Поиск Кабинет

Стимуляция посттравматической регенерации седалищного нерва крысы с помощью плазмиды, экспрессирующей сосудистый эндотелиальный фактор роста и основной фактор роста фибробластов

Гены & Клетки: Том VI, №3, 2011 год, стр.: 67-70

 

Авторы

Масгутов Р.Ф., Салафутдинов И.И., Богов А.А., Трофимова А.А., Ханнанова И.Г., Муллин Р.И., Исламов Р.Р., Челышев Ю.А., Богов А.А. , Ризванов А.А.

ДЛЯ ТОГО ЧТОБЫ СКАЧАТЬ СТАТЬЮ В ФОРМАТЕ PDF ВАМ НЕОБХОДИМО АВТОРИЗОВАТЬСЯ, ЛИБО ЗАРЕГИСТРИРОВАТЬСЯ

Разработка эффективных методов лечения больных с повреждением периферических нервов является актуальной задачей биомедицины. «Золотым стандартом» в восстановлении целостности нервных проводников является аутонервная пластика, при которой дефект периферического нерва замещают с помощью аутогенной нервной вставки. Предложен способ стимулирования реваскуляризации и регенерации аутонервной вставки с помощью локальной инъекции плазмиды pBud-VEGF-FGF2, экспрессирующей сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF) и основной фактор роста фибробластов (FGF2). Показано, что прямое введение плазмиды pBud-VEGF-FGF2 в проксимальный и дистальный отрезки нерва, а также в саму аутонервную вставку, стимулирует регенерацию седалищного нерва крысы и восстанавливает двигательную активность.

Повреждения периферических нервов с наличием посттравматического дефекта являются актуальной проблемой медицины. Ежегодно в мире проводят более 2 млн реконструктивных операций с целью восстановления нервных стволов [1]. Несмотря на широкое применение различных подходов и методов лечения, остается проблема высокой степени инвалидизации больных [2–3].

Перспективным направлением для стимуляции посттравматической регенерации поврежденных нервных проводников представляется использование нейротрофических и ангиогенных факторов. В качестве таких стимуляторов особый интерес представляют сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF) и основной фактор роста фибробластов (FGF2).

VEGF проявляет свойства типичного нейротрофического фактора. Он поддерживает выживание чувствительных [4] и двигательных [5] нейронов. Вместе с тем, VEGF стимулирует пролиферацию астроцитов [6], нейральных стволовых [7] и ключевых для регенерации периферического нерва шванновских клеток [4]. VEGF обладает выраженным стимулирующим влиянием на процесс неоваскуляризации, что важно для устранения эффекта посттравматической ишемии тканей.

Другой, не менее важный для нейрорегенерации ангиогенный и нейротрофический фактор – FGF2. На модели преодоления 10 мм диастаза седалищного нерва крысы при помощи кондуита из хитозана с гидрогелевым матриксом на основе гепаринафибрина-фибронектина, содержащего FGF2, показано существенное превышение показателей регенерации по сравнению с контролем (PBS вместо гидрогеля c FGF2) и их приближение к модели аутонервной вставки [8].

Однако при непосредственной доставке нейротрофических факторов в область повреждения терапевтический эффект ограничен по времени из-за короткого периода жизни рекомбинантных белков в тканях in vivo. Для достижения устойчивого и пролонгированного действия терапевтических молекул представляется более целесообразным доставлять не рекомбинантные нейротрофические факторы, а гены, кодирующие их биосинтез. Доставка в область повреждения терапевтических генов считается одним из перспективных направлений для стимуляции нейрорегенерации. Остается неясным, какие гены или их комбинаций наиболее эффективно стимулируют посттравматическую регенерацию нерва. Для решения этой задачи в данной работе выбрана комбинация генов vegf и fgf2, кодируемых ранее разработанной нами плазмидой pBud-VEGF-FGF2 [9].

Цель работы: выявить влияние прямой генной терапии плазмидой pBud-VEGF-FGF2 на посттравматическую регенерацию седалищного нерва крысы при замещении его дефекта с помощью аутонервной вставки.

Материал и методы

Двухкассетный экспрессионный плазмидный вектор pBud-VEGF165-FGF2 создан на основе плазмиды рBudCE4.1 (Invitrogen) субклонированием кДНК генов vegf (изоформа 165) и fgf2 под контролем промоторов EF-1α и CMV соответственно [9]. Ранее нами было показано, что при трансфекции клеток человека различных типов плазмидой pBudVEGF165-FGF2 происходит конститутивная и независимая экспрессия двух терапевтических генов vegf и fgf2 [9–10]. Плазмидную ДНК для введения подопытным животным выделяли из рекомбинантного штамма Escherichia coli с помощью набора EndoFree Plasmid Maxi Kit в соответствии с инструкциями производителя (QIAGEN).

