Поиск Кабинет

Сравнительное исследование поведения клеток спинального ганглия крысы и линии РС12 на поверхностях, модифицированных биоадгезивными полимерами

Гены & Клетки: Том VII, №3, 2012 год, стр.: 173-176

 

Авторы

Якунина Л.Д., Курбанов Р.А., Бондарь О.В., Абдуллин Т.И.

ДЛЯ ТОГО ЧТОБЫ СКАЧАТЬ СТАТЬЮ В ФОРМАТЕ PDF ВАМ НЕОБХОДИМО АВТОРИЗОВАТЬСЯ, ЛИБО ЗАРЕГИСТРИРОВАТЬСЯ

Методом динамического рассеяния света исследована адсорбция на полистироле биоадгезивных полимеров (полиорнитина, желатина, ламинина), оценен их вклад в дзетапотенциал модифицированной поверхности. В присутствии сыворотки клетки РС12 не проявляют избирательной адгезии. При культивировании в бессывороточной среде с фактором роста нервов полистирол с адсорбированным полиорнитином способствует первичной адгезии клеток РС12. Последующая адсорбция ламинина индуцирует распластывание и дифференцировку клеток в нейрональном направлении. Первичные нейроны, выделенные из спинальных ганглиев крысы, прикрепляются предпочтительно к поверхности, модифицированной полиорнитином. На поверхности полиорнитин-ламинин нейроны интенсивно образуют нейриты, что коррелирует с пролиферацией глиальных клеток, позитивных по белку S100. Результаты показывают, что клетки РС12 и первичные нейроны проявляют сходный отклик на материал поверхности, однако последние клетки значительно более чувствительны к этому фактору. Выделенная клеточная культура позволяет исследовать взаимосвязь процессов образования нейритов и пролиферации шванновских клеток на различных биоматериалах.

Создание информативных in vitro моделей на основе клеток для исследования действия лекарств и материалов является актуальной задачей клеточной биологии, фармакологии и тканевой инженерии. Подобные модели востребованы для продуктивного скрининга биологической безопасности и активности веществ, а их применение позволяет сократить эксперименты с лабораторными животными [1].

Клетки нервной системы являются важными объектами, на основе которых моделируются ростовые, патологические и регенеративные процессы в нервных тканях [2]. Актуальной проблемой является создание моделей для исследования восстановления периферического нерва. При значительных повреждениях нервные волокна не способны к восстановлению функции в отсутствие тканеинженерных матриксов, которые благоприятствуют пролиферации и(или) росту нервных клеток и одновременно направляют эти процессы в пространстве для воссоединения нервного проводника [3].

Общепринятым и достаточно эффективным способом лечения травмы периферического нерва является микрохирургическая аутотрансплантация донорского участка нерва (аутонервная вставка) в место повреждения и(или) разрыва [4], которая, однако, имеет принципиальные недостатки [5]. Перспективным подходом является замена аутографта на искусственные кондуиты на основе биодеградируемых полимерных материалов, которые должны обеспечивать восстановление нерва с высокой эффективностью [6, 7]. В качестве структурной основы для получения кондуитов применяют, в частности, биополимеры: коллаген [8], хитозан [9], альгинат [10], а также синтетические полимеры: полиэфиры [11], полигликолевую кислоту [12]. Для усиления адгезии и роста нервных клеток подобные (био-)полимеры комбинируют с факторами адгезии, такими как фибронектин, ламинин и их фрагменты [13].

Подобные биоматериалы in vitro тестируют с использованием шванновских клеток [14], различных нейрональных линий [15], а также клеток, выделенных из нервных ганглиев [16]. Информативность используемых культур клеток и корреляция их отклика при взаимодействии с материалами остается важным вопросом для тканевой инженерии. Нами проведено сравнительное исследование поведения первичных клеток, выделенных из спинномозговых ганглиев, и клеток феохромоцитомы крысы (линия PC12) на различных полимерных покрытиях. Предложенные подходы представляют интерес для in vitro скрининга регенеративного потенциала полимерных (био-)материалов.

Материал и методы

Культивирование клеток PC12. Клетки РС12 культивировали в стерильных условиях при 37°С в атмосфере 5% СО2 в среде DMEM, содержащей 10% сыворотки крови плода коровы, 2 мМ L-глутамина, 100 ед/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина. Для пассирования клетки промывали раствором Хэнкса, обрабатывали 0,05% раствором трипсина с ЭДТА и подсчитывали в камере Горяева. Мертвые клетки выявляли путем их окрашивания трипановым синим.

Выделение клеток из спинальных ганглиев крысы. 10-дневную белую крысу усыпляли в СО2-камере, под стереомикроскопом Stemi DV4 (Carl Zeiss, Германия) извлекали позвоночник с последующей диссекцией ганглиев и удалением нервных волокон. Ганглии диссоциировали раствором коллагеназы, диссоциированные клетки сепарировали и очищали центрифугированием, осадок клеток суспендировли в среде Neurobasal (Invitrogen, США).

Модификация культуральной посуды. В качестве модельных биоадгезивных полимеров исследовали фибронектин (Биолот, Россия), ламинин, полиорнитин и желатин (Sigma-Aldrich, США). Аликвоту раствора биополимера вносили в лунки полистироловой планшеты, инкубировали 3 ч при 37°С для адсорбции биополимера на поверхности с последующей промывкой фосфатно-солевым буфером (ФСБ). Для послойной модификации процедуру повторяли с использованием другого полимера.

