Поиск Кабинет

Тенденции в конструировании тканеинженерных систем для остеопластики

Гены & Клетки: Том III, №1, 2008 год, стр.: 62-69

 

Авторы

Десятниченко К.С., Курдюмов С.Г.

ДЛЯ ТОГО ЧТОБЫ СКАЧАТЬ СТАТЬЮ В ФОРМАТЕ PDF ВАМ НЕОБХОДИМО АВТОРИЗОВАТЬСЯ, ЛИБО ЗАРЕГИСТРИРОВАТЬСЯ

В работе изложены основные требования, предъявляемые к материалам, предназначенным для возмещения дефектов костей, а также подходы при выборе источников и технологических приемов при их индустриальном производстве. Приведены данные об апробации в эксперименте остеопластических материалов серии ИНДОСТ, разработанных в соответствии с этими критериями.

Остеопластические материалы, представляющие собой композиции ортофосфатов кальция, коллагена, полисахаридов и других биополимеров, широко используются в стоматологии, челюстно-лицевой и восстановительной хирургии [1-3]. В ортопедии и травматологии они все чаще составляют альтернативу дистракционному остеосинтезу [4, 5]. После имплантации в костный дефект эти материалы способствуют репаративной регенерации окружающей ткани, собственно говоря, организуют ее, полностью деградируя, как бы выполняя роль строительных лесов. За эти свойства подобные материалы и методы их применения были названы, используя кальку с английского термина, соответственно скаффолд-материалами (или просто скаффолдами) и скаффолд-технологиями. Медицинское материаловедение в части разработки таких материалов активно развивается, в соответствии с чем рынок практически ежегодно озвучиваются новые названия [6-8], что создает определенные трудности у практикующего врача при их выборе.

Между тем, давно сформулированы важнейшие свойства, которыми должны обладать остеопластические материалы, предназначенные для имплантации в костный дефект: 1) биосовместимость - хорошая переносимость тканями и отсутствие реакций отторжения и воспаления; 2) биодеградация - по выполнении своей функции они должны быть полностью удалены посредством галистереза и клеточной резорбции; 3) остеоиндуктивность - способность возбуждать остеогенез в месте имплантации материала; 4) пористость, обеспечивающая проникновение клеток и сигнальных молекул, прорастание кости; 5) возможность стерилизации без изменения качеств; 6) доступность и низкая цена [9, 10].

Применяемые в настоящее время скаффолд-материалы принадлежат к различным классам химических соединений, среди которых органические и минеральные вещества, синтетические [полилактат и полигликолат) и биогенные [хитозан, альгинат, коллаген, гетерополисахариды) полимеры [1-3]. Представляется очевидным, что пунктам 1 и 2 наиболее соответствуют соединения, являющиеся естественными составляющими костной ткани: кристаллический и аморфный ортофосфаты кальция, коллаген I типа, хондроитинсульфат. Эти соединения не вызывают изменения кислотно-щелочного баланса в месте имплантации, иммунной, аллергической, воспалительной реакции и наиболее часто используются как компоненты материалов, создаваемых за рубежом («Geistlich», Швейцария; «Merk» Германия; «Bioteck», Италия и др.) и в России [НПО «ПОЛИСТОМ», «Конектфарм», «Интермедапа-тит» и др.).

Однако известно, что ни коллаген, ни гидроксиапатит не обладают прямым остеоиндуцирующим эффектом [9, 10]. Для осуществления этой функции они вначале должны привлечь и удержать циркулирующие в крови остеиндуци-рующие вещества и мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки (ММСК), способные к остеогенной диф-ференцировке. Если развить сравнение, давшее название таким материалам, - это строительные леса, на которых еще нет ни рабочих, ни инструмента [рис. 1).

Работа по совершенствованию этих компонентов остео-пластических материалов направлена, главным образом, на изменение их сорбционных свойств в отношении емкости, селективности и устойчивости к биодеградации. В отношении ортофосфатов эти задачи выполняются путем изменения их фазового и элементного состава.

