Поиск Кабинет

Сравнительный цитогенетический анализ мультипотентных мезенхиамльных стромальных клеток ранних пассажей и лимфоцитов человека

Гены & Клетки: Том IV, №2, 2009 год, стр.: 63-69

 

Авторы

Шалыгина ЮА„ Ефимова О А., Кругляков П.В., Пендина А А., Гоигорян А.С., Кузнецова Т.В., Полынцев Д.Г., Баранов B.C.

ДЛЯ ТОГО ЧТОБЫ СКАЧАТЬ СТАТЬЮ В ФОРМАТЕ PDF ВАМ НЕОБХОДИМО АВТОРИЗОВАТЬСЯ, ЛИБО ЗАРЕГИСТРИРОВАТЬСЯ

Проведено изучение хромосомного набора мультипотентных мезенхимных стромальных клеток (ММСК) ранних пассажей и сопоставление его с таковым лимфоцитов периферической крови тех же доноров. Выполнено кариотипирование культуры ММСК и ФГА-стимулированных лимфоцитов периферической крови, полученных от шести здоровых лиц обоих полов. В результате цитогенетического анализа культур ММСК, проведенного после каждого пассажа, начиная с четвертого и заканчивая седьмым, не было выявлено метафазных пластинок с измененным числом и структурой хромосом. Во всех случаях был установлен нормальный кариотип, соответствующий кариотипу ФГА-стимулированных лимфоцитов тех же индивидов. Таким образом, на ранних пассажах в культурах ММСК доноров с нормальным конституциональным кариотипом, установленным при цитогенетическом анализе лимфоцитов, не было зарегистрировано клеток с хромосомными и геномными мутациями.

Введение

Мультипотентные мезенхимные стромальные клетки (ММСК) человека обладают способностью к ограниченному самообновлению и дифференцировке в нескольких направлениях. Возможность ММСК дифференцироваться в клетки мезенхимного происхождения, такие как адипоциты, хондроциты и остеоциты, является чрезвычайно привлекательной для развития биомедицинских технологий [1, 2]. Свойства ММСК позволяют использовать их для восстановления структуры и функций поврежденных тканей, в особенности в тех ситуациях, когда традиционные методы лечения малоэффективны. Применение ММСК открывает широкие возможности для лечения и профилактики таких тяжелых заболеваний, как сахарный диабет, печеночная недостаточность [3], инфаркт миокарда и кардиомиопатии [4-6]. Немаловажно при этом, что трансплантация аутогенных стволовых клеток костного мозга не приводит к иммунному конфликту и не противоречит биоэтическим нормам.

ММСК, являясь резидентами стромы костного мозга, присутствуют в ней в небольшом количестве: 1 на 104—*10s клеток [7]. Недостаточное для терапевтических целей число ММСК, получаемых непосредственно из красного костного мозга, требует их наращивания в культуре. Согласно данным ряда исследований, при увеличении объема клеточной массы методом пассирования в культуре, появляются клетки с возникшими de novo нарушениями хромосомного набора, дающие впоследствии аномальные клеточные линии [8—11]. Среди аномалий кариотипа ММСК одни авторы обнаруживают анеуплоидию — отличное от нормального (46, XX или 46, XY) число хромосом [10], другие — выявляют структурные аберрации хромосом [8, 9]. Также исследователи отмечают сочетанные аномалии, при которых идентифицируют как анеуплоидный хромосомный набор, так и структурно перестроенные хромосомы [10, 11]. Изменение количества генетического материала может привести к аномальному функционированию генома, что оказывает крайне негативное влияние на клетку, вплоть до опухолевой трансформации [12]. В связи с этим применение в терапии клеточных линий с аномальным кариотипом недопустимо. Однако изменение кариотипа ММСК при пассировании было установлено не всеми авторами. Таким образом, вопрос об изменениях кари-отипа ММСК в культуре остается открытым.

Выделяют несколько факторов, приводящих к изменениям кариотипа ММСК in vitro. Возможными причинами возникновения аномалий хромосомного набора ММСК могут быть собственно биологические свойства стволовых клеток, особенности условий культивирования и, наконец, индивидуальные свойства генома донора клеток, предрасполагающие к появлению хромосомных аберраций. Эти факторы необходимо учитывать при цитогенетическом анализе ММСК, так же как наличие сбалансированных перестроек хромосом в конституциональном кариотипе донора ММСК. В связи с этим целью настоящей работы является цитогенетический анализ культур ММСК ранних пассажей и лимфоцитов доноров-добровольцев.

Материал и методы

Добровольными донорами ММСК и лимфоцитов явились трое мужчин и три женщины в возрасте от 28 до 46 лет. Перед получением биологического материала проводили анкетирование доноров-добровольцев, результаты которого приведены в таблице 1.

