Поиск Кабинет

Сравнительный анализ остеогенного потенциала мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток слизистой оболочки полости рта и костного мозга

Гены & Клетки: Том IX, №1, 2014 год, стр.: 50-57

 

Авторы

Зорин В.Л., Зорина А.И., Еремин И.И., Бозо И.Я., Соловьёва Е.В., Хромова Н.В, Копнин П.Б.

ДЛЯ ТОГО ЧТОБЫ СКАЧАТЬ СТАТЬЮ В ФОРМАТЕ PDF ВАМ НЕОБХОДИМО АВТОРИЗОВАТЬСЯ, ЛИБО ЗАРЕГИСТРИРОВАТЬСЯ

Статья посвящена сравнительному анализу остеогенного потенциала мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК), выделенных из слизистой оболочки полости рта (десны) и костного мозга; исследованы иммунофенотип клеток, их пролиферативная активность и способность к дифференцировке в остеогенном направлении. При объединении ММСК с носителями из β-трикальцийфосфата изучен уровень адгезии клеток, характеризующий эффективность совмещения компонентов тканеинженерной конструкции; исследован остеоиндуктивный потенциал полученных тканеинженерных костных графтов при подкожной транспланции иммунодефицитным мышам.

Результаты исследования продемонстрировали, что, как в условиях in vitro, так и in vivo, существенных различий между ММСК десны и костного мозга в аспекте иммунофенотипического профиля и способности к остеогенной дифференцировке нет. Однако ММСК десны характеризуются несколько большими пролиферативной активностью и уровнем адгезии к поверхности гранул из β-трикальцийфосфата, что с учетом большей доступности их тканевого источника (биоптат слизистой оболочки полости рта) позволяет рассматривать данные клетки в качестве более оптимальной клеточной популяции для создания тканеинженерных костных графтов (по крайней мере на основе исследуемого носителя).

В практике хирургической стоматологии и челюстно-лицевой хирургии широко распространены патологические состояния, характеризующиеся формированием костных дефектов или убылью (атрофией) костной ткани челюстей [1–4]. План эффективного лечения пациентов в таких случаях включает использование остеопластических материалов в ходе хирургических вмешательств. Однако недостатки зарегистрированных на сегодняшний день и разрешенных для клинического применения остеопластических материалов, с одной стороны, вынуждают врачей использовать аутокостные трансплантаты, что также не лишено недостатков и ограничений, а с другой – побуждают специалистов к поиску альтернативных подходов [4].

Одним из активно развивающихся направлений современной биомедицинской науки является создание тканеинженерных конструкций, позволяющих за счет объединения матриксов-носителей и клеток создать полноценный и биосовместимый эквивалент костной ткани (графт) [5, 6]. При этом если перечень материалов, доступных для использования в качестве носителей, хорошо известен и включает различные аллогенные и ксеногенные костные матриксы, фосфаты кальция, гидроксиапатит, коллаген и пр., а также их комбинации, то клеточный компонент и технология его объединения с носителем остаются предметом активного обсуждения.

Придерживаясь мнения большинства исследователей о том, что оптимальной клеточной популяцией для создания тканеинженерных костных графтов являются мультипотентные мезенхимные стромальные клетки (ММСК), активно исследуемые уже более 50 лет с пионерских работ А.Я. Фриденштейна и сотрудников его лаборатории [7], наша исследовательская группа сосредоточила свои усилия на выборе их оптимального тканевого источника, разработке стандартизированной технологии по выделению и применению ММСК для создания тканеинженерных конструкций, а также сравнению их с «золотым стандартом» – ММСК костного мозга.

Среди многочисленных источников ММСК наиболее доступным для врача стоматолога или челюстно-лицевого хирурга является слизистая оболочка полости рта, биопсия которой является безопасной, простой и легко переносимой пациентом процедурой, в то время как эксплантация костного мозга или липоаспирация требуют более инвазивного вмешательства, наличия специальных навыков и характеризуются большей частотой осложнений. В этой связи, целью данного исследования являлась сравнительная оценка морфофункциональных характеристик и остеогенного потенциала ММСК, полученных из костного мозга и слизистой оболочки полости рта (десны), in vitro и in vivo, в том числе в составе тканеинженерных костных графтов, изготовленных при объединении клеток с носителями из β-трикальций фосфата (Cerasorb, CurasanAG, Германия).

