Поиск Кабинет

Стволовые опухолевые клетки: 20 лет позади

Гены & Клетки: Том X, №2, 2015г., стр.: 11-15

 

Авторы

Мингалеева Р.Н., Мифтахова Р.Р., Ризванов А.А.

ДЛЯ ТОГО ЧТОБЫ СКАЧАТЬ СТАТЬЮ В ФОРМАТЕ PDF ВАМ НЕОБХОДИМО АВТОРИЗОВАТЬСЯ, ЛИБО ЗАРЕГИСТРИРОВАТЬСЯ

Биология стволовых опухолевых клеток (СОК) была предметом исследований и дискуссий последние 20 лет. Исключительная пластичность данных клеток и комплексность подконтрольных им процессов вдохновляют на создание новых методов выделения и направленной «терапии» СОК. Данный обзор является попыткой обобщения последних данных и тенденций в области СОК, обсуждения потенциала и сложностей новых методов исследования.

Введение

Всего лишь декаду назад ученые с опаской использовали термин «стволовые опухолевые клетки» (СОК), тактично заменяя его термином опухолевые клетки, подобные стволовым (англ. cancer stem-like cells). В 2006 г. на съезде Американской Ассоциации Исследований Рака (AACR) СОК были определены как клетки, способные к самообновлению и созданию гетерогенной популяции клеток, формирующей опухоль[1].

Все больше данных свидетельствуют о том, что именно СОК ответственны за процесс метастазирования опухоли[2], развитие резистентности к существующей химиотерапии[3], рецидив заболевания [4]. Также эта популяция клеток принимает участие в подавлении иммунного ответа[5], угнетении соматических стволовых клеток[6] и создании защитных ниш, поддерживающих СОК как в активно пролиферирующем, так и в латентном состояниях[7]. Интенсивные исследования последних десятилетий помогли накопить данные о внутри- и межклеточных взаимодействиях и защитных механизмах СОК, новых подходах «таргетной» терапии, направленной на СОК. В данном обзоре представлены основные достижения в исследовании этой популяции клеток, рассмотрены успехи в противоопухолевой терапии.

Происхождение СОК

Эра СОК началась в 1994 г., когда T. Lapidot с соавт. (1994) показали, что острый миелоидный лейкоз может быть инициирован у иммунодефицитных мышей пересадкой небольшого числа CD34+/CD38клеток[8]. Дальнейшие несколько лет ознаменовались поиском маркеров для сортировки стволовых клеток. В связи с разным микроокружением и тканевой принадлежностью опухолевых клеток использование одного CD-маркера оказалось невозможным, в связи с чем возникла необходимость создания панели маркеров для сортировки СОК из клеток различных тканей. Схожесть маркеров СОК и соматических стволовых клеток (СК), а также открытие роли эпителиально-мезенхимальных переходов (ЭМП) в онкологии, привели к формированию двух моделей возникновения неопластических клеток.

Сторонники иерархической модели утверждают, что в некоторых типах рака повторный рост опухоли может запустить только популяция СОК, составляющая 0,0001–0,1% опухолевых клеток[9]. Они могут самообновляться, имеют потенциал к дифференцировке, располагаются в специализированных нишах. На основании этого можно предположить, что предшественниками СОК могут быть соматические СК[10].

Согласно стохастической модели, любая клетка с повышенной экспрессией онкогенов и (или) со сниженной регуляцией генов-супрессоров может дать начало опухоли. Со временем такие клетки приобретают дополнительные генетические изменения, в результате которых опухоль становится более агрессивной[11]. Было показано, что предшественниками СОК могут быть дифференцированные клетки опухоли, которые приобрели свойства стволовости. Предполагают, что дедифференцировка опухолевых в СОК-подобные клетки происходит при ЭМП – обычно высоко консервативном процессе, реализуемом в эмбриогенезе. В результате ЭМП прикрепленные эпителиальные клетки приобретают большую мобильность, способность к инвазии и самообновлению[12]. Показано, что при эктопической экспрессии генов транскрипционных факторов Twist и Snail, которые запускают ЭМП, иммортализованные эпителиальные клетки молочной железы человека приобретают свойства стволовых клеток[13]. Активация TGFβ, Wnt, RasMAPK-сигнальных путей также приводит к индукции ЭМП и к дедифференцировке клеток[12]. ЭМП используется клетками для приобретения резистентности к лекарствам[14].

