Поиск Кабинет

Структурная динамика адгезивных клеток костного мозга при культивировании. Часть 2: первый пассаж.

Гены & Клетки: Том IX, №4, 2014 год, стр.: 56-62

 

Авторы

Омельяненко Н.П., Ильина В.К., Ковалев А.В., В.А., Родионов С.А.

ДЛЯ ТОГО ЧТОБЫ СКАЧАТЬ СТАТЬЮ В ФОРМАТЕ PDF ВАМ НЕОБХОДИМО АВТОРИЗОВАТЬСЯ, ЛИБО ЗАРЕГИСТРИРОВАТЬСЯ

Исследована морфология и структурная динамика адгезивных клеток костного мозга человека после первого рассева первичной культуры (культивированных в виде адгезированного монослоя на плотном субстрате стеклянного или пластикового дна культурального флакона). Выявлены визуализируемые структурные изменения, которые приобретают клетки в искусственных условиях in vitro, прослежена их динамика при переходе от первичной культуры к клеточной линии. Охарактеризованы адгезивные клетки на разных этапах культивирования: 1) во взвеси перед рассевом, после их открепления от подложки и округления; 2) при прикреплении к дну флакона и распластывании; 3) при образовании монослоя. Наиболее выраженными структурными изменениями являются выпячивания или складчатость клеточной мембраны, образующиеся у культивируемых клеток после открепления от дна культуральных флаконов и помещения в питательную среду во взвешенном состоянии. Наблюдалось значительное обводнение клеточного матрикса. В больших выпячиваниях мембраны клеточный матрикс отсутствовал. Динамика структурных изменений культивируемых клеток оценивалась методом светооптической микроскопии с помощью дифференциального интерференционного контраста по Номарскому и документировалась автоматической цифровой цейтраферной съемкой в условиях культурального инкубатора, интегрированного с инвертированным микроскопом. Для визуализации клеточных структур вне пределов разрешающей способности светового микроскопа использовалась трансмиссионная электронная микроскопия. Выявленное многообразие структурных форм адгезивных клеток на дне культурального флакона может быть связано с присутствием в составе костного мозга разных соединительнотканных дифферонов.

Введение

Адгезивные клетки костного мозга являются объектом внимания многих исследователей на протяжении нескольких десятилетий [1–5]. Автоматическая цейтраферная съемка этих клеток с помощью дифференциального интерференционного контраста (ДИК) по Номарскому позволяет исследовать их морфологическую динамику при культивировании. При исследовании адгезивных клеток костного мозга человека в первичной культуре было выявлено наличие нескольких групп клеток с характерной морфологией, отличающей их друг от друга [6]. Большинство прикрепленных клеток не делилось, хотя их структура все же незначительно изменялась в процессе наблюдения. Митозы наблюдались только у небольшой части адгезивных клеток, имеющих свои морфологические особенности, позволяющие распознать их после распластывания на дне флакона. Представлена светооптическая визуализация детальной динамики этапов их деления. В ходе пролиферации эта небольшая часть клеток постепенно становилась преобладающей и формировала конфлюэнтный (сплошной) монослой. При этом неделящиеся адгезивные клетки сохранялись в составе культуры.

После формирования сплошного монослоя в клетках начинали накапливаться более крупные вакуоли. Очевидно, при этом росла секреторная активность клеток, так как в культуральной среде увеличивалась концентрация коллагена и гликоконъюгатов.

При дальнейшем культивировании количество клеток росло и, соответственно, увеличивалась плотность их расположения на дне флакона. На этом этапе пролиферация клеток замедлялась. Для дальнейшего наращивания клеточной массы и поддержания процесса деления производился пересев (пассаж) выращенной клеточной культуры из одного в несколько культуральных флаконов.

Целью второй части работы являлось исследование структурной динамики адгезивных клеток (собственно соединительнотканных клеток (ССК)) первичной культуры костного мозга человека после субкультивирования и перехода (образования) в клеточную линию.