Материал и методы

Дизайн исследования

Исследование состояло из двух последовательных этапов. В ходе первого получали культуры ММСК из костного мозга и слизистой оболочки полости рта, определяли иммунофенотип клеток, оценивали пролиферативную активность и способность к дифференцировке в остеогенном направлении. Кроме того, при объединении ММСК с носителями из β-трикальцийфосфата оценивали уровень адгезии клеток, характеризующий эффективность совмещения компонентов тканеинженерной конструкции. На втором этапе исследовали остеоиндуктивный потенциал полученных тканеинженерных костных графтов в стандартной модели гетеротопического остеогенеза – подкожная транспланция иммунодефицитным мышам.

Получение культуры ММСК костного мозга

После подписания здоровым донором (мужчина, возраст 31 год) добровольного информированного согласия, в условиях операционной под местной анестезией раствором Lidocaini 1,0% (10 мл) выполнялась пункция подвздошной кости с аспирацией красного костного мозга в объеме 20 мл по стандартной методике. Эксплантированный материал помещали в стерильные промаркированные пробирки (BD Falcon, США) содержащие гепарин (100 ЕД/мл).

Выделение фракции мононуклеарных клеток (МНК) проводили в градиенте плотности (Lympholite H, Cedarlane, Канада) по стандартной методике. Затем МНК переносили в культуральные флаконы (150 см2, BD Falcon, США) в количестве 1,5×105 кл/см2 и культивировали в питательной среде MesenCult (Stem Cell Technologies, Канада). При достижении 70–80% конфлюэнтности монослоя клетки снимали 0,25% раствором Trypsin/EDTA (Stem Cell Technologies, Канада), ресуспендировали и рассевали в плотности не менее 3–5×103 кл./см2. Каждые 3 сут проводили смену среды. Для дальнейших исследований использовали клетки третьего пассажа.

Получение культуры ММСК десны

Забор биоптата. После подписания здоровыми донорами (n = 20, женщиныи мужчины, средний возраст 36±2 лет) добровольного информированного согласия, в условиях хирургического стоматологического кабинета под местным проводниковым обезболиванием раствором Ultracaini (1,7 мл) выполнялась биопсия слизистой оболочки полости рта в ретромолярной области. Биоптаты диаметром 2–3 мм помещали в стерильные пробирки (BD Falcon, США) с транспортировочной питательной средой (a-MEM, 2% FBS (HyClone, США), 200 ед/мл пенициллина, 200 мг/мл стрептомицина, 200 ед/мл амфотерицина (Stem Cell Technology, Канада), маркировали и доставляли в течение 2 ч при температуре +4°С в лабораторию.

Получение клеточной культуры ММСК десны. Полученный в клинике биоптат десны промывали в питательной среде a-MEM, дополненной антибиотиком (гентамицин, 50 мкг/мл). Фрагмент переносили в 15 мл пробирку (BD Falcon, США) с питательной средой a-MEM (HyClone, США), с антибиотиком гентамицином в концентрации 20 мкг/мл, 10% FBS), 0,05% коллагеназой II типа (Sigma, США) и инкубировали ночь при температуре 37°С. Полученную суспензию клеток пипетировали с последующим центрифугированием при 200 g в течение 10 мин. Клеточный осадок ресуспендировали в питательной среде a-MEM (HyClone, США), содержащей гентамицин 20 мкг/мл, 10% FBS HyClone, США), и рассевали с плотностью 3–5×104/см2 в культуральные флаконы (NUNC, Дания). ММСК десны культивировали при 37°С и 5% СО2, смену среды проводили каждые 3–4 сут, культуры пассировали при достижении 70–80% конфлюэнтного монослоя. Визуальный контроль роста и морфологии культуры проводили с помощью фазово-контрастной микроскопии. Для исследований использовали клеточные культуры третьего пассажа.

Все вышеописанные процедуры проводили согласно зарегистрированной Федеральной службой по надзору в сфере здравоохранения новой медицинской технологии: «Забор, транспортировка, выделение, культивирование, криоконсервация, хранение и клиническое применение фибробластов слизистой оболочки полости рта для лечения пациентов с рецессиями слизистой оболочки и дефицитом десны в области зубов и зубных имплантатов», ФС № 2010/419, от 09 декабря 2010.