Относительно недавно появилась и третья модель возникновения неопластических клеток – модель «ИньЯнь», согласно которой в опухоли, наряду с активно пролиферирующей популяцией клеток (Янь), существует популяция СОК (Инь) и эти два типа клеток могут взаимопревращаться при определенных условиях[15].

Маркеры СОК

В большинстве своем СОК экспрессируют гены тех же отличительных поверхностных маркеров, что и соматические СК аналогичной ткани. Среди них можно выделить белки с адгезивными свойствами CD44, CD133, CD15, CD166 и EpCAM; активаторы сигнальных путей CD24, CD90; рецепторы цитокинов CD117, CXCR4 (табл.). Наличие поверхностных маркеров само по себе не является надежным признаком принадлежности клетки к популяции СОК. Профиль поверхностных маркеров может меняться под действием эпигенетического сайленсинга, мутаций[16], противоопухолевых агентов[17]. Эти отличия могут быть как между разными пациентами, так и в пределах одной опухоли. Ситуация осложняется тем, что клетки некоторых злокачественных опухолей несут на своей поверхности маркеры СОК, но не обладают способностью восстановления опухоли в экспериментах с ксенотрансплантантами[18]. Возможна и обратная ситуация: опухольобразующей активностью обладают не только клетки, несущие известный поверхностный маркер, но и клетки, по нему негативные (например, CD133-клетки опухолей мозга)[19].

Поскольку фенотип СОК может варьировать, все больше исследователей склоняются к поиску специфичных маркеров среди белков, определяющих состояние стволовости этих клеток. Кандидатами могут быть белки семейства ALDH, ABC-транспортеры, Bmi-1, факторы транскрипции Nanog, Sox-2, Oct-4, Lin-28 (табл.).

Ферменты семейства ALDH (англ. aldehyde dehydrogenase) отвечают за окисление внутриклеточных альдегидов и гидролиз эфиров. Кроме того, эти ферменты участвуют в превращении ретинола в ретиноевую кислоту, которая проникает в ядро и инициирует транскрипцию генов, приводя при этом к дифференцировке, задержке клеточного цикла или апоптозу[20]. Впервые использование ALDH1 в качестве маркера СОК было показано на примере острого миелоидного лейкоза, когда ALDHпозитивные клетки оказались способными давать рост новой опухоли при ксенотрансплантации. Эти же клетки несли на своей поверхности белок CD34+, описанный ранее как маркер СОК лейкозов. Позже была показана высокая активность ALDH в стволовых клетках опухолей молочной железы, печени, толстой кишки, мозга, головы и шеи, легких, поджелудочной железы, простаты, мочевого пузыря, щитовидной железы, шейки матки, меланомы[18, 20]. Неблагоприятный прогноз заболевания связывают с высоким уровнем экспрессии гена aldh1[21]. Одним из механизмов защиты стволовой клетки от токсинов является экспрессия генов АВСтранспортеров (ATPbinding cassette transporters). Эти гены гиперэкспрессируются в стволовых клетках многих опухолей[22], с чем связывают повышенную лекарственную устойчивость клеток опухолей[23]. Для обогащения популяции СОК клетки инкубируют с красителем, к примеру, Hoechst 33342. СОК способны вывести краситель наружу за счет повышенной экспрессии генов транспортеров, тогда как в остальных клетках краситель остается.

Транскрипционный фактор Sox-2 (SRY (sex determining region Y)-box 2) является одним из белков, благодаря которым поддерживается недифференцированное состояние эмбриональных стволовых клеток[24]. Он необходим для получения индуцированных плюрипотентных стволовых клеток. В опухоли его экспрессия повышается либо вследствие генетической дупликации[25], либо за счет регуляции на уровне транскрипции[26]. Подавление синтеза белка Sox-2 посредством микроРНК приводит к снижению пролиферации[24], инвазии и миграции клеток, опухоли после ксенотрансплантации образуются с меньшей эффективностью[26]. S. Boumahdi с соавт. (2014) показали, что среди высокоинвазивных клеток плоскоклеточного рака кожи именно популяция, экспрессирующая ген sox-2, обладает способностью инициировать опухоль при серийных трансплантациях. Удаление пула этих клеток из опухолевой массы первичной доброкачественной, а также злокачественной опухоли приводит к регрессии новообразования[27]. Sox-2 сам по себе не трансформирует клетки, но в кооперации с другими белками, к примеру Stat-3[28], может вызывать онкотрансформацию.

