Поиск Кабинет

Сравнительное протеомное картирование опухолевых стволовых клеток, выделенных из глиобластомы линии u87, нейрональных стволовых и мультипотентных мезенхимных стромальных клеток человека: от каталогизации клеточных белков к инновационной парадигме протеом-основанной клеточной терапии опухолей

Гены & Клетки: Том VIII, №2, 2013 год, стр.: 85-92

 

Авторы

Брюховецкий А.С., Шевченко В.Е., Чехонин В.П., Брюховецкий И.С., Ковалев С.В., Баклаушев В.П., Давыдов М.И.

ДЛЯ ТОГО ЧТОБЫ СКАЧАТЬ СТАТЬЮ В ФОРМАТЕ PDF ВАМ НЕОБХОДИМО АВТОРИЗОВАТЬСЯ, ЛИБО ЗАРЕГИСТРИРОВАТЬСЯ

Проведено протеомное картирование и биоинформа ционный анализ лизатов нейральных (CD133+) стволовых клеток (НСК), выделенных из обонятельной выстилки носа человека, мультипотентных мезенхимных стромальных клеток (CD29+, CD44+, CD73+, CD90+, СD34–) (ММСК), полученных из костного мозга человека, и опухолевых (CD133+) стволовых клеток (ОСК), изолированных из культуры клеточной линии U87 глиобластомы человека (глиомасферы). Идентифицированы 1664 белка в изучен ных лизатах стволовых клеток, из которых 1052 белка (63,2%) идентичны в НСК и ОСК и 607 белков (36,47%) подобны в ММСК и ОСК. Остальные белки в ОСК глио бластомы U87 являются онкоспецифичными или связан ными с процессами канцерогенеза. Для белков, присут ствующих во всех трех протеомах, с помощью баз данных PubMed, PANTHER, Gene Ontology и KEGG провели анно тирование биологических процессов, молекулярных функ ций, клеточной локализации и сигнальных путей белков. Выявили, что в глиомасферах глиобластомы линии U87 только 10 внутриклеточных путей сигнальной трансдукции практически не изменены неопластическим процессом, и только 2 из них (путь интегринов и путь фокальной ад гезии) доступны для регуляторного воздействия на гены мишени в ядре ОСК. Мембранные белки неизмененных канцерогенезом внутриклеточных путей сигнальной транс дукции и гены, кодирующие белки этих путей в ОСК глио бластомы линии U87, могут рассматриваться в качестве основных целей для регуляторного воздействия на ОСК. Предложена инновационная концепция протеом-основан ной клеточной терапии опухолей.

После завершения в 2005 г. глобального и амби циозного международного проекта «Геном человека»[1, 2] стало очевидно, что, несмотря на получение огромного количества фундаментальных знаний о молекулярном устройстве человеческого генома, эти знания, к сожалению, не позволили ответить на основные вызовы современной медицинской науки и практического здравоохранения, а также предло жить эффективные инновационные стратегии тера пии основных болезней цивилизации (рак и другие злокачественные опухоли, диабет, СПИД, ожире ние, дегенеративные нервные болезни и т.д.)[3, 4]. Все взоры передовой научной общественности от геномики повернулись в сторону инновационных технологий многомерной биологии: протеомики, ме таболомики, РНомики, секретомики и т.д.[4]. На ступившую эру ученые назвали постгеномной[5] и предложили создать не менее грандиозный между народный проект «Протеом человека», в рамках которого исследователи попытаются картировать и изучить функции всех белков, имеющихся в клетках эукариот[6, 7]. Страны-участницы будущего проекта «Протеом человека» уже распределили объемы ра бот в будущих исследованиях[8, 9] и России пред ложили участие в нем по изучению белков, кодиру емых генами 18 хромосомы[5, 10]. Однако пока не очень понятны прикладные цели использования этой новой «протеомной» информации в медицине и, крайне важно, чтобы эта генерация знаний имела изначально не только фундаментальное, но и четкое прикладное значение для практического здравоох ранения. Необходимо помнить, что новые знания в области протеомики, с одной стороны, не должны формировать необоснованных надежд у врачей и не создавать иллюзий о протеомике, как панацее. С другой стороны, необходимо понимать, что только протеомные исследования способны с инновацион ных биотехнологических и информационных позиций предоставить уникальные знания о молекулярных механизмах патогенеза большинства неизлечимых болезней цивилизации. Протеомика не должна по вторить методологических ошибок геномики. По этому при организации и планировании протеомных исследований, включающих ткани, клетки и биоло гические жидкости (кровь, плазма, лимфа, ликвор и т.д.) целесообразно понимать, как будет в даль нейшем использована эта информация в диагности ческих, прогностических или терапевтических целях [8, 9].