Коллаген, напротив, нуждается в повышении устойчивости к деградации после имплантации в костный дефект, что может быть достигнуто повышением числа межфибрилляр-ных поперечных сшивок в предназначенном для этого материале. Главными функциями коллагена в тканеинженерных системах являются образование трехмерной объемной матрицы, доступной для заселения полипотентными клетками, и удержание этих клеток [адгезии) при посредстве неколлагеновых белков костной ткани [НБК), аффинных к коллагену и этим клеткам. Если первую из этих функций с успехом могут выполнять другие полимерные соединения - хитозан, альгинат, - то в выполнении второй - коллагену соперников нет. Поиски материалов, образующих трехмерную матрицу, пригодную для заселения пролиферирующими полипотент-ными клетками, продолжаются. Недавно в таком качестве были успешно апробированы резорбируемые полигидрокси-алканоаты [ПГА) - линейные полиэфиры бактериального происхождения [11, 12].

Естественно предположить, что введение в скаффолд-материал сигнальных молекул [факторов роста), обладающих остеоиндуцирующими свойствами, их способность возбуждать костеобразование существенно возрастет [рис. 2). При этом композиция из нескольких факторов [проявляющих свое действие в разных фазах клеточного цикла, способствующих, помимо костеобразования, ангиогенезу и гемопоэзу) предпочтительнее одного фактора, даже обладающего высокой биологической активностью. Дело за выбором таких сигнальных молекул, которые имели бы сродство к коллагену и ортофосфатам кальция, образуя с ними недиссоциирующий супрамолекулярный комплекс. Мы полагаем, что в этом отношении перспективно включение в композиции остео-пластических материалов костных рострегулирующих факторов [КРФ).

Способность деминерализованного костного матрикса к ускорению регенерации кости [к тому, что в настоящее время называют остеоиндукцией) была впервые обнаружена, по-видимому, Senn в 1889 году [цит. по 10]. Однако потребовалось почти 100 лет, чтобы выделить из костной ткани фактор белковой природы, ответственный за остеогенную активность, названный костным морфогенетическим белком [13]. Как показали последующие работы ряда исследователей в России и за рубежом, скелетные ткани являются источником целого ряда полипептидов, модулирующих функциональную активность клеток костной ткани, то есть являющихся КРФ. Они могут выступать как системные агенты и действовать через ауто/паракринные механизмы [14-17].

Понизить уровень неопределенности в области представлений о гуморальной регуляции остеогенеза стало возможным благодаря тому, что в последние два десятилетия достигнуты значительные успехи как в препаративной и аналитической химии НБК, так и в исследовании их биологических свойств. В частности, показано, что, будучи минорной фракцией зрелой компактной костной ткани [не более 3% от массы сухой обезжиренной кости, рис. 3), они представляют собой весьма гетерогенную группу. Последовательное применение нескольких процедур экстрагирования и фракционирования экстракта позволяет получить более 4 десятков НБК, отличающихся между собой по молекулярной массе, сродству к анионо- и катионообменникам, растворимости, характеру биологического действия [18]. Среди КРФ обнаружены p-трансформирующий фактор роста и относящиеся к тому же семейству цитокинов морфогенетические белки кости, факторы роста фибробластов кислый и основный, инсулиноподобные факторы роста, колониеобразующие факторы гранулоцитов и макрофагов, интерлейкины [19].

Помимо способности регулировать пролиферацию, диф-ференцировку и экспрессию тканеспецифических белков остеогенными клетками, у КРФ были обнаружены и другие свойства, важные при конструировании остеопластических материалов [20]. Во-первых, способность прочно связываться с минералом и коллагеном кости. Специфическая сорбция удерживает около 25 мг НКБ на 100 г гидроксиа-патита. Костный коллаген обладает значительно меньшей емкостью сорбции [в ~3,5 раза) при большей селективности: более 60% десорбированного с коллагенового матрикса НКБ при электрофорезе представляет собой синглетный пик в зоне р-глобулинов.