Анализ адсорбции биополимеров методом динамического светорассеяния. В качестве модели поверхности использовали полистироловые наночастицы (Malvern, США), на которые последовательно адсорбировали исследуемые биополимеры. Гидродинамический диаметр и дзета-потенциал наночастиц регистрировали с использованием анализатора Zetasizer Nano ZS (Malvern, США). Измерения проводили в U-образной кювете с позолоченными электродами при рН 7,0 и температуре 25°C. Результаты обрабатывали с помощью программного обеспечения Dispersion Technology Software 6.2 (Malvern, США).

Культивирование клеток на модифицированных поверхностях. Клетки РС12 и первичные нервные клетки культивировали в стандартных условиях в среде DMEM, содержащей 1% ЭБС, а также бессывороточной среде Neurobasal, содержащей добавку В-27. В обе среды вносили фактор роста нервов (Invitrogen, США) в концентрации 50 нг/мл. Визуализация и анализ нервных клеток. Цитоплазму клеток окрашивали прижизненным флуорофором кальцеином-АМ и ядерным красителем Hoechst 33342 (Sigma-Aldrich, США). Клетки фотографировали в прижизненных условиях на инвертированном микроскопе AxioObserver.A1 (Carl Zeiss, Германия) в режимах светлого поля и флуоресценции. Для выявления шванновских клеток культуру последовательно обрабатывали первичными антителами кролика к белку S100 и вторичными ослиными антителами к кроличьим иммуноглобулинам, меченными FITC согласно рекомендациям производителя (Invitrogen, США).

Результаты и обсуждение

На первом этапе методом динамического светорассеяния исследованы процессы адсорбции биополимеров на полистироловых наночастицах (ПСЧ), использованных в качестве модели (табл.). Установлено, что полиорнитин и желатин адсорбируются на ПСЧ в виде слоя толщиной около 3,6 и 19,3 нм, соответственно. При адсорбции желатина происходит уменьшение отрицательного дзетапотенциала поверхности ПСЧ с -61 до -16,5 мВ, а в случае поликатиона полиорнитина происходит перезарядка частиц до дзета-потенциала +41,9 мВ. Адсорбция ламинина на модифицированных полиорнитином ПСЧ сопровождается агрегацией наночастиц (см.табл.).

Было показано, что исследуемые биополимеры связывались с поверхностью полистирола и формировали модифицирующие слои различной толщины. Результирующий заряд поверхности зависит от изоэлектрической точки (заряда) адсорбированных биополимеров. Сходным образом биополимеры адсорбировались в различных комбинациях на полистироловых планшетах. Вначале исследовали поведение клеток РС12 – линии, выделенной из хромаффинной опухоли надпочечников крысы. В присутствии фактора роста нервов эти клетки дифференцируются в нейроноподобные клетки, способные образовывать аксоноподобные отростки (нейриты).

Выяснено, что в среде DMEM с 1% ЭБС клетки РС12 адгезируются сходным образом как на чистом полистироле, так и на модифицированном различными биополимерами (данные не показаны). Повидимому, это обусловлено присутствием в ЭБС факторов адгезии, которые, адсорбируясь на поверхности, не позволяют оценить влияние исследуемых биополимеров на поведение клеток. В бессывороточной среде Nerobasal взаимодействие клеток РС12 с модифицированными поверхностями было иным. В частности, в этих условиях клетки не прикреплялись к поверхности чистого полистирола и модифицированного желатином (данные не показаны), но сохраняли жизнеспособность и формировали плавающие агрегаты (рис. 1а). К поверхности полиорнитина клетки прикреплялись, однако не распластывались. В присутствии ламинина клетки распластывались на поверхности, приобретая веретеновидную и звездчатую форму, очевидно, в результате того, что специфическое взаимодействие мембранных рецепторов с ламинином индуцирует дифференцировку клеток РС12 в нейрональном направлении.

В отличие от ламинина, фибронектин не обладал подобной активностью, в значительно меньшей степени стимулируя распластывание клеток на фоне полиорнитина (не показано).

Наряду с клетками РС12 представляло интерес исследовать поведение клеток, изолированных из спинальных ганглиев крысы. Были выделены нейроны с примесью глиальных клеток, которые культивировали на модифицированных поверхностях в тех же условиях, что и клетки РС12 (бессывороточная среда Neurobasal + фактор роста нервов).

Было установлено, что первичные нейроны не закреплялись на чистом полистироле, но хорошо адгезировались к поверхности адсорбированного полиорнитина и, в меньшей степени, к поверхности желатина (рис. 2). На поверхности из полиорнитина и ламинина наблюдалась быстрая пролиферация сопутствующих клеток (рис. 2б), которые, по данным иммунофлуоресцентного анализа, экспрессировали белок S100 – маркер шванновских клеток.

Одновременно с пролиферацией шванновских клеток наблюдался рост отростков нейронов. Очевидно, что поверхность, последовательно модифицированная полиорнитином и ламинином, благоприятствует клеточным процессам, участвующим в восстановлении периферического нерва, что согласуется с данными литературы [17]. Быструю скорость пролиферации шванновских клеток и роста нейритов также наблюдали на модифицированной поверхности, которая наряду с полиорнитином и ламинином содержала желатин (рис. 2г).

Результаты показывают, что клетки РС12 и выделенная из спинальных ганглиев культура первичных клеток характеризуются сходным откликом на материал поверхности в присутствии фактора роста нервов. В то время, как положительно заряженная поверхность способствует первичной адгезии клеток, адсорбция ламинина усиливает их дифференцировку, образование нейритов, а также пролиферацию шванновских клеток. В отличие от первичных нейронов, клетки РС12 претерпевают относительно слабые цитоморфологические изменения при культивировании в присутствии ламинина.

Подняться вверх сайта