Целью исследования являлось проведение про теомного картирования лизатов глиомасфер, выделенных из глиобластомы линии U87, и сравнение их с клеточными белками, обнаруженными в протеомах нейральных стволовых клеток (НСК) и мультипо тентных мезенхимных стромальных клеток (ММСК) нейроонкологических пациентов (контроль нормы), для выявления специфичной неопластической про теомной структуры опухолевых стволовых клеток (ОСК), диагностики и анализа внутриклеточных пу тей сигнальной трансдукции (ВКПСТ) в ОСК, не по страдавших в процессе канцерогенеза, а также по иск мембранных белков – мишеней ВКПСТ ОСК для проведения регуляторного целенаправленного воз действия на эффекторные функции ОСК в клеточной терапии опухолей.

Материал и методы

Методика получения клеток

После получения письменного информированного согласия нейроонкологических пациентов экспланта цию костного мозга проводили методом пункции гру дины или подвздошной кости в условиях процедур ного кабинета под местным обезболиванием либо в условиях операционной под наркозом с максимально возможным соблюдением стерильности. Минималь ный объём костного мозга для выделения ММСК – 5 мл. Пунктат костного мозга сразу же помещали в стерильную пробирку типа «Vacuette», содержащую антикоагулянт (Na2ЭДТА).

Выделение и культивирование ММСК. ММСК выделяли из костного мозга методом, описанным ранее[11]. Образец костного мозга ресуспенди ровали в среде RPMI-1640, cодержащей 10% эм бриональной телячьей сыворотки и 1% раствора пенициллина-стрептомицина. Культивирование про водили во флаконах Т150, при 37°С, в атмосфере 5% CO2. Через 4–5 сут. удаляли среду с не прикре пившимися клетками, заменив ее свежей средой. Прикрепившиеся клетки культивировали до дости жения 80% конфлюэнтности, затем пассировали из расчета 1:3. Смену культуральной среды проводили каждые 3 сут. ММСК характеризовали с помощью проточной цитометрии по экспрессии поверхностных антигенов: CD29+, CD44+, CD73+, CD90+, СD34–.. Выделение и культивирование ОСК. Стволовые клетки опухоли мозга выделяли из культуры клеток глиобластомы человека U87 методом, описанным ранее[12]. Клетки глиобластомы U87 суспенди ровали с помощью раствора диспазы/коллагеназы (Roche) (Dispase, 0,8 U/ml PBS; Collagenase, 0,1 U/ ml PBS; инкубация 1 ч, 37°С). Затем инактивирова ли энзиматическую реакцию EDTA, центрифугировали 5 мин. при 800 g. Ресуспендировали клетки опухоли в среде, применяемой для образования нейросфер (DMEM/F12; L-glutamine; B27; bFGF, 20 ng/ml; EGF, 20 ng/ml; Penicillin/Streptomycin, 100 U/ml; Heparin, 5 μg/ml). Культивирование проводили во флаконах Т75, при 37°С, в атмосфере 5% CO2. Добавление свежих ростовых факторов проводили каждые 3 сут. Прикрепившиеся клетки культивировали до дости жения 80% конфлюэнтности, затем пассировали из расчета 1:3. При достижении достаточного общего количества клеток проводили селекцию CD133+ клеток методом иммуносортинга с использованием магнитных шариков с иммобилизованными на них антителами к CD133 (Miltenyi Biotec). После это го культивировали CD133+-клетки в той же среде. «Чистоту» культуры оценивали с помощью проточной цитометрии с антителами к CD133.

Выделение НСК. После получения письменного информированного согласия пациента, эндоскопи чески забирали фрагмент 1×1 см обонятельной вы стилки из верхнего носового хода. НСК выделяли из эксплантированного фрагмента обонятельного эпителия по методике, описанной ранее, с исполь зованием иммуносепарации на магнитных шариках по CD133[13, 14]. Клетки культивировали в среде DMEM c 10% FBS и коктейлем ростовых факторов (Invitrogen, США) до образования цитосфер. Клетки цитосфер характеризовали по экспрессии нестина, Thy1, NF200 и GFAP с помощью иммуноцитохимиче ского анализа.