Во-вторых, привлекать полипотентные клетки в костный дефект, заполненный материалом, содержащим КРФ. В цепи событий, развивающихся при возмещении костного дефекта, важное место занимает хемотаксис - привлечение в очаг костеобразования клеток-предшественников кроветворения и остеогенеза. Способность одной из фракций НБК выполнять функцию фактора хемотаксиса была протестирована путем имплантации подкожно мышам линии СВА измельченного диссоциативно экстрагированного костного органического матрикса [контроль] и такого же матрикса, предварительно инкубированного в растворе фракции НБК [опыт]. Через 2 нед. было обнаружено, что частицы матрикса в контроле и опыте окружены клеточным валом, причем при уровне достоверности 95% в опыте на 1 мм длины окружности частицы общее количество клеток в 2 раза превосходило контроль за счет моноцитов-макрофагов и фибробластоподобных клеток при меньшей доле неизмененных и деградирующих лимфоцитов.

Вместе с тем, среди пептидных фракций, выделенных из костного матрикса, были обнаружены факторы, угнетающие репаративный остеогенез, увеличивающие исходный костный дефект за счет резорбции прилегающих к имплантированному материалу тканей, а также факторы, обладающие провоспалительным эффектом, вызывающие явления альтерации и экссудации в области имплантата, привлекающие иммунокомпетентные клетки. Это обстоятельство, на наш взгляд, компрометирует использование в качестве остеоп-ластических материалов нативной костной ткани, декаль-цинированного костного матрикса, тотальных препаратов НБК. Очевидной является необходимость предварительного препарирования на молекулярном уровне исходного продукта - источника КРФ, включаемого в остеопластические материалы.

На рис. 4 приведены доводы pro et contra при выборе таких источников в плане вышеизложенных требований при организации промышленного производства остеопласти-ческих материалов. Понятно, что в настоящее время эта альтернатива решается в пользу ксеногенной кости - костной ткани крупного рогатого скота, получаемой на предприятиях пищевой промышленности с соблюдением всех санитарных требований. Однако необходимо минимизировать ее основной недостаток, что может быть достигнуто удалением на подготовительных этапах подавляющей части НБК, обладающих антигенными свойствами, но не влияющих [или препятствующих] на остеоиндуцирующую способность [рис. 5]. В условиях современного производства медицинских материалов это вполне достижимо при использовании различных модификаций методов препаративной химии белков.

Используя изложенные в настоящем сообщении теоретические положения и технические подходы, в Научно-производственном объединении «ПОЛИСТОМ» была разработана и запущена в производство серия остеопластических материалов с общим названием ИНДОСТ [7], которые представляют собой варианты уже выпускавшихся композиций гетерофазного фосфата кальция и коллагена I типа [2], модифицированных включением в их состав комплекса КРФ, выделенного из костной ткани крупного рогатого скота. Формы этих материалов, предназначенные для выполнения различных клинических задач, различны: гранулы, губка, пластины, гель.

Материалы ИНДОСТ прошли испытания на цитотоксичность in vtro с использованием первичной культуры фиб-робластов человека, которые были выделены из кожномышечной ткани эмбриона на сроке 6 нед. С этой целью водная вытяжка из материала ИНДОСТ-пластины [или физиологический раствор в контроле) была добавлена в лунки планшета, в которые перед этим на сутки были высеяны клетки [плотность посева 35 тыс/см2). Для оценки влияния на жизнеспособность использовали МТТ-тест, основанный на реакции восстановления желтого метилтетразолиумтет-рабромида (МТТ) до пурпурного формазана в результате жизнедеятельности [дыхательной активности) клеток.