В работе использовали белых беспородных крыс. У животных в левом седалищном нерве на уровне середины бедра формировали диастаз длиной 5 мм, иссеченный фрагмент нерва тотчас подшивали в сформированный дефект. Через 7 сут. производили повторный доступ к нерву. Животным опытной группы вводили с помощью инъекции плазмиду pBud-VEGFFGF2 в проксимальный и дистальный отрезки нерва, отступая 1 мм от линии шва, а также в саму вставку, отступая 2,5 мм от линии шва; по 5 мкл в каждую точку (всего 45 мкг плазмидной ДНК в 15 мкл PBS). Животным контрольной группы в те же точки и в том же объеме вводили раствор фосфатного буфера (PBS). Начиная со вторых суток после второй операции, для оценки двигательной функции использовали метод стимуляционной электронейромиографии. С помощью игольчатых электродов регистрировали суммарный потенциал икроножной мышцы, а именно порог возникновения моторного ответа, латентный период, длительность, амплитуду максимального моторного ответа, количество двигательных единиц крысы на стимуляцию седалищного нерва до операции, через 7 сут. после операции, через 28 и 56 сут. после введения плазмиды pBud-VEGF-FGF2, а также у интактных животных. На 60 сут. после операции забирали 5 мм фрагмента периферического отрезка седалищного нерва дистальнее линии шва вставки, фиксировали в 2,5% растворе глутарового альдегида, дофиксировали в 2% растворе четырехокиси осмия и заливали в эпон-аралдит. На полутонких срезах, окрашенных толуидиновым синим, под световым микроскопом подсчитывали количество миелиновых волокон. Статистический анализ проводили методом t-критерия Стьюдента в программе Microsoft Excel 2007.

Все процедуры с животными проводили в соответствии с правилами, рекомендованными Физиологической секцией Российского национального комитета по биологической этике [11].

Результаты и обсуждение

Начиная со 2-х сут. после операции, произведена оценка динамики восстановления двигательной функции икроножной мышцы, иннервируемой седалищным нервом. В таблице представлены данные амплитуды моторных ответов подопытной и контрольной групп животных в сравнении с группой интактных животных.

Исходя из полученных данных, лучшие результаты наблюдали в группе животных с введением плазмиды pBud-VEGF-FGF2 – средние значения амплитуды максимального моторного ответа икроножной мышцы на 56 сут. составили 63% относительно интактной конечности, а в контрольной группе результат – 22%.

В работе C. Fu et al. (2007) при перерезке седалищного нерва крысы без формирования диастаза к 8 неделе после операции и одновременного однократного введения 50 мкг плазмидного вектора phVEGF165 суммарный потенциал икроножной мышцы возрастал по сравнению с контролем (введение физраствора вместо плазмиды) в среднем в 1,5 раза [12]. В нашем случае на том же сроке наблюдения и приблизительно при той же дозе вводимой однократно плазмиды pBud-VEGF-FGF2 амплитуда моторных ответов икроножной мышцы увеличивалась почти в 3 раза. Учитывая наличие диастаза в наших экспериментах, т.е. существенно более сложные условия для регенерации нервных волокон, зарегистрированный нами результат по данному электрофизиологическому показателю превосходит результаты работы C. Fu et al., что может быть связано с доставкой в область повреждения нерва одновременно двух терапевтических генов, экспрессирующих in vivo комбинацию нейротрофических и ангиогенных факторов. На модели диабетической нейропатии у крыс и кроликов через 4 нед. после прямого введения в мышцу плазмиды с рекомбинантными генами человека VEGF-1 (VEGF165) или VEGF-2 (VEGFC) по критериям неоваскуляризации и электрофизиологическим параметрам для нервных волокон большого и малого диаметра также был зарегистрирован устойчивый позитивный результат [13].

Через 60 сут. после операции во всех группах забирали проксимальный фрагмент периферического отрезка седалищного нерва для оценки количества регенерирующих миелиновых волокон. При эксплантации седалищного нерва крыс подопытной группы с введением плазмиды pBud-VEGF-FGF2 была выявлена выраженная реваскуляризация аутонервной вставки (рис. 1). При гистологическом исследовании показано, что количество миелиновых волокон в дистальном отрезке седалищного нерва было на 98,4% (р<0,05) больше по сравнению с контрольной группой (введение PBS) (рис. 2).

В условиях генной терапии увеличение количества миелиновых волокон может быть результатом прямого поддерживающего влияния нейротрофических факторов на выживание и дифференцировку шванновских клеток, а также на процесс ремиелинизации аксонов.

Таким образом, полученные данные указывают на то, что прямое введение плазмиды pBud-VEGFFGF2 стимулирует регенерацию седалищного нерва крысы и восстанавливает двигательную активность конечности. При этом усиливается реваскуляризация аутонервной вставки и, вероятно, активируется пролиферация шванновских клеток и экспрессия в них ряда стимуляторов нейрорегенерации, таких как нейротрофичекие факторы, молекулы адгезии, молекулы внеклеточного матрикса и др. Наблюдаемые нами эффекты улучшения показателей регенерации нерва могут быть результатом локальной сверхэкспрессии терапевтических генов и прямого влияния кодируемых ими нейротрофических и одновременно ангиогенных факторов на клетки-мишени в поврежденной ткани.

Подняться вверх сайта