Поиск Кабинет

Свойства тканеинженерных матриц из поликапролактона, импрегнированных ростовыми факторами VEGF и bFGF

Гены & Клетки: Том VII, №4, 2012 год, стр.: 62-67

 

Авторы

Севостьянова В.В., Elgudin Y.L., Wnek G.E., Lubysheva T., Emancipator S., Головкин А.С., Барбараш Л.С.

ДЛЯ ТОГО ЧТОБЫ СКАЧАТЬ СТАТЬЮ В ФОРМАТЕ PDF ВАМ НЕОБХОДИМО АВТОРИЗОВАТЬСЯ, ЛИБО ЗАРЕГИСТРИРОВАТЬСЯ

Современный подход в создании сосудистых кондуитов малого диаметра для применения в шунтирующих операциях заключается в их «выращивании» in vivo с использованием тканеинженерных биодеградируемых полимерных матриксов. В работе оценивается возможность использования графтов, созданных методом двухфазного электроспиннинга из поликапролактона с включением в их состав VEGF и bFGF. Матриксы оценивали на изменение физико-механических и биологических свойств, после введения в полимер ростовых факторов. Было обнаружено увеличение прочности полимерных матриксов, после их импрегнации VEGF и bFGF. Пролонгированный выход биомолекул из материала в сроки до трех недель был продемонстрирован с помощью иммуноферментного анализа. Результаты подкожной имплантации изучаемых матриксов крысам популяции Wistar подтвердили сохранение биологической активности VEGF и bFGF после их выхода в окружающие ткани. Таким образом, исследование показало возможность использования PCL матриксов с VEGF и bFGF для создания сосудистых тканеинженерных графтов малого диаметра.

В настоящее время основным методом хирургического лечения заболеваний, связанных с окклюзией коронарных и периферических артерий, является проведение шунтирующих операций. Для таких реконструкций принято использовать аутогенные вены и артерии в качестве наиболее доступных сосудистых графтов малого диаметра (менее 6 мм). Однако более 30% пациентов не обладают подходящими для трансплантации сосудами из-за уже перенесенных операций, либо других заболеваний [1]. Кроме того, использование аутогенных вен и артерий в большинстве случаев приводит к повторным операциям, связанным с деструктивными изменениями и закупоркой сосудов, использованных в качестве шунтов, через 4–5 лет [2]. В этой связи, в современной сердечно-сосудистой хирургии существует потребность в сосудистых кондуитах малого диаметра, обладающих хорошей проходимостью и долговечностью.

Современные тканеинженерные подходы к созданию элементов сердечно-сосудистой системы направлены на получение биологических кондуитов, которые могли бы соответствовать функциональным особенностям кровеносного сосуда. На сегодняшний день, основным методом является «выращивание» кровеносных сосудов в биореакторе из аутогенных клеток человека на природных, либо синтетических матриксах [3]. Исследования в этой области уже продемонстрировали многообещающие результаты [4]. Но, тем не менее, в данном направлении остается ряд проблем, обусловленных сложностью получения необходимого количества аутогенных клеток, длительностью и эффективностью совмещения клеток и матрикса, а также опасностью иммуной реакции организма при использовании аллогенных клеточных культур.

В связи с этим начало развиваться альтернативное направление тканевой инженерии, основанное на выращивании органа in vivo, то есть непосредственно в организме пациента. Этот подход отражает идею создания органа за счет имплантации в организм тканеинженерных биодеградируемых матриксов, импрегнированных биологическими молекулами, либо лекарственными средствами для улучшения регенерации [5]. При этом матрикс является не только каркасом будущего органа, но также и системой доставки необходимых веществ [6–8].

Основываясь на данном подходе, задача по созданию сосудистых кондуитов может быть решена с помощью биосовместимых полимерных матриксов с оптимальными механическими свойствами. Одним из таких полимеров является поликапролактон (polycaprolactone, PCL) – биорезистентный синтетический материал, обладающий необходимыми прочностью и эластичностью, а также длительным периодом биодеградации с образованием нетоксичных продуктов [8, 10]. Графт из PCL может быть имплантирован в кровеносное русло, выполняя на начальном этапе роль протеза. Предполагается, что со временем графт будет заселяться клетками организма, а материал полимера в это же время будет постепенно деградировать, замещаясь межклеточным веществом, синтезируемым клетками. Возможно, импрегнирование матрикса биологическими молекулами, например факторами роста, будет способствовать быстрому формированию кровеносного сосуда.