Определение времени удвоения клеточных популяций

ММСК костного мозга и десны по 1×104 кл./cм2 рассевали в культуральные флаконы и инкубировали до формирования 90% монослоя. Подсчет клеток проводили в камере Горяева. Время удвоения популяции ( ) на 1, 2 и 3 пассажах оценивали по формуле:

где – время удвоения клеточной популяции на пассаже p; Тк – длительность культивирования пассажа в часах; N0 – исходное количество клеток; Nк – число клеток через Тк. В качестве оценочного параметра использовали среднее арифметическое от полученных на трех пассажах значение – T2:

Иммунофенотипический анализ ММСК Полученные клеточные культуры (третий пассаж) высевали на покровные стекла и после 2 сут. культивирования проводили иммунофлуоресцентный анализ. Экспрессию белков, характерных для клеток мезенхимального ряда, – коллагена I, III типов, эластина и виментина – определяли, используя первичные моноклональные и вторичные антитела, меченые Alexa488 (Invitrogen, США). Клетки визуализировали посредством микроскопа Axioplanтм 200 с камерой AxiocamтмHRm, используя программное обеспечение AxioVisionтм (Carl Zeiss, Германия). Для цитофлуориметрического анализа клеточные культуры фиксировали параформальдегидом и применяли флуоресцентные антитела к CD34PE, CD45FITC, CD73PE, CD90APC,CD324FITC, цитокератинам 14, 15, 16, 19 (BDPharmingenтм), CD105 Alexa488 (Invitrogen, США), согласно рекомендациям производителей. Экспрессию антигенов определяли на цитофлуориметре FACS Cantoтм II c программным обеспечением «FACSDivaтм» (BD, США). Индуция остеогенной дифференцировки in vitro Для остеогенной дифференцировки клетки рассевали в концентрации 4×103/см2 и культивировали до достижения ими конфлуэнтного монослоя. Затем среду культивирования заменяли на α-MEM, 10% FBS с добавлением компонентов, индуцирующих остеогенную дифференцировку (Human mesenchymal stem cell functional identification kit, R&D Systems, США): 10нМ дексаметазона, 10 мМ β-глицерофосфата и 0,2 мМ аскорбиновой кислоты (AК). Критерием остеогенной дифференцировки служили образующиеся преципитаты солей кальция, которые идентифицировали цитохимически посредством окраски 2% раствором Alizarin Red S (Sigma, США). Экспрессию синтезируемого клетками «остеогенного» белка – остеокальцина – выявляли иммуноцитохимическим анализом, используя в качестве первичных антител мышиные антитела к остеокальцину человека и в качестве вторичных – антитела, меченные флуорофором Alexa488 (Human mesenchymal stem cell functional identification kit, R&D Systems, США). Экспрессию остеокальцина анализировали под микроскопом Axioplan™ 200 с камерой Axiocam™HRm, используя программное обеспечение AxioVision™ (Carl Zeiss, Германия).

Для определения степени потенциального участия носителя из β-трикальцийфосфата в регуляции остеогенной дифференцировки ММСК, культуры ко-инкубировали с гранулами носителя, а в качестве остеогенных индукторов использовали только дексаметазон и аскорбиновую кислоту, без β-глицерофосфата. Результат оценивали с помощью иммунофлуоресцентной реакции с антителами к остеокальцину.

Оценка уровня адгезии клеток

Для контроля адгезии клеток к поверхности гранул носителя, а также сравнительной оценки клеточных типов по данному показателю культуры инфицировали лентивирусным вектором с геном зеленого флуоресцентного белка (GFP). Вирусные инфекционные частицы получали путем трансфекции GFP-содержащей генно-инженерной конструкции совместно с вспомогательными плазмидами pLP1, pLP2 и pLP/VSVG (Invitrogen, США) клеток-продуцентов линии 293FT при помощи реагента Lipofectamine (Invitrogen, США). Флуоресцентный анализ GFPсодержащих клеток, иммобилизованных на носителе, проводили при помощи планшетного мультифункционального ридера SpectraMaxE5 (Molecular Devices, США) с программным обеспечением производителя.

Получение тканеинженерных костных графтов Клетки снимали с поверхности культурального пластика посредством 0,25% Trypsin/EDTA (Stem Cell Technologies, Канада), ресуспендировали, наносили на гранулы β-трикальцийфосфата (Cerasorb, CurasanAG, Германия) диаметром 150–200 мкм из расчета 2×107 клеток на 1 г носителя и инкубировали в культуральной среде в течение 24 ч. Перед трансплантацией in vivo гранулы носителя с клетками трижды отмывали от культуральной среды буферным раствором Хенкса.

