина и кальция[14, 15]. Высвобождение из α-гранул тромбоцитов факторов роста (PDGF, VEGF, EGF, TGF-β и др.) приводит к стимуляции ангиогенеза, хемотаксиса, митотической и метаболической активности клеток, участвующих в регенерации[16]. Образованный фибриновый сверток, как и в случае формирования гематомы при естественной репарации, служит субстратом для формирования грануляционной ткани.

При внутримышечной трансплантации разработанных ТИК на основе аутогенных ММСК ЖТ крысам на 30 сут. в области введения выявлялись очаги формирования ретикуло-фиброзной костной ткани, т.е. наблюдался гетеротопический неоостеогенез – образование костной ткани de novo. Поскольку в выбранной экспериментальной модели трансплантат являлся единственным источником остеогенеза, можно заключить, что новообразованная костная ткань сформировалась за счет трансплантированных клеток. Таким образом, в работе показано, что раз- работанная тканеинженерная конструкция обладает высоким остеогенным потенциалом и не вызывает выраженных воспалительных реакций.

Подняться вверх сайта