Материал и методы

В работе использовали вторичные культуры клеток костного мозга человека. Первичная культура, полученная от здоровых доноров, подписавших добровольное информированное согласие, была исследована нами ранее [6]. Мы продолжили исследования этого же клеточного материала при дальнейшем культивировании уже клеточной линии. После диссоциации (открепления) клеток монослоя 0,25% раствором трипсина с солями Хенкса (ПанЭко, Россия) от дна флакона открепленные клетки в виде суспензии пересевались в культуральную посуду с питательной средой для дальнейшего культивирования (среда ДМЕМ с глутамином (ПанЭко, РФ), 10% фетальной телячьей сывороткой крови (HyClone, США), пенициллин-стрептомициновой смесью). Флакон с культуральной средой и внесенными клетками костного мозга помещался на предметный столик инвертированного светооптического микроскопа Nikon Eclipse Ti (Япония), интегрированного с культуральным инкубатором, постоянно поддерживающим температуру 37°С. При исследовании использовался специальный объектив ×10 и модулирующий контраст Хаффмана. Изображение подавалось через фотокамеру на специализированный контроллер и далее на персональный компьютер. Автоматическая цейтраферная съемка с постоянно поддерживаемой автофокусировкой проводилась с помощью программного обеспечения «НИС-Элемент» (NIS-Elements Nikon) с интервалом 5 мин. в течение 2–4 нед. Начиналась съемка через 0–12 ч. после посева и смены культуральной среды. Отдельные периоды культивирования регистрировались в виде цейтраферной съемки с интервалом 20 с. и фокусировкой в ручном режиме. Общее объективное увеличение составляло ×90, на экране контроллера – ×800. Наблюдение производили с помощью ДИК по Номарскому. Условием использования указанного метода является наличие стеклянного дна толщиной 0,17 мм (покровное стекло) и стеклянной верхней части культурального флакона – толщина обычного предметного стекла. В связи с отсутствием в продаже флаконов с вышеуказанными требованиями нами использовались флаконы собственной конструкции. В некоторых флаконах культуры клеток фиксировались и окрашивались по Романовскому – Гимзе. Для ультраструктурного анализа часть полученных клеток на разных этапах культивирования исследовалась с помощью электронной трансмиссионной микроскопии.

Результаты и обсуждение

Открепление клеток полученного ранее монослоя первичной культуры от дна флакона осуществлялось посредством трипсинизации. В ходе этого процесса клетки при отрыве от подложки сокращались, вокруг них появлялся «ореол» из тонких нитей, идущих в виде лучей от тела клетки. Далее клетки приобретали шаровидную или округлую форму, нити постепенно отрывались от дна флакона, сокращались и приобретали вид мелких округлых глыбчатых образований, расположенных на поверхности клеток и на дне флакона. Вероятно, эти нити являлись остатками вещества (возможно белково-гликопротеидной природы), с помощью которого клетки прикреплялись к дну флакона (рис. 1).

Похожий процесс происходил у клеток, готовящихся к делению, но в этом случае они никогда не отрывались от дна флакона полностью, оставаясь фиксированными за счет нескольких отростков. Открепленные и округлившиеся в суспензии клетки клеточной линии после субкультивирования (первого пассажа) были более однородны по морфологии, по сравнению с выделенными из костного мозга клетками первичной культуры. Их эквивалентный диаметр составлял 12–25 мкм.

Перенесенные в новые флаконы со свежей питательной средой клетки некоторое время находились во взвешенном состоянии. На их поверхности можно было наблюдать формирование выраженного рельефа, образованного большим количеством мелких и крупных выпячиваний цитоплазматической мембраны (ЦПМ) округлой формы (пузырьковых псевдоподий), а также многочисленных складок мембраны (рис. 1А). Более крупные выпячивания, или «блеббы» [7], постоянно то увеличивались, то уменьшались в размерах, как бы «пульсировали», порой полностью исчезая в одном месте ЦПМ и появляясь в другом. Очевидно, выпячивания или складки являются своеобразной формой укладки цитоплазматической мембраны после открепления клетки от дна флакона, сокращения и округления (рис. 1А, Б). На ТЭМ видно, что часть выпячиваний небольшого размера заполнена мелкогранулярным материалом средней электронной плотности (рис. 1В). Другие выпячивания, напротив, были свободны от каких-либо структурных элементов клетки, определяемых с помощью контрастирования. В некоторых местах наблюдалось «отслоение» или отделение ЦПМ от структурной части цитоплазмы (внутриклеточного матрикса) (рис. 1В). Общим для всех клеток, находящихся во взвешенном состоянии, являлось наличие в цитоплазме большого количества вакуолей разного размера, внутри которых отсутствовали какие-либо структуры цитоскелета и органеллы. Часть таких вакуолей непосредственно прилежала к ядерной мембране. Отдельные участки цитоплазмы на электроннограммах выглядели структурно разреженными.