Оценка остеоиндуктивного потенциала in vivo Все манипуляции с лабораторными животными были выполнены с соблюдением международных правил гуманного обращения с животными. Иммунодефицитные мыши (n = 10) линии BALB/c-nu (FMMU Medical Laboratory Animal Center, США) были разделены на две равные группы в соответствии с клеточным компонентом трансплантируемых им тканеинженерных костных графтов – ММСК десны или костного мозга. После премедикации и антисептической обработки операционного поля тканеинженерные конструкции (50 мг в 200 мкл раствора Хенкса) инъецировали подкожно в проекции широчайшей мышцы спины. Животных выводили из эксперимента через 30 сут после операции, ткани из области введения материалов удаляли единым блоком, фиксировали в 4% растворе нейтрального формальдегида в течение 24 ч, после чего из них изготавливали гистологические препараты с применением гистохимических (окраска гематоксилином и эозином) и иммуногистохимических методов (выявление остеокальцина и CD34+-эндотелиальных клеток). Для селективного выявления остеокальцина в гистологических срезах использовали первичные антитела мыши (R&D Systems, США) и Animal research kit (Dako, Дания); для определения CD34+-эндотелиальных клеток – первичные антитела крысы (BD, США), соответствующие им вторичные биотинилированные антитела (BD, США) и меченный пероксидазой стрептавидин (Dako, Дания), согласно инструкциям производителей.

Количественный анализ интенсивности иммуногистохимического окрашивания проводили в каждом случае на 5 срезах, в 25 полях зрения в каждом, используя программное обеспечение Image Software (Carl Zeiss, Германия).

Cтатистический анализ

Для статистической обработки полученных данных применяли описательные методы (определение среднего значения, стандартного отклонения, стандартной ошибки среднего значения, доверительного интервала), критерий Шапиро – Уилка для выявления соответствия распределения признаков закону нормального распределения, а также U-критерий Манна – Уитни для сравнения двух независимых групп при статистической значимости различий p<0,05, используя программное обеспечение GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software).

Результаты и обсуждение

Сравнительная характеристика ММСК десны и костного мозга in vivo

Пролиферация. Выявлена существенная разница в скорости пролиферации клеток. Так, при культивировании в описанных условиях, время удвоения культуры ММСК десны составило 36±2 ч, тогда как удвоение ММСК костного мозга происходило за 55±3 ч, что согласуется с результатами Q. Zhang с соавт. (2009) [8].

Иммунофенотип. Иммунофенотипический анализ клеточных культур показал, что ММСК десны и костного мозга характеризовались сходной морфологией и профилем экспрессии основных белков (рис. 1), и поверхностных антигенов, характерных для мезенхимальных клеток (табл. 1).

Так, оба типа клеток характеризовались наличием маркеров ММСК (CD73, CD90, CD105), экспрессией внутриклеточных белков фибробластов (коллаген I и III типов, эластин, виментин), отсутствием продукции эпителиальных (CD324, цитокератины 14, 15, 16, 19) и гемопоэтических (CD34, CD45) маркеров.

Остеогенная дифференцировка. При культивировании ММСК десны и костного мозга в культуральной среде с остеоиндуцирующими факторами во всех исследуемых клеточных культурах было отмечено изменение формы клеток за счет уменьшения длины и количества отростков. В ходе цитохимического анализа с использованием Alizarin Red выявлено отложения солей кальция во внеклеточном матриксе, что соответствует результатам других исследований [9, 10] (рис. 2).

Случаев спонтанной остеогенной дифференцировки клеток в контрольных культурах (культуральная среда α-MEM с 10% FBS без остеоиндуцирующих компонентов) не отмечалось. Таким образом, ММСК как десны, так и костного мозга характеризовались выраженной способностью к дифференцировке в остеогенном направлении.

Полученные нами данные относительно пролиферативной активности, иммунофенотипа и остеогенного потенциала ММСК десны согласуются с результатами исследований B.J. Fournier с соавт. (2010), которые из первичной культуры мезенхимальных клеток слизистой оболочки полости рта (обозначенных ими термином «фибробласты») с использованием техники колониеобразования выделили субпопуляцию клеток, характеризовавшихся высокой пролиферативной активностью, экспрессией CD29, CD44, CD73, CD90, CD105 в сочетании с отсутствием гемопоэтических маркеров (CD34, CD45), а также способностью к дифференцировке в трех ортодоксальных направлениях [11], то есть соответствовавших общепринятым критериям ММСК [12].