Протеомные исследования

Анализ литературных данных показал, что для картирования протеома НСК, ММСК, а также ОСК линии глиобластомы человека U87 чаще использо вались методы двумерного гель-электрофореза[15– 19] или жидкостной хроматографии[20–24] в со четании с масс-спектрометрией. Гель-электрофорез больше подходит для выявления дифференциально экспрессированных белков, чем для картирования протеома, поэтому мы остановились на комбинации высокоэффективной жидкостной хроматографии и масс-спектрометрии (ВЭЖХ-МС). Использование двумерной хроматографии позволяет идентифици ровать порядка 1000 белков в образце (от 867[22] до 1002[18]), поэтому мы выбрали использовавшу юся в цитируемых работах методологию двумерного разделения триптических петидов на катионообмен ной, а затем обращено-фазовой колонке. Для оценки изменения экспрессии уровней белков мы исполь зовали метод label-free, так как он не требует про ведения дополнительных стадий мечения пептидов, и показано, что он дает корректные количественные результаты для стволовых клеток[22, 23]. Получили клетки, замороженные в малом количестве фосфат ного буфера (PBS). После размораживания клетки подвергли лизированию при помощи Mammalian Cell Lysis Kit Sigma.

Лизирование полученных клеток. Готовили 1 мл лизирующего буфера. Для этого смешивали 200 мкл буфера (250 мМ Tris-HCl, pH 7.5, 5мМ EDTA); 200 мкл 750 мМ NaCl; 200 мкл 0,5% SDS (Lauryl sulfate); 200 мкл 2,5% DOC (Deoxycholic acid); 200 мкл 5% Igepal; 10 мкл коктейля ингибиторов протеаз. Все процедуры выполнялись при температуре 4°С. К клеткам добавляли 1 мл лизирующего буфера. Инкубировали в течение 15 мин. в охлаждаемом шейкере Eppendorf Thermomixer Comfort. Центрифу гировали в течение 1 ч в охлаждаемой центрифуге Eppendorf Centrifuge 5415 F. Супернатант отбирали для дальнейшего исследования.

Очистка от низкомолекулярных соединений. По лученные в результате лизиса образцы очищали от низкомолекулярных соединений при помощи Agilent Spin Concentrators for Proteins 5 kDa. Образец вносили в концентратор и центрифугировали при 2000g до того момента, как в резервуаре останется 200 мкл жидкости. Добавляли в концентратор 4 мл воды (Mili-Q) и снова центрифугировали. Такую про мывку производили трижды. Полученные 200 мкл образца отбирали. Дополнительно образец смывал ся с концентратора дважды по 200 мкл воды (Mili-Q). Полученные в итоге 600 мкл образца использовали для дальнейшего исследования – измерения общего белка по методу Бредфорд. Рассчитывали количе ство лизата, в котором содержится 300 мкг белка, и выпаривали досуха при 60°С в вакуумном испари теле CentriVap.

Энзиматический гидролиз (трипсинолиз) образ цов. К высушенным лизатам добавляли по 25 мкл трифторэтанола, по 25 мкл 100 мМ водного рас твора NH4HCO3 и по 2 мкл свежеприготовленного 50 мМ водного раствора трис-(2-карбоксиэтил)фос фина (TCEP). Реакционную смесь выдерживали 1 ч при температуре 60°С, затем охлаждали до 25°С, до бавляли по 1 мкл свежеприготовленного 84 мМ во дного раствора иодацетамида, и выдерживали 30 мин при 25°С, после чего добавляли по 100 мкл 100 мМ раствора NH4HCO3, по 300 мкл воды и раствор трип сина в 1 мМ соляной кислоте (концентрация трипсина 100 нг/мкл, соотношение трипсин:белок – 1:50 по весу) и выдерживали 18 ч при 37°С. По 3 мкл рас творов анализировали масс-спектрометрически для контроля проведения трипсинолиза. По окончании реакции содержимое пробирок выпаривали досуха при 60°С на центрифужном испарителе.

Разделение триптических пептидов. Триптические пептиды растворяли в 60 мкл фазы А (30% ацето нитрила, 70% воды, 0,1% муравьиной кислоты, рН 2,7) и разделяли на хроматографе Dionex Ultimate 3000, снабженном коллектором фракций, на кати онообменной колонке MIC-10-CP (материал Poros 10S, 1 мм × 10 см, Dionex). Объем инжектируемой пробы 20 мкл, поток растворителя 30 мкл/мин, тем пература колонки 25°С, детекция по УФ-поглощению при длине волны 214 нм. Растворители: мобильная фаза А – 30% ацетонитрила, 70% воды, 0,1% му равьиной кислоты, мобильная фаза В – мобильная фаза А + 500 мМ KCl. Градиент: 0–10 мин – 0% В, 10–100 мин – 0–30% В, 100–114 мин – 30–100% В, 114–119 мин – 100% В, затем уравновешивание колонки в течение 35 мин на фазе А. Собирали 20 фракций со 2 по 122 мин через равные промежутки времени в 6 мин. Полученные фракции выпаривали до 100 мкл при 60°С на центрифужном испарителе Eppendorf Concentrator 5301 (Германия).