В центральной части цитоплазмы кроме вакуолей содержался мелкогранулярный материал средней электронной плотности в виде отдельных гранул, а также их агрегатов – цепочек или конгломератов неопределенной формы (рис. 1В). Встречались овально-округлые структуры с электронноплотным содержимым, размером 0,1–1,0мкм. В цитоплазме было невозможно четко идентифицировать какиелибо органеллы (митохондрии, лизосомы, аппарат Гольджи, ГЭР и др.). В ядрах таких клеток хроматин был представлен в виде отдельных мелких гранул или их небольших скоплений, которые разделялись друг от друга относительно большими свободными пространствами. Хроматин в таких формах отличается от классического ТЭМ-изображения хроматина в ядрах клеток тканей. Он не похож ни на эухроматин (диффузный хроматин), ни на гетерохроматин (конденсированный хроматин).

Прикрепление клеток к дну флакона после пассирования начиналось через 10–15 мин., а через 2–3 ч. почти все клетки были уже прикреплены, уплощены или частично распластаны. Эти процессы взаимодействия с подложкой происходили достаточно быстро, тем не менее, в них можно выделить несколько этапов. Сначала «плавающие» клетки контактировали с дном флакона в нескольких местах посредством выпячиваний цитоплазматической мембраны (рис. 1А). Эти области контакта расширялись, одновременно с появлением по периферии клетки других локусов взаимодействия с дном флакона. Форма клетки при этом становилась более плоской. Постепенно области контактов сливались, образуя общую поверхность контакта с дном флакона, в центре уплощенной клетки.

Выпячивания, расположенные по периферии клетки, после контакта со стеклом приобретали вид своеобразных «ножек» – пузырьковых псевдоподий [7] (рис. 2А), которые в дальнейшем сливались между собой. Уплощенные клетки имели овальную или многоугольную форму с эквивалентным диаметром 60–80 мкм (рис. 2А). В центральной, более высокой части клеток, находилось ядро (менее уплощенная органелла) и эндоплазма. По периферии располагалась эктоплазма, в которой присутствовали лишь единичные вакуоли и тонкие нити (микрофиламенты) цитоскелета. По краям клеток цитоплазматическая мембрана образовывала многочисленные складки. У некоторых клеток сохранялись выпячивания периферической части цитоплазматической мембраны (рис. 2Б). У других – образовывались длинные отростки, оканчивающиеся утолщениями. Далее уплощенные клетки распластывались полностью, включая ядро. В таких клетках четко визуализировались вакуоли, тонкие филаменты цитоскелета, эндоплазма и эктоплазма, а также ядра и ядерная мембрана. Периферические складки клеточных мембран расправлялись (рис. 3). Этот процесс происходил во всех клетках с небольшой временной разницей. Уже через 24–30 ч. начинались первые деления у большинства клеток, полностью повторяющие общую схему этого процесса у пролиферирующих клеток в первичной культуре (рис. 4).

В отличие от первичной культуры, после субкультивирования делилось большинство пересеянных (культивируемых) клеток (рис. 5). В связи с этим, при равной плотности посева, конфлюэнтный монослой в первичной культуре может быть получен значительно раньше (уже через 72 ч.). При большем количестве посеянных клеток, накопление клеточной массы происходило быстрее. В монослое клеточной линии присутствовали также неделящиеся клетки, но их было значительно меньше в соотношении с делящимися, так как количество последних постоянно увеличивалось, а количество неделящихся оставалось таким же, как в первичной культуре. Большинство клеток клеточной линии в монослое имели вытянутую форму и немногочисленные отростки (рис. 6).

Следует отметить, что при последующих пассажах морфология адгезивных клеток костного мозга, составляющих клеточную линию, существенно не изменялась. Размеры открепленных и округлившихся клеток при пересевах во взвешенном состоянии составляли 12–25 мкм в диаметре.

