Поиск Кабинет

Сравнительная характеристика иммуномодулирующих свойств мультипотентных мезенхимных стромальных клеток и фибробластов человека

Гены & Клетки: Том VIII, №1, 2013 год, стр.: 29-35

 

Авторы

Зафранская М.М., Богдан В.Г., Демидчик Ю.Е., Гаин Ю.М., Багатка С.С., Шелкович С.Е., Иванчик Г.И.

ДЛЯ ТОГО ЧТОБЫ СКАЧАТЬ СТАТЬЮ В ФОРМАТЕ PDF ВАМ НЕОБХОДИМО АВТОРИЗОВАТЬСЯ, ЛИБО ЗАРЕГИСТРИРОВАТЬСЯ

Для использования мультипотентных мезенхимных стромальных клеток (ММСК) и фибробластов в «регенеративной медицине», помимо их репаративного потенциала, важное значение имеют иммуномодулирующие свойства, опосредуемые как межклеточными контактами, так и секрецией биологически активных факторов.

Проведен анализ морфофенотипических характеристик и оценка влияния культур ММСК, выделенных из костного мозга (КМ), жировой ткани (ЖТ), фибробластов кожи человека и постнатальных фибробластов линии Foreskin на митоген-индуцированную пролиферацию Т-лимфоцитов путем аллогенного совместного культивирования с мононуклеарами периферической крови доноров с подсчетом коэффициентов супрессии и определением концентрации фактора некроза опухоли-α.

Культуры клеток мезенхимального происхождения обладают морфо-фентотипическим сходством, при этом степень выраженности иммуносупрессивного действия ММСК-КМ и фибробластов линии Foreskin аналогична и достоверно превышала способность ММСК-ЖТ и дермальных фибробластов ингибировать пролиферацию лимфоцитов. Культуры ММСК и фибробластов конститутивно продуцировали фактор некроза опухолей-α на низком уровне. Вместе с тем, ММСК-КТ и фибробласты линии Foreskin ингибировали продукцию фактора некроза опухолей-α активированными мононуклеарами периферической крови, не оказывая при этом влияния на продукцию цитокина нестимулированными клетками, в то время как ММСК-ЖТ достоверно повышали концентрацию цитокина во всех культурах Т-лимфоцитов. Дермальные фибробласты не оказывали достоверного влияния на секреторную активность клеток иммунной системы.

Иммуномодулирующие свойства ММСК-ЖТ человека необходимо принимать во внимание при их использовании в регенеративной медицине.

Одним из наиболее перспективных и быстроразвивающихся направлений реконструктивно-восстановительной хирургии является разработка и клиническое применение композиционных биологических трансплантатов, состоящих из матриксаносителя и клеток, предварительно культивированных in vitro[1–4]. В качестве клеточного компонента тканеинженерных конструкций могут выступать как мультипотентные мезенхимные стромальные клетки (ММСК), выделенные из различных источников (костный мозг, жировая ткань), так и дифференцированные стромальные клетки – фибробласты, обладающие сходным фенотипом и дифференцировочным потенциалом[5, 6]. Для обоснования выбора клеточной составляющей, помимо репаративного потенциала клеток, важное значение имеют иммуномодулирующие свойства ММСК и фибробластов, опосредуемые как межклеточными контактами, так и секрецией биологически активных факторов[7–11].

Одним из факторов, который может служить диагностическим показателем для оценки степени приживления трансплантата и прогнозирования посттрансплантационных осложнений является фактор некроза опухолей-α (TNF-α). TNF-α вырабатывается активированными Т-клетками, моноцитами, макрофагами, фибробластами и эндотелиоцитами и обладает довольно широким спектром биологической активности[12]. Он инициирует миграцию клеток крови в очаг повреждения, что подтверждается увеличением соотношения мононуклеаров и гранулоцитов, стимулирует кислородный метаболизм и фагоцитоз, способствуя санации раневой поверхности от гнойно-некротических масс и ускорению наступления фазы регенерации. С другой стороны, TNF-α участвует в регуляции ремоделирования соединительных тканей. Цитокин активирует пролиферацию фибробластов[12, 14] и продукцию профиброгенных факторов (ИЛ-1β, фактора роста фибробластов)[15], компонентов внеклеточного матрикса (коллагена и фибронектина)[13]. В то же время, TNF-α стимулирует секрецию матриксных металлопротеиназ, в частности коллагеназы, стромелизина, желатиназы, снижает синтез тканевых ингибиторов металлопротеиназ, участвуя в механизмах подавления избыточного разрастания соединительной ткани, оказывая по механизму обратной связи прямое супрессорное влияние на экспрессию индуктора фиброза трансформирующего ростового фактора β1 (TGF-β1), накопление которого способствует быстрому развитию фибропластических процессов[13–15].

В последние годы ММСК являются центральным объектом исследования вследствие мультилинейного дифференцировочного потенциала, а также иммунорегуляторного действия, направленного на различные эффекторные клетки иммунной системы. Показано, что ММСК оказывают влияние на дифференцировку всех типов иммунных клеток и способны модулировать иммунный ответ, взаимодействуя с иммунной системой на нескольких уровнях: с одной стороны – подавляя пролиферацию Т-лимфоцитов путем усиления ингибиторов клеточного цикла или посредством действия биологически активных факторов, а с другой стороны – активируя популяцию регуляторных Т-клеток[7, 16, 17].