ММСК эксплантировали из стернального пунктата костного мозга объёмом 2^8 мл. Полученный пунктат разбавляли в два раза питательной средой аМЕМ (Hyclone, Новая Зеландия), фракционировали в градиенте Ficoll (1:1), отбирали слой мононуклеарных клеток. Отобранные мононуклеарные клетки промывали питательной средой аМЕМ, центрифугировали при скорости 1500 об./мин., осадок суспензировали в культуральной среде аМЕМ с добавлением 20% сыворотки эмбрионов коров (Hyclone, Новая Зеландия), 100 мкг/мл пенициллина/стрептомицина (Hyclone, Новая Зеландия) и высевали во флакон для культивирования Т-75 (Sarstedt, Германия). Через 48 час. после эксплантации костного мозга проводили двукратную процедуру отмывки ММСК и островков костного мозга от форменных элементов крови, находящихся в суспензии, с помощью раствора PBS (20 мМ фосфатный буфер, pH 7,4; 0,1 М NaCI), и снова помещали в питательную среду. Для пересева культуры использовали раствор трипсина и ЗДТА (Hyclone, Новая Зеландия). Первый пересев культуры ММСК проводили через 6^10 сут. после эксплантации, далее культуру пересевали каждые 5^7 сут. с исходной плотностью 1,27х103 клеток/см2. Замену питательной среды производили каждые трое сут. После третьего пассажа культуру криоконсервировали по стандартной методике [13] и хранили от 1 мес. до 1 года, затем размораживали и культивировали до 7-го пассажа.

Перед замораживанием и после размораживания проводили иммунофенотипирование культуры ММСК методом проточной цитофлуориметрии с окрашиванием антителами к специфическим поверхностным маркерам. Для фенотипирования ММСК использовали антитела к CD34 и CD45 (Beckton Dickinson, США), CD90, CD44, CD105, CD106 (Beckton Dickinson, США). Для окрашивания антителами к поверхностным маркерам клетки снимали с чашек раствором трипсина и ЗДТА (Hyclone, Новая Зеландия), промывали два раза раствором PBS (20 мМ фосфатный буфер, pH 7,4; 0,1 М NaCI), затем на 1 час переносили в раствор моноклональных антител, коньюгированных с флуорохромом, в разведении 1:20. Далее клетки промывали два раза раствором PBS и анализировали на проточном цитофлуориметре Epics XL (Beckman Coulter, США).

После каждого пассажа, начиная с четвертого и заканчивая седьмым, для части культуры ММСК каждого донора проводили хромосомный анализ, а оставшиеся клетки пересевали в другой флакон, для того чтобы провести аналогичный анализ после следующего пассажа (рис.1).

Для получения препаратов метафазных хромосом с целью дальнейшего кариотипирования, после пассажей 4, 5, 6, 7 непосредственно в культуральные флаконы объемом 40 мл, содержащие 3,5 мл культуральной среды бМЕМ (Hyclone, Новая Зеландия), добавляли раствор колхицина в конечной концентрации 0,05 мг/мл, и инкубировали при комнатной температуре в течение 4^6 час. Для получения суспензии клеток культуру ММСК обрабатывали раствором трипсина с раствором Версена в соотношении 1:3. Суспензию клеток переносили в центрифужные пробирки, добавляли по 3 мл 0,55% KCI для гипотонической обработки и инкубировали 20 мин. при комнатной температуре. Проводили префиксацию, добавляя в пробирку 75 мкл фиксатора (этанол-ледяная уксусная кислота, 3:1), центрифугировали 10 мин. при 1000 об./мин., удаляли надосадочную жидкость, оставляя 0,3^0,5 мл над осадком. Осадок разбивали пипетированием и струйно добавляли 3 мл холодного свежеприготовленного фиксатора (этанол-ледяная уксусная кислота, 3:1) и перемешивали.

Фиксацию проводили при + 4°С в течение 20 мин. Затем меняли фиксатор, центрифугировали в течение 10 мин при 1000 об./мин., удаляли надосадочную жидкость, оставляя 0,3^0,5 мл над осадком. Раскапывание суспензии проводили на предметные стекла, охлажденные в воде при + 4°С, нанося на препарат по 30^50 мкл суспензии с высоты 30^50 см. Стекла высушивали на воздухе при комнатной температуре.