Учитывая, что представленная работа является продолжением ранее опубликованной первой части [1], обсуждение материала будет включать данные, представленные в первой части.

Прикрепление (адгезия) клеток костного мозга из взвешенного состояния к дну флакона после помещения в питательную среду и последующее их распластывание, прежде всего, указывало на наличие в этих клетках соответствующих механизмов адгезии. Несмотря на то, что смысл этих явлений до конца не ясен, сами механизмы прикрепления клеток достаточно подробно описаны в литературе [8, 9]. В клеточную мембрану встроены интегрины и трансмембранные протеогликаны. Их взаимодействию с дном культурального сосуда способствуют гликопротеины, такие как фибронектин, а также фибриллярные белки – коллагены и протеогликаны, которые синтезируются самой клеткой в культуре. Продукты клеточного синтеза оседают на дно флакона и агрегируют (взаимодействуют) с культуральным пластиком или стеклом [10]. Сопоставляя скорость прикрепления и распластывания культивируемых клеток первичной культуры и клеточной линии, можно сделать вывод, что более быстрое прикрепление клеток к подложке (дну флакона) после рассева первичной культуры, вероятно, связано с усилением в процессе культивирования и совершенствованием механизмов клеточной адгезии, способности клеток к взаимодействию с подложкой, а также накоплением в клетках молекул, ответственных за клеточно-субстратное взаимодействие.

Наличие адгезивных веществ между клеточной мембраной и дном флакона подтверждалось появлением радиальных «лучистых» нитей вокруг клетки во время ее сокращения как при откреплении, так и в начале деления. Очевидно, что вышеуказанные нити являлись остатками адгезивных веществ гликопротеидной природы (вероятно фибронектина).

При получении первичной культуры из выделенных мононуклеаров костного мозга человека адгезия и распластывание происходили в диапазоне от 2–3 ч. до 2–3 сут. Очевидно, что эти явления – части одного процесса взаимодействия поверхности клеток с подлежащим стеклом или пластиком дна культурального флакона. Прикрепление клетки сначала происходило локально, а затем количество и площадь контактов увеличивались. Клетки постепенно меняли форму: уплощались и распластывались. Размер распластанной по поверхности дна флакона клетки, очевидно, был ограничен размером (объемом) той сложной трехмерной формы, которую эта клетка имела in vivo в костном мозге. После извлечения из кости (аспирации костного мозга после пункции) и помещения в виде суспензии в жидкую питательную среду для культивирования клетки приобретали шарообразную форму, сходную с ядросодержащими клетками крови, находящимися во взвешенном состоянии.

Очевидно, что адгезия и последующее распластывание связаны с действием физических факторов. На клетку, помещенную в культуральную среду, действовала гравитация, которая неизбежно опускала ее на дно флакона. Таким образом наступал контакт клетки с поверхностью дна культурального флакона. Уже имеющиеся на клеточной мембране адгезивные структуры – интегрины и мембранные протеогликаны, – с помощью которых происходит взаимодействие с элементами внеклеточного матрикса или другими клетками в ткани, дают возможность прикрепляться к поверхности пластика или стекла (дна сосуда).

Многообразие структурных форм адгезивных клеток в первичной культуре, как во взвешенном состоянии, так и при распластывании на дне культурального флакона, могло быть связано с присутствием в составе костного мозга клеток из всех соединительнотканных дифферонов, имеющихся в костном мозге. Фибробластический дифферон в полном объеме представлял собственно соединительнотканные клетки рыхлой волокнистой неоформленной соединительной ткани, формирующей ретикулярную основу (строму) костного мозга. Дифферон включает коммитированные клетки-предшественницы и фибробласты на разных стадиях развития, зрелые фибробласты, стареющие и дефинитивные формы фибробластов. Такое же представительство в костном мозге имеет дифферон жировых клеток. На начальных стадиях развития (дифференцировки) жировые клетки имеют фибробластоподобную морфологию, но в процессе специализации в них постепенно происходит накопление жира в форме мелких капель, сливающихся в более крупные, и, в конечном счете, в одну большую каплю. Конечно, зрелых жировых клеток в первичной культуре не было в связи с их разрушением при получении аспирата и последующей обработки костного мозга для выделения и посева ядросодержащих клеток. Развивающиеся в питательной среде жировые клетки с небольшим содержанием жира в их цитоплазме теряли его при культивировании, принимая вид фибробластов.