В опухолевых клетках зачастую происходит коэкспрессия генов sox-2 и pouf5f1[29]. Транскрипционный фактор Oct-4 (octamer-binding transcription factor 4) кодируется геном pouf5f1 и является ключевым регулятором самообновления и плюрипотентности эмбриональных стволовых клеток. Нарушенная экспрессия этого гена приводит либо к неправильному росту ткани, либо к образованию опухоли[30]. Популяции опухолевых клеток, устойчивых к ряду терапевтических препаратов (например, к доцетакселу) гиперэкспрессирует pouf5f1[31]. Такие клетки приобретают способность восстанавливать опухоль после ксенотрансплантации[31], которая теряется при доставке в клетку микроРНК, ингибирующих Oct-4[32]. S.M. Kumar с соавт. (2012) показали, что в присутствии белка Oct-4 запускается процесс дедифференцировки клеток меланомы, которые приобретают фенотип СОК[30]. При эктопической доставке Oct-4 и его мишени, белка Nanog, происходит стимуляция ЭМП[32]. Показана корреляция прогрессии заболевания с высокой экспрессией генов pouf5f1 и sox-2 в опухоли[29].

Сигнальные пути

В опухолевых клетках, в том числе и в стволовых, часто активируются антиапоптотические сигналы и пути приобретения резистентности к лекарствам. Также в них нарушается регуляция таких важных сигнальных путей как Wnt, Notch и Hedgehog, последние из которых участвуют в регуляции самообновления, пролиферации и дифференцировки стволовых клеток. Notch-путь также важен для взаимодействия клеток в нише СОК, показано его участие в ЭМП [33]. Нарушенная регуляция этого сигнального пути приводит к повышению мобильности и метастазированию СОК.

Во многих типах опухолей (например, при раке шейки матки, почки, органов головы и шеи) наблюдается измененная экспрессия генов Notch, их лигандов и мишеней[33].

Многие маркеры стволовых клеток являются прямыми мишенями Wnt-сигнального пути (например, LGR5/GPR49, CD44, CD24, CD133, гены ABCтранспортеров, EpCAM)[34]. Результатом гиперактивации этого пути является онкотрансформация. Показано, что конститутивная гиперэкспрессия гена β-катенина, а также отсутствие в клетке функционального белка APC (adenomatous polyposis coli) приводит к развитию рака ободочной и прямой кишки. Повышенное содержание β-катенина выявлено в ядрах СОК лейкозов, в отсутствии этого белка клетки теряют способность формировать опухоль [35]. Неканонические Wnt-пути также задействованы в образовании и прогрессии опухоли[35]. Показана взаимосвязь ЭМП и Wnt-сигнального пути: в присутствии Wnt-1 повышается экспрессия гена twist в клетках рака молочной железы, что способствует ЭМП[34].

Hedgehog – важный сигнальный путь, который регулирует нормальное эмбриональное развитие, но не активен во взрослых тканях и органах. Показана гиперактивация этого пути в результате генетических и эпигенетических изменений в таких опухолях, как медуллобластома, глиобластома, при раке молочной железы, яичников, легких, желудка, предстательной железы[36]. На клетках хронического миелолейкоза показано, что в отсутствии белка Smo, важного компонента Hedgehog-пути, снижается популяция стволовых клеток лейкемии, а продолжительность жизни мышей увеличивается[37]. При активации этого пути лигандами Sonic Hedgehog популяция СОК начинает самообновляться и мигрировать. При подавлении функции Smo происходит терминальная дифференцировка и потеря способности к клоногенному росту[38]. Под влиянием сигнального пути Hedgehog клетки подвергаются ЭМП, становятся более мобильными и инвазивными, а когда эти клетки достигают участка инвазии, то под действием этого сигнального пути наблюдается клоногенный рост и самообновление этих клеток[38].

СОК и противоопухолевая терапия

Результаты эффективности потенциальных препаратов in vitro часто не воспроизводятся на моделях in vivo. В онкологии одной из причин такого расхождения является присутствие в опухоли СОК[39, 40]. Действие большинства противоопухолевых препаратов направлено на элиминацию активно пролиферирующих трансформированных клеток[41] и неэффективно в борьбе с СОК[42]. Поиск препаратов, специфично атакующих СОК, осложнен схожестью маркеров раковых и нормальных стволовых клеток, трудоемкостью выделения СОК и быстрой спонтанной дифференцировкой стволовых клеток in vitro. Несмотря на это, существует ряд успешных методов для поиска препаратов, специфичных к СОК.