Масс-спектрометрический анализ. Анализ трип тических пептидов проводили на нанопроточном жид костном хроматографе Dionex Ultimate 3000 (Dionex, Нидерланды) в сочетании с масс-спектрометром LTQ Orbitrap XL (Thermo) с источником ионизации NSI. Разделение пептидов осуществляли на колонке Acclaim C18 PepMap100 (75 мкм × 150 мм, раз мер зерна 3 мкм, Dionex), снабженной предколонкой. Образец (20 мкл) загружали на предколонку на 1 мин в 99% воды/1% ACN/0,1% муравьиной кис лоты, затем отмывали от соли 4 мин 0,05% раство ром трифторуксусной кислоты в воде, и еще 1 мин уравновешивали 99% воды/1% ACN/0,1% муравьи ной кислоты, проток 20 мкл/мин. Условия хромато графирования: проток 0,3 мкл/мин, мобильная фаза А – 98% воды/2% ACN/0,1% муравьиной кислоты, мобильная фаза В – 20% воды/80% ACN/0,08% муравьиной кислоты. Градиент: 0–6 мин – 0% В, 6–120 мин – 0–50% В, 120–150 мин – 50–100% В, 150–165 мин – 100% В, 165–170 мин – 100 0% В, полное время анализа 175 мин. Масс спектры регистрировали в режиме положительных ионов в диапазоне m/z 300-2000 Да, напряжение на игле – 1,7 кВ, температура источника 200°С, напряжение на капилляре 43 В, на линзе 165 В. МС спектры регистрировали в орбитальной ловушке в режиме FT (разрешение 60 тыс., число накапли ваемых ионов 1×106, максимальное время накопле ния – 700 мс, 1 микроскан), МС/МС спектры по лучали при ионизации, обусловленной соударения ми (CID) в линейной ловушке (режим сканирования Enhanced, число накапливаемых ионов 50 тыс., максимальное время накопления – 500 мс, 3 микроскана, энергия соударений 35% от макси мальной). МСМС спектры регистрировались для 7 самых интенсивных ионов. Динамическое исклю чение включалось после регистрации 1 спектра, время исключения – 1 мин. Вторичной фрагмента ции подвергали ионы с зарядом больше +1. Анализ данных. Для идентификации белков масс спектры конвертировали программой Proteome Discoverer 1.0 (Thermo, США) в mgf файлы с помо щью программного шаблона WF_Spectrum_Export_ MGF c настройками по умолчанию за исключением диапазона времени удерживания (0–180 мин). По иск белков проводили на локальном сервере с по мощью программы Mascot Server 2.3.02 (Matrix Science, Великобритания). Параметры поиска: база данных NCBInr (версия от 25.01.2012 г.), вид – Homo Sapience, энзим – трипсин, число пропущен ных разрывов 2, фиксированные модификации – карбамидометилирование, возможные модифика ции – ацетилирование N-конца белка и окисленный метионин, остальные модификации проверялись с помощью метода error tolerant search. Точность масс родительского иона 10 ppm, фрагментов 0,8 Да; прибор Ion Trap. Идентифицированные белки сортировали по MudPIT score, отображали пептиды на уровне значимости p<0,05. Полученные списки идентифицированных белков вместе с хромато масс-спектрами загружали в программу Skyline 1.2.0.3303, и получали площади пиков пептидов в каждой пробе. Затем суммировали площади всех пиков идентифицированных пептидов каждого белка и нормализовывали относительно полной площади всех идентифицированных белков в пробе.