Получение препаратов метафазных хромосом из лимфоцитов периферической крови доноров проводили в соответствии со стандартным протоколом [14]. В стерильный шприц, содержащий 100^500 ед. гепарина, забирали 3^5 мл венозной крови. В пенициллиновые флаконы добавляли: 4,5 мл среды RPMI-1640 (Биолот, Россия) с глутамином; 0,5 мл сыворотки крови эмбрионов коров (Биолот, Россия); 0,3 мл гепарини-зированной крови, фитогемагглютинин (ФГА) в концентрациях, рекомендуемых фирмой-производителем. Стандартное время культивирования составляло 72 ч. при +37°С в закрытой системе. На 72-м часу культивирования за 40 мин. до начала фиксации, в культуру вводили колхицин в конечной концентрации 0,05 мг/мл. Содержимое флаконов переносили в центрифужные пробирки, клетки осаждали центрифугированием в течение 10 мин. при 1000 об./мин., супернатант удаляли пипеткой, оставляя 0,3^0,5 мл над осадком. Осадок разбивали пипетированием, добавляли 5 мл гипотонического раствора (0,55% KCI), перемешивали и инкубировали 25 мин. при комнатной температуре. Проводили префиксацию, добавляя в пробирку 0,5 мл фиксатора (этанол-ледяная уксусная кислота, 3:1), центрифугировали 10 мин. при 1000 об./мин., удаляли надосадочную жидкость, оставляя 0,3^0,5 мл над осадком. К осадку струйно приливали 5 мл холодного свежеприготовленного фиксатора (этанол-ледяная уксусная кислота в соотношении 3:1) и перемешивали. Фиксацию проводили при +4°С в течение 20 мин. Затем 2 раза меняли фиксатор, каждый раз центрифугируя клеточную взвесь в течение 10 мин. при 10ОО об./мин. и удаляя надосадочную жидкость. Время второй и третьей фиксации составляло 20 и 15 мин. соответственно. Раскапывание суспензии проводили на предметные стекла, охлажденные в воде при +4°С, нанося на препарат по 30^50 мкл суспензии с высоты 30^50 см. Стекла высушивали на воздухе при комнатной температуре.

После получения препаратов метафазных хромосом из ММСК и лимфоцитов периферической крови доноров проводили их окрашивание раствором Hoechst 33258 с последующим контрастированием актиноми-цином D и заключением препарата в раствор на основе цитратно-фосфатного буфера Мак-Ильвейна по стандартной методике. Препараты анализировали с помощью микроскопа LEICA DM LS, оборудованного объективами FLUOTAR х20/0,40 и х100/1,30^0,60, автоматической фотонасадкой и цветной камерой Leica DFC 320. Для получения фотоизображения использовали программное обеспечение Leica DFC Twain.

Кариотипирование ММСК и лимфоцитов периферической крови доноров проводили при разрешении 400^ 450 хромосомных сегментов на гаплоидный геном. Производили подсчет числа хромосом и анализ их структуры на 8^15 метафазных пластинках из ММСК после каждого пассажа, начиная с четвертого и заканчивая седьмым, и 11 —15 метафазных пластинках из лимфоцитов периферической крови каждого донора.

Исследование проведено с письменного информированного согласия доноров ММСК и лимфоцитов и одобрено этическим комитетом и ученым советом ГУ НИИ АГ им. Д.О. Отта РАМН.

Результаты

Первым этапом исследования был хромосомный анализ ФГА-стимулированных лимфоцитов периферической крови всех доноров, проведенный с целью исключения возможных конституциональных аномалий кариотипа. В результате кариотипирования ни у одного из доноров не было обнаружено метафазных пластинок с отличным от нормального числом хромосом, а также не установлено структурных изменений хромосом (рис. 2).

Вторым этапом исследования стал анализ кариотипа ММСК ранних пассажей и сопоставление его с таковым лимфоцитов тех же индивидов. Отметим, что фенотип популяции ММСК, использованной для карио-типирования, не изменился после размораживания и последующего культивирования и был определен как CD34-, CD45-, CD44 + , CD90 + , CD105 + , CD106 + (рис. 3). В результате цитогенетического анализа культур ММСК, проведенного после каждого пассажа, начиная с четвертого и заканчивая седьмым, не было вы- явлено изменений числа и структуры хромосом во всех исследованных метафазных пластинках (рис. 4). Во всех случаях был установлен нормальный кариотип, соответствующий кариотипу лимфоцитов периферической крови тех же индивидов (табл. 2).

Таким образом, в пассированных культурах ММСК доноров с нормальным конституциональным кариотипом, установленным при цитогенетическом анализе ФГА-сти-мулированных лимфоцитов, не было зарегистрировано клеток с измененным числом и/или структурой хромосом.

Обсуждение

Изучению кариотипа культур стволовых клеток (СК) — как региональных, так и эмбриональных, — уделяется все больше внимания в связи с активным развитием клеточных технологий и перспектив их применения в медицине. Тем не менее, из-за противоречивости накопленных результатов, полученных рядом авторов, единого мнения по вопросу сохранения стволовыми клетками нормального хромосомного набора при пассировании до сих пор не существует [8, 10, 15—17].