К первому можно отнести скрининг библиотек существующих препаратов на СОК или стволовых клетках, максимально приближенных к опухолевым. В 2009 г. P.B. Gupta с соавт. протестировали эффективность приблизительно 16000 препаратов и биоактивных молекул на популяции стволовых (CD44high/CD24low) иммортализированных клеток молочной железы, подвергшихся ЭМТ[43]. Только 32 препарата показали селективную активность против трансформированных клеток и не воздействовали на контрольные СК молочной железы. Из этих препаратов только один – Салиномицин – был эффективен по отношению к СОК с повышенной резистентностью к химиотерапии. По данным исследования, его эффект на СОК в 100 раз выше, чем у применяемого в настоящее время препарата паклитаксела. В схожем исследовании DECA-14 и рапамецин были идентифицированы из 51 препаратов как препараты, направленные против СОК нейробластомы[44].

Вторым методом, точнее группой методов, является воздействие на сигнальные пути, поверхностные маркеры или нишу, специфичные для СОК. Антитела к CD133, коньюгированные с цитотоксичным препаратом (monomethyl auristatin F), эффективно поражали CD133-положительные СК гепатоцеллюлярной карциномы HepB3 in vitro и in vivo[45]. Антитела к CD44 также снижали количество стволовых клеток, воздействуя при этом на клетки ниши СОК острого миелоидного лейкоза[46].

Многообещающим методом является использование онколитических вирусов для борьбы с СОК. Онколитическими вирусами, используемыми в онкологии, являются непатогенные вирусы, способные инфицировать опухолевые клетки, не поражая при этом здоровые клетки человека. Такой онкотропизм достигается за счет многочисленных генетических манипуляций[47]. В клинических исследованиях средняя продолжительность жизни 115 пациентов, получивших инъекцию химерного аденовируса CGTG102, кодирующего гранулоцитарномакрофагальный колониестимулирующий фактор (ГМ-КСФ), выросла со 111 дней при однократной инъекции до 277 дней при серии из нескольких введений[48]. При этом у пациентов наблюдалась активация противоопухолевого иммунитета. Специфичный к гену теломеразы онколитический аденовирус OBP-301 оказался эффективным в лечении CD133+-СОК рака желудка[49]. Стоит отметить, что химиорезистентные СОК, находившиеся в G0/G1 фазах клеточного цикла, после воздействия вируса перешли из латентного состояния в активное и приобрели чувствительность к химиотерапии.

В последние годы особый интерес привлекала иммунотерапия. Сейчас этот термин объединяет под собой создание противораковых вакцин, использование специфичных к опухоли цитотоксичных Т-лимфоцитов, блокировку иммунных «чекпоинтов» и другие методы активации иммунной системы пациентов[50]. Исследование J.N. Kochenderfer с соавт. (2010) с использованием Т-клеток, экспрессирующих ген химерного антигенного рецептора (англ. chimeric antigen receptor, CAR), распознающего CD19, зародило еще одно направление в иммуннотерапии[51]. На модели мышиной сингенной лимфомы было показано, что анти-CD19-CAR Т-лимфоциты способны полностью ликвидировать клетки лимфомы.

Заключение

Открытие СОК добавило сложности в наши представления об организации опухолей. Участие этой популяции клеток во многих процессах, их активация на определенных стадиях развития онкологического заболевания, гетерогенность и пластичность, связанные с разным происхождением, микроокружением и другими условиями представляет эти клетки как «депо» заболевания.

Множество исследовательских групп сфокусировано на поиске препаратов против этих клеток. На данный момент все СОК-направленные препараты находятся на стадии доклинических и клинических исследований. И, несмотря на время, которое ушло на получение первых положительных результатов (в случае с иммунотерапией от первых клинических исследований до первых успешных из них прошло почти 20 лет) неизвестно, когда СОК-направленная терапия войдет в стандартные протоколы лечения пациентов с онкологическими заболеваниями. Хотя на сегодняшний день создана достаточная теоретическая и практическая база для успешного анализа СОК, поиск препаратов представляет собой кропотливый труд и, за редким исключением, найденный препарат эффективен только по отношению к одному виду опухоли. Обладая исключительной пластичностью и многочисленными механизмами адаптации СОК бросают вызов современной науке и, возможно, только новые, наиболее неординарные подходы помогут нам одержать победу.

Подняться вверх сайта