Результаты

После проведения лизиса количество обще го белка в лизатах составило: НСК (Sample01) – 2032±85 мкг/мл; ОСК из глиобластомы линии U87 (Sample02) – 2150±360 мкг/мл; ММСК костного мозга (Sample03) – 3198±281 мкг/мл. Для про ведения трипсинолиза брали по 150 мкл лизатов Sample01 и Sample02 и 100 мкл Sample03, трипсин добавляли в соотношении 1:50 по массе, т.е. Sample01 – 305 мкг белка, 61 мкл раствора трип сина, Sample02 – 323 мкг белка, 64,5 мкл раство ра трипсина, Sample03 – 320 мкг белка, 64 мкл раствора трипсина. Полноту проведения трипси нолиза контролировали масс-спектрометрически по наличию пиков триптических пептидов, а также по площадям пиков с m/z 842.51 Да и 421,76 Да. Триптические пептиды разделяли на катионообмен ной колонке SCX, для разделения использовали по 50 мкг триптических пептидов. Далее анализировали по 20 катионоообменных фракций каждого образца. Обработка данных ВЭЖХ-МС/МС с помощью про граммы Mascot Server позволила идентифицировать 1664 уникальных белка во всех пробах. В результате дальнейшей обработки данных программой Skyline были определены уровни: в Sample01 – 1447 белков по 11176 пептидам (диапазон молекулярных весов белков от 3,53 до 3908,10 кДа); в Sample02 – 1225 белков по 13674 пептидам (диапазон молекулярных весов белков от 4,60 до 3908,10 кДа); в Sample03 – 842 белков по 10932 пептидам (диапазон молеку лярных весов белков от 5,02 до 1017,07 кДа). Динамический диапазон для идентифицирован ных белков составляет 7 порядков (от 4,8·10-7% до 5,3%), что позволяет выявить регуляторные низко копийные белки, такие как интерлейкины 25 и 36, рецепторы ростовых факторов и т.д. Также иденти фицированы специфические маркеры мезенихмных (CD44, интегрины α-V и β-1) и нейральных прогени торных клеток (нестин). Во всех трех образцах иден тифицировано 606 белков.

Протеомные карты НСК, ММСК и ОСК (глиома сферы) глиобластомы клеточной линии U87 приве дены в открытом доступе на сайте www.neurovita.ru в форме научных отчетов[24–26]. Полученные дан ные протеомного картирования белков различных типов были подвергнуты сравнительному биоинфор мационному анализу. Изначально были выполнены «грубый» информационный анализ белков проте омного картирования сравниваемых групп и исклю чение из протеомов функционально малозначимых протеинов стволовых клеток. Для этого были исклю чены из исследуемых протеомов все белки, которые идентифицированы только в одном типе клеток, из 1664 уникальных белков получили группу сравнения А – НСК и ОСК (1052 белка)[24] и группу сравнения Б – ММСК и ОСК (607 белков)[24]. Полученные результаты в группе сравнения А (63,2% идентичных белков) отражают близость морфофункциональных фенотипов НСК и глиомасфер, как клеток, имеющих нейральноподобную дифференцировку и локализа цию в центральной нервной системе. В то же время в группе сравнения Б выявлено только 607 (36,47%) идентичных белков в анализируемых ММСК и ОСК. Несмотря на то, что признаки стволовости характер ны для обоих типов анализируемых клеток и они не так далеко находятся друг от друга фенотипически, их уже сформированная мультипотентная диффе ренцировка и определила значительную разницу в протеомном профиле этих клеток.

В дальнейшем были исключены из анализа каж дой из групп сравнения все белки, у которых нор мализованная сигнальная интенсивность (НСИ) из менилась менее, чем в 2 раза. Мы полагали, что только значимые отличия НСИ белков анализируемых клеточных систем отражают базовые регуляторные тенденции. В результате в группе А осталось толь ко 637 белков (38,28%), в группе Б – 425 белка (25,54%). Составили общую таблицу из белков групп А и Б (503 белка)[24]. В ней находятся белки, НСИ которых меняется более, чем в два раза хотя бы в одной из групп А или Б. Аннотирование и дальнейшая обработка проводилась для белков из этой таблицы. Результаты аннотирования приведены в дополнитель ном файле «Аннотация белков НСК, ММСК и ОСК»[24]. Далее на основании данных обзора[27] и баз данных исключили уже ранее известные белки, уча ствующие в канцерогенезе глиобластомы головного мозга: CD44, NADP и виментин, которые в дальней шем не рассматривали.

Следующим этапом биоинформационного анали за было проведено распределение белков на функ ционально значимые кластеры для внутриклеточной и межклеточной регуляции, протеиновые кластеры – цели. Был выделен первый кластер белков «Рецеп торные цели»: выделили из оставшихся белков про теомного профиля НСК и ОСК, а также ОСК и ММСК группу белков, расположенных преимущественно в (на) мембранах НСК, ММСК и ОСК, всего 105 бел ков (6,31 %). Для этого выбирали белки, у которых в аннотации присутствовал код GO:0005886 plasma membrane.