В настоящей работе установлен нормальный кариотип клеточных культур ММСК, полученных от здоровых доноров-добровольцев. В рамках выполненного цитогенетического анализа на ранних пассажах — с четвертого по седьмой — нами не было зарегистрировано клеток с аберрантными кариотипами, что позволяет предположить отсутствие в исследованных культурах ММСК аномальных клонов. В результате кариотипирования культур ММСК ни у одного из доноров не было выявлено полиморфных вариантов хромосом, что полностью соответствует кариотипу, установленному для ФГА-стимулиро-ванных лимфоцитов каждого донора. Проведенное нами исследование позволяет говорить об отсутствии межтка-невых различий кариотипа между ММСК ранних пассажей и лимфоцитами человека.

Результаты выполненного нами исследования согласуются с данными ряда авторов. ММСК, донорами которых были пациенты с нарушениями функций головного мозга, характеризуются нормальным кариотипом в первичной культуре и сохраняют его на ранних пассажах — с первого по третий [18]. На пассажах со второго по одиннадцатый в культурах ММСК, полученных от здоровых доноров, установлен нормальный кариотип [19]. Среди модельных объектов нормальный кариотип имеют СК, выделенные из мышечной ткани крыс [20], а также ММСК свиней, как в первичной культуре, так и при длительном пассировании [21].

В то же время результаты других исследований демонстрируют появление хромосомных аберраций в культурах как региональных, так и эмбриональных стволовых клеток (ЗСК) [8—10, 22—25]. Противоречивость литературных данных может быть обусловлена несколькими причинами. Одной из них являются собственно биологические свойства СК. Так, эмбриональные и региональные СК различаются по ряду характеристик, в основном касающихся выраженности степени специализации, способности к дифференцировке, пролиферации, ассиметричному делению и регенерации. При этом ЭСК, обладая более выраженным потенциалом к пролиферации, при культивировании в большей степени подвержены изменениям кариотипа, чем региональные СК, в том числе и мезенхимные (табл. 3).

Другой причиной противоречивости накопленных данных может быть применение авторами разных методик культивирования и пассирования СК. Так, в работах, где показано наличие хромосомных аберраций в культурах СК, в основном применяли методы энзиматического пассирования, а авторы, не обнаружившие аномалий кариотипа, применяли механическое пассирование, при котором селекция клеток основывается на их морфологических характеристиках [22, 23, 26, 28, 33]. Однако в нашей работе применялся именно метод энзиматического пассирования. Отметим, что на возникновение хромосомных перестроек и/или появление дополнительных хромосом в кариотипе СК, по крайней мере, отчасти, могут влиять реагенты, применяемые одними исследователями и не используемые другими. Не исключено, что для сохранения стабильности кариотипа СК требуется подбор особых условий культивирования и пассирования.

На возникновение аномалий кариотипа культуры СК могут также влиять индивидуальные особенности донора клеток. Так, известно, что употребление донорами ряда сильнодействующих лекарственных средств, в число которых входят цитостатические препараты, используемые при лечении онкологических заболеваний, в значительной мере повышает вероятность появления клеток с аберрантными кариотипами [34—38]. Сходный эффект может наблюдаться, если на момент получения биологического материала или незадолго до него донор перенес острое инфекционное заболевание [39— 40].

Вышесказанное позволяет предположить, что результаты работ, демонстрирующих аномальный кариотип в культурах ММСК, вероятно, могут объясняться условиями культивирования или индивидуальными особенностями доноров клеток. Разработанная нами схема эксперимента позволила учесть возраст и пол доноров ММСК, особенности их конституционального кариотипа, а также возможное влияние на результаты кариотипи-рования ММСК внешних факторов и состояния здоровья доноров. Несмотря на различные данные, касающиеся состояния здоровья доноров и применения ими лекарственных препаратов, цитогенетическое исследование лимфоцитов и ММСК во всех случаях позволило установить нормальный кариотип. Кроме того, полученные нами результаты являются подтверждением принципиальной возможности подбора условий пассирования, в которых хромосомный набор ММСК остается нормальным в течение шести пассажей.

Таким образом, результаты настоящего исследования подтверждают, что в использованных нами условиях культивирования и пассирования ММСК человека сохраняют нормальный конституциональный кариотип на ранних пассажах. Однако наши данные не позволяют предсказать возможности появления клонов клеток с числовыми и/или структурными аберрациями хромосом при более длительном пассировании культур, в связи с тем, что это требует увеличения числа проанализированных пассажей и метафазных пластинок. Возникновение аномалий кариотипа в культурах ММСК является серьезным препятствием для их применения в медицине из-за высокого риска появления нежелательных побочных эффектов. Поэтому для клеточных технологий допустимо использовать стволовые клетки только ранних пассажей. Тем не менее, мы считаем целесообразным для обеспечения безопасности применения ММСК кариотипировать их культуры непосредственно перед использованием в терапии для оценки стабильности хромосомного набора клеток.

Подняться вверх сайта