Хотя процесс восстановления сосудов до конца не изучен, известно, что важная роль в нем отведена сосудистому эндотелиальному фактору роста (vascular endothelial growth factor, VEGF), а также фактору роста фибробластов (basic fibroblast growth factor beta, bFGF). Эти два цитокина крайне важны для активации миграции и пролиферации эндотелиальных клеток, а также для стимуляции и регуляции ангиогенеза [11, 12].

Важная роль этих цитокинов для тканевой инженерии показана как в экспериментах in vitro, так и in vivo. J.L. Sharon и D.A. Puleo (2008) продемонстрировали увеличение пролиферации эндотелиальных клеток на поверхности PLGA (poly(lactidecoglycolide) матриксов, модифицированных VEGF в экспериментах in vitro [13]. Q. Sun с соавт. (2005) имплантировали PLGA матриксы, содержащие VEGF, в область смоделированной ишемии нижних конечностей у мышей. Пролонгированная доставка VEGF с использованием полимерной системы из PLGA привела к улучшению перфузии тканей, увеличению плотности капилляров по сравнению с контролем [14].

Исследования матриксов из poly-(ester-urethane) urea (PEUU) с bFGF in vitro показали значительное увеличение пролиферации гладкомышечных клеток мышей на их поверхности после 7 сут. культивирования, по сравнению с PEUU матриксами без фактора роста [15]. X. Zhu с соавт. (2008) обнаружили улучшение пролиферации эндотелиальных клеток, культивированных на желатиновых микрочастицах, нагруженных bFGF, почти в два раза в течение 10 дней [11]. Также в исследовании in vivo было продемонстрировано увеличение плотности капилляров в желатиновом гидрогеле и PLGA матриксах, содержащих bFGF после их имплантации в ишемизированые нижние конечности мышей и в зоны ишемии миокарда у свиней, соответственно [16, 17].

Совместное использование VEGF и bFGF является многообещающим подходом в регуляции функций клеток при регенеративном процессе. Значительное улучшение реваскуляризации ткани было показано P. Losi с соавт. (2010) после имплантации композитных матриксов из poly(ether)urethane-poly-dimethylsiloxane-fibrin, нагруженных VEGF и bFGF, подкожно или в зоны ишемии конечностей крыс [18].

Предполагается, что включение VEGF и bFGF в структуру PCL-графта улучшит регенеративные свойства биосовместимого и биодеградируемого тканеинженерного сосудистого кондуита.

Целью настоящей работы явилась оценка физико-механических и биологических свойств тканеинженерных матриксов из PCL после их импрегнации ростовыми факторами VEGF и bFGF.

Материал и методы

В работе для изготовления тканеинженерных матриксов использовали биодеградируемый синтетический полимер – PCL (Sigma-Aldrich, США), так как он обладает оптимальными для создания сосудистого графта физико-механическими свойствами, биосовместимостью и достаточно длительным периодом деградации [19].

В качестве биологически активных молекул для интегрирования в структуру материала применяли рекомбинантные VEGF и bFGF (R&D System, США).

Изготовление «чистых» PCL матриксов и содержащих биологически активные молекулы

«Чистые» PCL матриксы изготавливали методом электроспиннинга при следующих условиях: 10% раствор PCL в хлороформе, напряжение на игле – +15 кВ, скорость потока раствора – 1мл/ч, расстояние между иглой и коллектором – 15 см.

Для создания PCL матриксов, содержащих в своей структуре факторы роста VEGF или bFGF, использовали метод двухфазного электроспиннинга. Для этого 10% раствор PCL в хлороформе тщательно смешивали с раствором каждого цитокина в фосфатно-солевом буфере в соотношении 20:1. Процесс электроспиннинга проводили при тех же условиях, что и изготовление «чистых» PCL матриксов.

Сканирующая электронная микроскопия (СЭМ)

Форму и размеры полимерных волокон, а также размеры пор полученных тканеинженерных матриксов оценивали методом СЭМ. Для этого на образцы наносили золотое токопроводящее напыление толщиной в 1 Å и затем исследовали на сканирующем электронном микроскопе 6510LV (Jeol, Япония).

Оценка физико-механических свойств матриксов

Оценку физико-механических свойств проводили в условиях продольного растяжения однотипно изготовленных тканеинженерных матриксов с помощью динамического механического анализа. Образцы (n = 8 каждой группы) в виде прямоугольных полосок со стандартной длиной рабочего сегмента вырезали из изучаемого материала ткани и помещали в зажимы анализатора DMA Q800 (TA Instruments, США). По результатам испытаний рассчитывали разрушающее напряжение при растяжении и эластичность материала.