Затем был выделен второй кластер «Ядерные цели»: выделили из оставшихся белков протеомного профиля ОСК и НСК, а также ОСК и ММСК груп пу белков, содержащихся преимущественно в ядрах этих клеток, 146 белков (8,77%). Для этого выбира ли белки, у которых в аннотации присутствовал код GO:0005634 nucleus.

В заключение биоинформационного анали за определили третий кластер «Белки сигнальной трансдукции и межклеточной регуляции»: выделили белки, секретируемые НСК, а также секретируемые ММСК. Составили сводную таблицу секретируемых белков НСК и ММСК. Таких белков оказалось 33 (1,98%). Для этого выбирали белки, у которых в ан нотации присутствовал коды со словом extracellular: GO:0005576 extracellular region, GO:0005578 proteinaceous extracellular matrix, GO:0005615 extracellular space, GO:0031012 extracellular matrix, GO:0044420 extracellular matrix part.

Для всех отобранных белков построили графики распределения их по молекулярным функциям, био логическим процессам, а также сигнальным путям. Третий этап биоинформационной обработки ре зультатов протеомного картирования белков был обозначен как «тонкий» информационный анализ белков с использованием информационных баз дан ных протеомов и исключение из протеомного кар тирования протеинов, участвующих в канцерогенезе именно глиобластомы головного мозга. Оказалось, что в сформированных списках белков имеются протеины, участвующие в процессах канцерогенеза других неоплазий, но в не глиобластомы. Исключи ли из групп сравнения А и Б[24] митохондриальные белки и белки, ассоциированные с метаболомом НСК и ОСК: белки, обеспечивающие быстрое вос производство АТФ для поддержки энергетического статуса, быстрый синтез макромолекул, белки дыха тельной цепи, белки эффекта Варбурга и другие бел ки метаболома с помощью поиска аннотаций белков по ключевым словам mitochondrion, mitochondrial, metabolic, metabolism, Warburg, electron transport.

В результате в группах осталось: 34 ядерных, 53 мембранных и 10 внеклеточных белков. Исключили из групп сравнения А и Б белки, ассоциированные с нарушенными путями сигнальной трансдукции, характерными для глиобластомы.

Исключили из групп сравнения клеточного кар каса (белки цитоскелета, белки эндоплазматиче ского ретикулума) метаболома с помощью поиска аннотаций белков по ключевым словам cytoskeleton, cytoskeletal, reticulum. В результате в группах оста лось: 19 ядерных, 20 мембранных и 5 внеклеточных белков.

Для этих белков с помощью баз данных Biocarta (http://www.biocarta.com/), KEGG PATHWAY (http:// www.genome.jp/kegg/), PANTHER PATHWAY (http:// www.pantherdb.org/) и Reactome (http://www. reactome.org/) провели аннотирование сигнальных путей белков. Белок-белковые взаимодействия ан нотировали по базам данных Biomolecular Interaction Network Database (BIND: http://bind.ca), Database of Interacting proteins (DIP: http://dip.doe-mbi.ucla. edu/), Molecular Interaction Database (MINT, http:// mint.bio.uniroma2.it/mint/), NCICB CAPATHWAY interaction (http://cgap.nci.nih.gov/ Pathways/), и Reactome Interaction (http://www.reactome.org/). В результате, было выявлено 10 сигнальных путей, в которых участвуют два и более белка, а именно: сигнальный путь фосфоинозитидов и их ми шеней, путь заражения холерным вибрионом, путь фокальной адгезии, лизосомальный путь, сигналь ный путь интегрина, путь хореи Хантингтона, переда ча сигнала Ро-ГТФазами, путь ВИЧ-инфицирования, путь мембранного транспорта, путь гемостаза. Наибольший интерес представляют белки из разных локализаций (например, из ядра и из мембраны).