Представительство костно-хрящевого дифферона в костном мозге ограничивалось остео-хондрогенными предшественниками [11]. Зрелые клетки – остеоциты и хондроциты – в аспирате костного мозга отсутствовали, так как были «замурованы» в плотный костный или хрящевой матрикс, соответственно. Таким образом, вероятно, пул соединительнотканных адгезивных клеток костного мозга человека представлен совокупностью всех вышеуказанных дифферонов. В литературе этим клеткам приписаны мультипотентные свойства, которые они могут проявлять в виде появления отдельных признаков в культуре при воздействии различных дифференцировочных сигналов и изменении культурального микроокружения [12–14].

В искусственных условиях направленной дифференцировки культивируемых клеток костного мозга только их часть обнаруживает признаки формирования специализированного фенотипа клеток в заданном направлении [15].

Учитывая, что среди адгезивных клеток костного мозга присутствуют клетки всех соединительнотканных дифферонов, можно предположить возможность появления отдельных тканевых признаков у той части культивируемых под действием активирующего сигнала клеток, на который отвечает только популяция клеток отдельного дифферона, соответствующая этому сигналу и воспринимающая его. Поэтому при выявлении мультипотентности в адгезивных клетках костного мозга для чистоты эксперимента необходимо исключить из всего пула соединительнотканных клеток дифферон, чувствительный к соответствующим дифференцировочным сигналам. Это технически сложно осуществить. Поэтому утверждать, что адгезивные клетки костного мозга однозначно мультипотентные – нельзя.

Поддерживаемые в культуре и многократно поделившиеся адгезивные клетки постепенно становятся морфологически более единообразными. Вся совокупность этих клеток состоит из культивируемых адгезивных клеток на разных стадиях зрелости. Эти клетки сохраняли соединительнотканный фенотип, который являлся фактически фенотипом фибробластического дифферона [16].

Еще одним дискуссионным вопросом в литературе является встречающееся определение культивируемой совокупности адгезивных клеток костного мозга, как «мезенхимных стволовых клеток» [1].

С позиции классической гистологии мезенхима – это комплекс неоднородных эмбриональных клеток и межклеточного матрикса, из которого в течении эмбриогенеза образуется соединительная ткань, гемопоэтические органы, гладкомышечные клетки, нейроглия. Во время своего роста мезенхима непрерывно изменяется, и ни на одной стадии своего развития не сходна с предшествующей стадией. Зрелая соединительная ткань также постоянно меняется в процессе онтогенеза, поэтому понятие мезенхимный не следует использовать для характеристики какихлибо ее клеточных форм. Термин «мезенхимный» может лишь указывать на происхождение того или иного типа клеток из мезенхимального зачатка [17].

Постоянная вышеуказанная динамика мезенхимных клеток не позволяет назвать их стволовыми, так как последние должны сохранять и воспроизводить закрепленную генетическую информацию. Культивируемые клетки тем более не могут быть ни мезенхимными, ни стволовыми, так как адгезивные клетки выделены из костного мозга и выращены в искусственных условиях (культуральной среде). В связи с этим, использовать гистологическую терминологию для обозначения культивируемых клеток следует с определенными оговорками. Ткань, в частности соединительная, – это единый клеточно-матриксный комплекс, в который интегрированы сосуды и нервы. Собственно соединительнотканные клетки – это клетки, которые синтезируют компоненты межклеточного матрикса, участвуют в его структурировании, в соответствии с разновидностью соединительной ткани, а также в его постоянном обновлении.

В клеточной культуре – собственно соединительнотканные клетки в искусственной питательной среде не имеют тканевой взаимосвязи друг с другом (структурно и с помощью сигналов), но за счет отдельных компонентов межклеточного матрикса, синтезированных этими клетками, они имеют возможность прикрепляться к пластиковому или стеклянному дну культурального флакона.

Структурная динамика культивируемых адгезивных клеток костного мозга в первичной культуре несколько отличалась в клеточной линии.