Кинетика высвобождения биологически активных молекул из матрикса

Для оценки высвобождения факторов роста из структуры полимера в процессе его деградации, образцы PCL матриксов (1×1 см2) с инкорпорированными молекулами VEGF, либо bFGF, помещали в пробирки с фосфатно-солевым буфером (Invitrogen, США) объемом 5 мл и инкубировали при 37°С и 5% СО2. Через установленные промежутки времени (12, 24, 48 ч и далее через каждые 48 ч) в течение трех недель, из каждой пробирки отбирали по 0,5 мл раствора, содержащего биологические молекулы, и восстанавливали исходный объем свежим буфером. В собранных образцах определяли количественное содержание факторов роста с использованием наборов для иммуноферментного анализа VEGF и bFGF (R&D System, США). Измерение содержания белков проводили на планшетном спектрофотометре Synergy HT (Biotek Instruments, США).

Определение биологической активности ростовых факторов

Сохранение биоактивности молекул после высвобождения из PCL является критическим аспектом данной работы. Поэтому для определения корреляции выхода молекул с их ожидаемой биологической активностью матриксы, модифицированные VEGF или bFGF, имплантировали подкожно самцам крыс популяции Wistar (200–250 г, n = 5 в каждой группе). Животных содержали в условиях вивария при свободном доступе к пище и воде. Эксперимент выполнялся в лаборатории Cleveland VA Medical Center в соответствии с протоколом, одобренным IACUC (Institutional Animal Care and Use Committee, Cleveland VA Medical Center).

Операция осуществлялась под наркозом (30 мг/кг тиопентала натрия внутрибрюшинно). Каждой крысе в подкожные карманы имплантировались один образец (1 см2, 120 мкм) с VEGF или bFGF и один материал без факторов роста (контроль). Через 21 сут. животных выводили из эксперимента, эксплантировали введенные материалы с окружающими тканями и выполняли гистологическое исследование.

Результаты и обсуждение

Характеристика PCL матриксов

Исследование физико-механических свойств PCL матриксов продемонстрировало различия в показателях прочности и эластичности между различными группами образцов. Разрушающее напряжение для «чистых» PCL матриксов составило 1,52 МПа, а для PCL+VEGF и PCL+bFGF – 3,96 и 3,40 МПа соответственно. В свою очередь, относительное удлинение образцов «чистых» PCL матриксов было 87,8%, PCL+VEGF – 65,6%, PCL+bFGF – 88,3 % (табл.). Дисперсионный анализ полученных данных выявил, что образцы, содержащие в своем составе факторы роста, обладали большей прочностью, чем матриксы только из PCL.

Таким образом, результаты проведенного теста свидетельствовали об изменении свойств материала после введения в него белков в процессе электроспиннинга. Модификации с факторами роста обладают повышенной прочностью, что может приводить к увеличению стабильности тканеинженерных матриксов.

Изображения, полученные с помощью СЭМ, не показали существенных изменений морфологии поверхности волокон (т.е. заметных «бусин» или дефектов) в образцах с инкапсулированными белковыми молекулами по сравнению с PCL без каких-либо включений (рис. 2). Такая морфология волокон может обуславливаться тем, что диаметр водных резервуаров внутри волокна, содержащих молекулы факторов роста, меньше диаметра самого полимерного волокна. Вероятно, это происходит из-за растяжения и разрушения водных доменов в процессе электроспиннинга. Кроме того, PCL матриксы, содержащие в своей структуре VEGF или bFGF, имели диаметр полимерных волокон значительно меньший, чем матриксы из чистого PCL, изготовленные в тех же условиях. Размер PCL волокон с VEGF составил 0,418±0,262mμ, а с bFGF – 0,536±0,276mμ, в свою очередь волокна полимера без факторов роста были толщиной 3,340±0,510mμ.

Значительное снижение диаметра волокна может быть причиной увеличения проводимости и диэлектрической проницаемости из-за наличия солей и воды в растворе полимера. В электроспиннинге формирование, растяжение и истончение полимерного волокна обусловлено отталкиванием поверхностных зарядов. Следовательно, увеличение числа зарядов, переносимых струей полимера, способствует увеличению проводимости, что приводит к растяжению полимерной струи и истончению образующегося волокна [20].