Авторы, по примеру предыдущих исследований [8], назвали выделенные ими клетки «мультипотентными прогениторными клетками десны», которых оказалось около 3% от общего количества мезенхимальных клеток в первичной культуре. При этом «истинные» фибробласты, составлявшие большую часть первичной культуры, обладали низкой пролиферативной активностью и не дифференцировались в остео-, адипо- и хондрогенном направлениях. С использованием аналогичной техники колониеобразования L. Tang с соавт. (2010) выделили популяцию ММСК из первичной культуры «мезенхимных клеток десны» [13]. По результатам же наших исследований, учитывая данные исследований B.J. Fournier и L. Tang и классические представления отечественной гистологической школы [14, 15], можно заключить, что (даже без селекции колониеобразующих клеток) в ходе культивирования in vitro в первичной культуре фибробластоподобных клеток, выделенных из десны человека, можно получить активно пролиферирующие ММСК, способные дифференцироваться в остеогенном, а также, как нами ранее было показано [16], в хондро- и адипогенном направлениях.

Стандартные протоколы индукции остеогенной дифференцировки in vitro включают применение дексаметазона, аскорбиновой кислоты и β-глицерофосфата, которые входят в состав коммерчески доступных наборов реактивов, таких как Human mesenchymal stem cell functional identification kit. Известно, что дексаметазон в концентрации 10 нM усиливает транскрипцию генов, ответственных за проявление клеткой «остеогенного фенотипа» [17, 18]. Глицерофосфат, гидролизуемый щелочной фосфатазой, служит основным источником фосфата, необходимого для минерализации матрикса [7]. Аскорбиновая кислота играет важную роль в аккумуляции кальция и синтезе компонентов внеклеточного матрикса [19, 20]. В этой связи, значительный интерес представляла оценка способности ММСК десны и костного мозга дифференцироваться в остеогенном направлении при замене источника фосфата в культуральной среде. Было показано, что обе популяции ММСК, культивируемые в присутствии дексаметазона, аскорбиновой кислоты и гранул β-трикальцийфосфата (вместо β-глицерофосфата), сохраняли пролиферативный потенциал и в равной степени продуцировали белок остеобластов остеокальцин (рис. 3).

Таким образом, гранулы выбранного нами носителя вовлекались в регуляцию дифференцировки клеток в остеогенном направлении, что служит дополнительным фактором, предопределяющим потенциальную эффективность разработанных тканеинженерных конструкций в обеспечении репаративного остеогенеза.

Совмещение клеток с носителем.

Прижизненный флуоресцентный анализ экспрессирующих GFP клеток, адгезированных к поверхности гранул β-трикальцийфосфата, показал, что количество прикрепившихся ММСК десны было приблизительно на 20% большим, чем ММСК костного мозга (рис. 4). С использованием обоих типов клеток были получены тканеинженерные конструкции в достаточном для последующих исследований in vivo количестве. Результаты исследования in vivo. У животных после трансплантации исследуемых материалов не было обнаружено ни одного случая осложнений. Все прооперированные животные прожили до срока выведения из эксперимента.

Регенерат, сформировавшийся в области введения тканеинженерных конструкций, был образован рыхлой волокнистой соединительной тканью, окружавшей гранулы носителей. Достоверных признаков репаративного остеогистогенеза в виде участков ретикуло-фиброзной костной ткани как в случае ММСК десны, так и ММСК костного мозга, выявлено не было (рис. 5).

Однако при иммуногистохимическом исследовании в регенерате выявлялся остеокальцин – продукт синтетической активности клеток остеобластического ряда, что подтверждает дифференцировку ММСК тканеинженерных конструкций или клеток реципиентного ложа под влиянием введенных материалов в остеогенном направлении. При этом, значимой разницы между количеством выявленного остеокальцина в случаях ММСК десны или костного мозга установлено не было. Более того, активность ангиогенеза, характеризующаяся степенью развития гемомикроциркуляторного русла в тканях регенерата, в обеих группах не отличалась (рис. 6).

Заключение

Таким образом, как в условиях in vitro, так и in vivo нами не выявлено существенных различий между ММСК десны и костного мозга в аспекте иммунофенотипического профиля и способности к остеогенной дифференцировке. Однако ММСК десны характеризовались несколько большими пролиферативной активностью и уровнем адгезии к поверхности гранул из β-трикальцийфосфата, что с учетом большей доступности их тканевого источника (биоптат слизистой оболочки полости рта) позволяет рассматривать данные клетки в качестве более оптимальной клеточной популяции для создания тканеинженерных костных графтов (по крайней мере на основе исследуемого носителя).

Подняться вверх сайта