Первый этап – нахождение во взвешенном состоянии после трипсинизации клеток конфлюэнтного монослоя первичной культуры – продолжался 10–20 мин. (при получении первичной культуры от 2–3 ч. до 2–3 сут.). Размерный диапазон адгезивных клеток сразу после посева составлял 10–12 мкм. Сразу после пересева уже в клеточной линии размер клеток во взвеси составлял 12–25 мкм. Клеточная мембрана таких клеток имела многочисленные выпячивания разного размера. При ТЭМ исследовании показано, что часть выпячиваний небольшого размера была заполнена цитоплазматическим матриксом; в более крупных выпячиваниях мембраны не было элементов электронноплотного матрикса вообще.

Можно предположить, что происхождение подобных локальных образований связано с отличием физико-химических свойств (эластичности) клеточной мембраны или локальных ослаблений мембранноактиновых связей в местах выпячиваний. Очевидно, при относительно быстром откреплении распластанных в монослое клеток от дна флакона и переходе их во взвеси в округлую или шаровидную форму клеточная мембрана в области выпячиваний, где отсутствует структурированный цитоплазматический матрикс, не проявляет в достаточной степени своих эластических свойств. Вероятно, такие выпячивания происходят под давлением внутриклеточной жидкости, объем которой, возможно, увеличивается за счет поступления извне и перераспределяется при изменении плоской формы клеток в овальную или шарообразную. На это указывают хорошо заметные признаки обводнения цитоплазмы. Таким образом, можно говорить о двух разновидностях выпячиваний являющихся результатом изменения формы клеток. Сам механизм таких изменений требует дальнейшего исследования.

В некоторых работах [18, 19] указывается, что выпячивание цитоплазматической мембраны (блеббинг) наблюдается при апоптозе и является признаком одной из его стадий, предвещая близкую гибель клетки. По другим данным, клетки могут использовать «блеббы» для цитокинеза в отсутствии подложки или слабого прикрепления к ней при культивировании или эмбриогенезе [20, 21] В этих исследованиях не приводится описание структуры «блеббов». В настоящей работе клетки, выделенные из конфлюентного монослоя первичной культуры, имели многочисленные выпячивания мембраны, отличающиеся по своему строению. С помощью этих выпячиваний клетки касались дна культурального флакона. После прикрепления и уплощения часть выпячиваний некоторое время сохранялась, но при полном распластывании исчезала, таким образом, клетки восстанавливали свою структуру, которая у них сформировалась в первичном пассаже. Следовательно, разрушение клеток не происходило. Далее клетки делились. Этот процесс для какой-либо произвольно выбранной группы клеток фиксировался с помощью цейтрафера, что однозначно подтверждало факт продолжения их дальнейшей жизнедеятельности. Следует также обратить внимание на то обстоятельство, что при изменении формы клетки во время подготовки к делению выпячивания цитоплазматической мембраны не возникали. Они появлялись только на стадии телофазы.

Почти все пересеянные клетки клеточной линии начинали делиться после адгезии. Однако проследить количество делений отдельных клеток не представлялось возможным, даже используя цейтраферную съемку. В последующих пассажах размеры клеток не увеличивались. Выпячивания были менее выраженными, в них имелись электронноплотные структуры.

Безусловно, нельзя оставить без внимания ультраструктурную организацию клеток клеточной линии, которые открепляют с помощью трипсинизации от подложки и из конфлюэнтного монослоя. Это особенно важно потому, что подобные клетки наиболее часто используются в клеточных технологиях [22], а при трансплантации клеток в какуюлибо ткань или кровоток они попадают в организм в вышеописанном состоянии после структурной адаптации к условиям культивирования и этапа предварительного наращивания клеточной массы в искусственных условиях. Как изменится ультраструктура таких «обезличенных» в культуре клеток по отношению к существующему в организме дифферону, после переноса их в живую ткань пока недостаточно понятно. К этому следует добавить, что клеточная трансплантация может проводиться на фоне оперативного вмешательства – механической травмы тканей реципиента с последующим неизбежным развитием локального асептического воспаления. Таким образом, трансплантируемые клетки подвергаются многостороннему разнофакторному и многократному стрессу, что, безусловно, негативно скажется на их структурно-функциональной адаптации и последующей жизнедеятельности. Целесообразность в дальнейшем исследовать структурные изменения культивированных клеток после их трансплантации в ткань (in vivo) не вызывает сомнений.

Подняться вверх сайта