В свою очередь тканеинженерные материалы, имеющие в своей структуре нановолокна, способны в лучшей степени имитировать внеклеточный матрикс. Достаточно высокий коэффициент отношения поверхности к объему этих матриксов способствует адгезии клеток, миграции, пролиферации и дифференцировке, а также обеспечивает оптимальную доставку питательных веществ к формирующейся ткани [21].

Оценка динамики выхода биологически активных молекул из PCL матриксов

Важным аспектом в создании тканеинженерных матриксов, содержащих биоактивные молекулы, является контролируемое высвобождение этих веществ из полимера в процессе его биодеградации (рис. 3).

В результате оценки выхода ростовых факторов VEGF и bFGF из PCL матриксов в течение трех недель было обнаружено, что в первые 12–24 ч происходил значительный выброс биологически активных молекул как в эксперименте с материалами, содержащими VEGF, так и bFGF. Дальнейшее повышение количества вышедших белков проходило «ступенчато» также для обоих видов матриксов.

Такая кинетика выхода инкорпорированных молекул может быть связана со следующими процессами, происходящими при деградации полимера. Во время создания материалов методом электроспиннинга белковые молекулы растворяются в фосфатно-солевом буфере. Таким образом, после изготовления внутри полимерного волокна образуются водные резервуары с растворенными факторами роста. Кроме этого, белки располагаются и в поверхностных порах полимерных нитей. После того, как матрикс погружают в водную среду, белок с поверхности волокна смывается, открывая поры, которые связаны с внутренними резервуарами, содержащими факторы роста.

Факторы роста диффузно выходят через заполненные жидкостью поры. Этим обуславливается высокий уровень высвобождения молекул в первые часы эксперимента. Со временем полимер начинает деградировать, что приводит к увеличению подвижности полимерных цепей, раскрытию других участков волокна и облегчению диффузии белков из матрикса [22]. Так как PCL представляет собой медленно деградируемый полимер, то последующий выход факторов роста значительно замедляется (рис. 4). Гипотетически, динамика высвобождения факторов роста из структуры PCL матрикса может быть представлена следующим образом (рис. 4):

I – в полимерном волокне после изготовления материала факторы роста располагаются в резервуарах фосфатно-солевого буфера и в порах на поверхности волокна;

II – после погружения матрикса в водный раствор молекулы факторов роста вымываются из поверхностных пор; некоторые из этих пор связаны с резервуарами фосфатно-солевого буфера;

III – белки выходят через поры из внутренних резервуаров;

IV – при деградации полимера происходит увеличение подвижности полимерных цепей, что способствует дальнейшему выходу молекул из матрикса [23].

Длительность процесса выброса молекул из PCL матриксов может способствовать пролонгированной контролируемой доставке необходимых факторов роста, таких как VEGF и bFGF, в область формирования новой ткани.

Оценка биологических функций VEGF и bFGF после выхода из PCL матриксов

Гистологическое исследование PCL матриксов, содержащих VEGF, либо bFGF, через 3 нед. после подкожной имплантации крысам, продемонстрировало значительное увеличение вросшей грануляционной ткани по сравнению с контрольными PCL материалами. Как и ожидалось, тип реакции был схож для материалов с VEGF и bFGF. В отличие от контрольных, в экспериментальных имплантатах наблюдался обширный внеклеточный матрикс, а также многочисленная популяция миофибробластов, при этом была менее заметна инфильтрация материалов макрофагами.

Кровеносные сосуды, в особенности капилляры, наблюдались в большем количестве в имплантатах, импрегнированных VEGF, в сравнении с матриксами, содержащими bFGF и контролем, что может объясняться более выраженным ангиогенным действием VEGF [24].

Различия в реакции организма на имплантированные «чистые» PCL матриксы и содержащие ростовые факторы может свидетельствовать о том, что белковые молекулы сохраняют свои биологические функции после высвобождения из полимерных волокон.

Таким образом, результаты проведенного исследования продемонстрировали увеличение прочности и эластичности тканеинженерных матриксов из PCL после их импрегнации VEGF и bFGF. В результате медленной биодеградации полимера, факторы роста пролонгированно высвобождались из материалов и осуществляли свои биологические функции в зоне имплантации. Благодаря пористой структуре, оптимальным физико-механическим свойствам и медленному высвобождению биомолекул в зоне имплантации, матриксы из PCL, импрегнированные VEGF и bFGF, могут быть использованы в изготовлении тканеинженерных графтов для восстановления сосудов малого диаметра в организме пациента.

Подняться вверх сайта