Обсуждение

Сопоставив протеомный профиль белков ОСК вы деленной из глиобластомы человека линии U87 с профилями белков тканеспецифичных НСК и ММСК человека, которые, как мы полагали, являются кон тролем нормы вида (человека), нам удалось иден тифицировать в изученных лизатах клеток 1664 белка, из которых 1052 белка (63,2%) идентичны для НСК и ОСК и 607 белков (36,47%) подобны в ММСК и ОСК. Остальные белки в ОСК глиобласто мы U87 являются онкоспецифичными или связаны с процессами канцерогенеза. Мы предположили, что матрица подобия белков в ОСК – это и есть «здо ровый» и «видоспецифичный» белковый клеточный субстрат, который остался сохранным в ОСК, и именно эти белки могут стать основой для разра ботки персонифицированного таргетного управления эффекторными функциями ОСК, не отвечающих на обычные сигналы межклеточной регуляции ткане специфичных стволовых клеток и клеток иммунной системы. Соответственно, мы выделили и проанно тировали белки ОСК, которые не пострадали в ре зультате неопластической трансформации клетки в процессе канцерогенеза и, используя современ ные базы информационных данных, распределили их на мембранные, секретируемые и ядерные. Эти данные позволили нам диагностировать в ОСК вы деленной из глиобластомы линии U87 десять путей сигнальной трансдукции, не пострадавших в резуль тате неопластической трансформации. Анализируя возможность информационного воздействия на эти пути в ОСК, мы попытались спрогнозировать ответ ОСК на регуляторный стимул. Лизосомальный путь и путь мембранного транспорта не передают сигнал в ядро, поэтому мы исключили их из дальнейшего рассмотрения. Пути инфицирования ВИЧ и холерным вибрионом характерны для клеток иммунной системы и кишечного эпителия соответственно, а также не связаны со злокачественным перерождением клеток, поэтому тоже были исключены нами из дальнейшего анализа. Гемостазисный путь характерен для тромбоцитов и процесса свертывания крови, поэтому также был исключен из дальнейшего рассмотрения. Наибольший интерес представляет сигнальный путь интегринов, так как высокий уровень экспрессии интегринов характерен для стволовых клеток, а изменение их продукции может быть связано с дедифференцировкой и изменением фенотипа клеток. Этот путь большей частью совпадает с путем фокальной адгезии, поэтому далее мы стали рассматривать их как один сигнальный путь.

Сигнальный путь интегрина/фокальной адгезии начинается с передачи сигнала в клетку ростовыми факторами (EGF, FIGF, HGF, IGF1, PDGFA, PDGFB, PGF, PDGFC, PDGFD, VEGFA, VEGFB, VEGFC) и бел ками внеклеточного матрикса (ламининами LAMA1, LAMA2, LAMA3, LAMA4, LAMA5, LAMC3, LAMB4, LAMB1, LAMB2, LAMB2, LAMC1, LAMC2; коллагенами COL1A1, COL1A2, COL2A1, COL3A1, COL4A1, COL4A2, COL4A4, COL4A5, COL4A6, COL5A1, COL5A1, COL5A2, COL6A1, COL6A2, COL6A3, COL11A1, COL11A2; фибронектином FN1, хондроадгерином CHAD, оли гомерным матриксным протеином COMP, тенасци нами TNC, TNN, TNR, TNXB, интегрин-связывающим сиалопротеином IBSP, реелином RELN, секретируе мым фосфопротеином 1 SPP1, тромбоспинодинами THBS1, THBS2, THBS3, THBS4, витронектином VTN и фактором фон Виллебранда VWF). На внешней стороне плазматической мембраны передача сиг нала происходит за счет интегринов ITGA11, ITGA6, ITGA1, ITGA2, ITG2AB, ITGA3, ITGA4, ITGA5, ITGA7, ITGA9, ITGAV, ITGA10, ITGA8, ITGB1, ITGB3, ITGB4, ITGB5, ITGB6, ITGB7, ITGB8; кавеолинов CAV1, CAV2, CAV3 и тирозин-киназных рецепторов (EGFR, ERBB2, FLT1, FLT4, IGF1R, KDR, MET, PDGFRA, PDGFRB). Соответственно, мы получили целый набор белко вых мишеней на мембране клетки, позволяющих таргетно и эффективно воздействовать на пути сигнальной трансдукции интегринов и фокальной адгезии и регулировать репродуктивные и пролифе ративные функции ОСК путем активации или инги бирования экспрессии доступных для регуляторного воздействия генов в ОСК. Этот подход качественно отличается от существующего конвенционального подхода в таргетной персонифицированной терапии опухолей. Все современные геномные, полнотран скриптомные и протеомные подходы к поиску целей в опухолевой клетке пытаются найти онкоспецифи ческие или канцерозависимые белки-мишени на её мембране, в путях сигнальной трансдукции или ядре опухолевой клетки и использовать их в качестве це лей для современной таргетной терапии опухолей.