Клетки культивировали в среде ДМЕМ с добавлением 10% эмбриональной коровьей сыворотки и 100 Ед/мл пенициллин/стрептомицина в атмосфере 5% С02 Для визуализации клеток и оценки их жизнеспособности использовали метод окрашивания 0,0002% раствором акридинового оранжевого в фосфатном буфере.

Проводили также апробацию нового материала в экспериментах по возмещению дефектов костей - плоских [ветвь нижней челюсти) или трубчатых [бедренная, большеберцовая), дырчатых [транскортикальная перфорация диаметром 2 мм) или тотальных [резекция диафиза в средней трети с диастазом между отломками 2-3 мм), у лабораторных животных [крыс линии Вистар) при соблюдении норм содержания, вмешательства и выведения из опыта. На этапах экспериментов проводили морфологические исследования новообразованной ткани в месте имплантации испытуемого материала, некоторые результаты которых мы приводим для иллюстрации основных положений настоящего сообщения.

При испытаниях in vitro было обнаружено, что при культивировании фибробластов на материале ИНДОСТ-пластины, последний: а) не содержит водорастворимых компонентов, отрицательно влияющих на жизнеспособность клеток, б) является адгезивным для фибробластов кожи человека, клетки распластываются на поверхности ИНДОСТа. Вместе с тем, на поверхности материала после культивирования в течение 24 ч не отмечалось видимого увеличения количества клеток по сравнению с моментом посева, что, вероятно, связано с миграцией клеток либо с поверхности материала, либо в поры материала.

В экспериментах in vivo клеточным источником репара-тивного остеогенеза во всех наблюдениях была хорошо вас-куляризованная грануляционная ткань в месте имплантации ИНДОСТа [рис. 6). Реакция со стороны костного ложа была выражена в умеренной остеокластической резорбции, что способствовало интеграции старой и новообразованной ткани [рис. 7). Резорбция, однако, могла быть и резко выраженной, сопровождаться всеми признаками асептического воспаления, если в композицию НБК включали фракцию со свойствами монокина [21].

Свидетельства остеогенной дифференцировки в виде сети молодых костных балок были выявлены не позже, чем через две недели после создания дефекта и заполнения его остеопластическим материалом [рис. 8 а, б), тогда как в контроле, как правило, дефект был заполнен хрящевой тканью [рис. 9). В итоге к концу срока наблюдения [60-75 сут.) дефект в опыте был заполнен костной тканью, завершившей ремоделирование, о чем, в частности, свидетельствовала высокая степень зрелости коллагеновых волокон органического матрикса [рис. 10 а, б), тогда как в контроле продолжалась адаптивная перестройка новообразованной костной ткани [рис. 11).

Скорость биодеградации имплантированного материала зависела от состава и дисперсности его минеральной составляющей: при использовании частиц размером ~100 мкм при соотношении гидроксиапатит-трикальций фосфат 7:3 его базофильно окрашиваемые фрагменты могли быть обнаружены через 30 сут. после имплантации [рис. 13), тогда как нанодисперсный минерал [ГА-ТКФ 5:5), взвешенный в коллоидной матрице, не определялся уже через 10 сут после его имплантации в дырчатый дефект [рис. 12). Через 2-2,5 месяца после имплантации частицы ИНДОСТа не были обнаружены, в какой бы физической форме он ни использовался.

Таким образом, в настоящее время имеются теоретически обоснованные и технически осуществимые возможности создания новых тканеинженерных систем для остеопластики с повышенной способностью возбуждать репаративный остеогенез при имплантации в костный дефект. Освоено производство таких систем в виде материалов с различными физическими свойствами, обеспечивающими возможность возмещения врожденных и приобретенных дефектов трубчатых и плоских костей.

Авторы выражают благодарность проф. НА Слесаренко, профессору А.С. Григорьяну и с.н.с. И.И. Селезневой за помощь в выполнении и интерпретации результатов морфологических исследований при экспериментальной апробации остеопластических материалов.

Подняться вверх сайта