Как видите, мы пошли другим путем: целью нашего воздействия на мишени в ОСК было не её уничто жение, а регуляция и управление её пролифера тивным и репродуктивным потенциалом. Нам пред ставлялось целесообразным для целей регуляции и управления ОСК не пытаться её уничтожить путем обнаружения специфичных белков, а выяснить, что же осталось ещё «сохранным и видоспецифичным» в протеоме мутировавшей ОСК, и можно ли «до стучаться» до генома ОСК, не отвечающей на стан дартные внешние воздействия. Данная постановка целей исследования была определена нами, исходя из собственных научных представлений о том, как должна проводиться современная противоопухоле вая терапия новообразований. В соответствии с со временной парадигмой противоопухолевой терапии, все без исключения применяемые медицинские про тивоопухолевые стратегии и технологии направлены на полное уничтожение всех опухолевых клеток и (или) ОСК любым путем до полного выздоровления пациента, и поэтому не могут быть эффективны по определению. Неэффективность существующей парадигмы доказывает отсутствие по настоящее время реальных технологий терапевтической помо щи онкологическим больным[28, 29]. Мы полага ем, что все ОК и ОСК опухоли убить нельзя даже те оретически. ОСК это форма адаптации и выживания генетически измененной «мутантной» соматической стволовой клетки. ОСК подобна споре у растений, которая при неблагоприятных условиях позволит им выжить. Мы полагаем, что настало время сме нить существующую парадигму противоопухолевого лечения. Альтернативой парадигме существующего тотального уничтожения опухолевых клеток и ОСК до полного излечения может быть методология хро низации онкологического заболевания и проведения противоопухолевой терапии, направленной на до пустимое уменьшение количества ОК, регуляцию ОК и контроль их количества в организме пациента (от 107 до 103) и, при необходимости, управление их эффекторными функциями[30]. Главной целью противоопухолевой терапии мы предложили считать не выздоровление пациента, а перевод острого фа тального злокачественного онкологического процес са в хроническое и не смертельное заболевание. Как утверждает А.И. Арчаков (2000), в норме у каждого здорового человека есть 5×105 опухолевых клеток и, как мы знаем, человек от этого количества не умирает[7]. Увеличение их количества до 109 ма нифестирует предраком, и только превышение ко личества опухолевых клеток более 109 клинически манифестирует раком или другой злокачественной опухолью. Известно, что каждый метод противоопу холевой терапии имеет определенные ограничения количественного уничтожения опухолевых клеток в организме: «хирургия» позволяет уменьшить их ко личество до уровня 109, химио- и лучевая терапия позволяют снизить уровень опухолевых клеток с 109 до 107, иммунотерапия обеспечивает цитотоксиче ской эффект с 107 до 105. Доказано и сегодня не вызывает сомнения, что регуляция количества опу холевых клеток ниже уровня 5×105 осуществляется тканеспецифичными стволовыми и прогенеторными клетками[30]. Поэтому комплексная протеом-ос нованная терапия опухолей должна включать в себя все существующие виды цитостатической, цито токсической и цитостатической противоопухолевой терапии (хирургию, химиотерапию, радиотерапию и иммунотерапию), обеспечивающие снижение уровня опухолевых клеток с 109 до 5×105, и завершаться циторегуляторной терапией собственными тканеспе цифичными регуляторными стволовыми клетками, способными оказать управляющее воздействие на эффекторные (репродуктивные и пролиферативные) функции ОСК.

Заключение

Мы полагаем, что комплекс современной противоопухолевой протеом-основанной терапии (рис.) должен состоять из трех обязательных эта пов лечения: 1) конвенциональной циторедуктив ной, цитостатической и цитотоксической терапии; 2) адоптивной и цитотоксической иммуннотерапии; 3) циторегуляторной терапии ОСК. Первый этап тера пии представляет собой конвенциональное лечение в виде хирургического удаления опухолей, химио (1–2 линии) и лучевой терапии (не более 20 грей). Второй обязательный этап лечения онкологиче ского больного должен состоять из адоптивной иммунотерапии (индивидуальные противоопухоле вые вакцины, цитотоксические лимфоциты, имму нопрепараты и антитела), которая до настоящего времени рассматривается онкологами пока только как экспериментальная. Третий этап противоопу холевой терапии должен заключаться в коррекции репродуктивных, пролиферативных и метастати ческих функций ОСК опухоли путем таргетного воздействия на белки-мишени ВКПСТ, способ ные ответить на целенаправленное регуляторное воздействие. Теоретическое и методологическое обоснование третьего этапа лечения было пред ставлено нами ранее и опубликовано в открытой печати в рамках концепции циторегуляторной те рапии злокачественных новообразований[30]. Ин струментом для получения собственных стволовых клеток с заданными свойствами, способных оказы вать персонифицированное таргетное регуляторное воздействие на ОСК, может быть их протеомное картирование и профилирование белков с целью выявления сигнальных путей, не пострадавших в результате канцерогенеза и определение генов, до ступных регуляторному воздействию, а также ана лиз динамики изменения их протеомов[31].

Подняться вверх сайта