ММСК мигрируют в очаги поражений, что позволяет предположить их способность реагировать на локальное микроокружение, в котором они могут участвовать в функциональном восстановлении. Способность пересекать базальную мембрану регулируется металлопротеиназами, которые секретируются ММСК под влиянием воспалительных цитокинов, таких как TNF-α, TGF-β1 и ИЛ-1β. Показано, что ингибирование пролиферации лимфоцитов требует взаимодействия ММСК с иммунными клетками, которое приводит к продукции воспалительных цитокинов, таких как γИФН и ИЛ-1β. Эти результаты позволяют предположить, что функциональный ответ трансплантированных МСК in vivo может являться следствием влияния локального микроокружения в результате тканевого повреждения (воспаление и гипоксия)[18, 19].

Таким образом, иммуномодулирующие свойства клеток мезенхимального происхождения в сочетании с иммунологической «привилегированностью» и низкой токсичностью могут послужить дополнительным критерием, обосновывающим выбор клеточной составляющей тканеинженерных трансплантатов, позитивно влияя как на структуризацию и ремоделирование формирующейся соединительной ткани, так и регулируя воспалительный процесс в раневой зоне.

Одной из проблем применения ММСК при различных заболеваниях является отсутствие универсального in vitro метода определения потенциального in vivo терапевтического эффекта клеток. Оценка иммуномодулирующих свойств определенной культуры ММСК может быть проведена in vitro на модели со-культивирования ММСК и лимфоцитов с последующей оценкой влияния клеточных культур на пролиферацию активированных лимфоцитов и продукцию ими регуляторных молекул[20]. В связи с вышеизложенным, целью данной работы явилась оценка способности ММСК человека и фибробластов, выделенных из различных источников, ингибировать in vitro пролиферацию активированных лимфоцитов периферической крови и регулировать продукцию TNF-α.

Материал и методы

Получение ММСК из костного мозга

Стромальные клетки костного мозга человека были выделены из эксплантатов путем центрифугирования на градиенте плотности Histopaque-1077 (Sigma, Германия) в течение 30 мин. при 1500 об/мин. Полученные клетки ресуспендировали в среде DMEМ с пониженным содержанием глюкозы 1000 мг/мл (Gibco, Великобритания), содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС) (Hyclone, Германия), 100 U/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина (Sigm», Германия), 2 mM L-глутамина (Sigma, Германия) и засевали в культуральные чашки диаметром 60 мм. По достижении клетками 75% конфлюэнтности их снимали с поверхности культурального пластика с помощью 0,25% раствора трипсина/ЭДТА (Gibco, Великобритании) и пересевали на следующий пассаж в концентрации 1×104 клеток на см2.

Получение ММСК из жировой ткани

ММСК были выделены из жировой ткани ферментативным расщеплением в присутствии 0,075% коллагеназы в течение 45 мин. Полученные клетки отмывали 2 раза центрифугированием, клеточный осадок высевали в культуральные чашки в среде DMEМ с пониженным содержанием глюкозы 1000 мг/мл (Gibco, Великобритания) с добавлением 10% ЭТС, 100 U/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина (Sigma, Германия), 2 mM L-глутамина (Sigma, Германия), и в концентрации 5×104 клеток на 1 см2. Пересев клеток осуществляли по достижении монослоем 75% конфлюэнтности.

Получение дермальных фибробластов

Для выделения фибробластов человека фрагменты кожи размером 1 см2 инкубировали в 0,25% диспазе в течение 24 ч при 4°С для отделения дермы от эпидермиса по базальной мембране. Дерму нарезали на участки размером 0,5 см2 и инкубировали в течение 2 ч с 0,2% раствором коллагеназы I типа (Sigma, США) в фосфатном буфере при 37°С. Клетки высевали в концентрации 5×104 клеток на 1 см2 в культуральную среду IMDM (Gibco, Великобритания) с добавлением 10% ЭТС, 100 U/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 2 mM L-глутамина в культуральные чашки диаметром 60 мм.

Выделение мононуклеаров крови

Для выделения мононуклеаров периферической крови (МПК) гепаринизированную венозную кровь смешивали с равным объемом среды RPMI-1640 (Gibco, Великобритания), наслаивали на градиент Histopaque-1077 (Sigma, Германия) и центрифугировали 30 мин при 1500 об/мин. Клетки переносили в пробирку со средой RPMI, содержащей 10% ЭТС, 100 U/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 2 mM L-глутамина и дважды центрифугировали в течение 10 мин при 1500 об/мин.

CFSE-окрашивание мононуклеаров крови

Для оценки антиген-неспецифической пролиферации Т-лимфоцитов здоровых доноров в ответ на митоген ФГА был использован метод количественного анализа клеточного деления in vitro, основанный на применении внутриклеточного красителя карбоксифлуоресцеина (CFSE), флуоресценция которого снижается пропорционально числу клеточных делений. Выделенные МПК в концентрации 1×107 кл/мл окрашивали CFSE (Molecular Probe, Голландия) в концентрации 7 μМ среде RPMI-1640 (Sigma, Германия) течение 5 мин в темноте при комнатной температуре. Окрашивание клеток останавливали средой RPMI-1640, содержащей 10% ЭТС. После двукратного центрифугирования клетки ресуспендировали в среде RPMI, содержащей 10% ЭТС, 100 U/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 2 mM L-глутамина и использовали для со-культивирования с ММСК и фибробластами человека.

Совместное культивирование мононуклеаров крови с ММСК и фибробластами человека

Предварительно окрашенные CFSE МПК, полученные от 4-х здоровых доноров, культивировали в концентрации 2×105 клеток/лунку в 96-луночном планшете в культуральной среде RPMI, содержащей 10% ЭТС, 100 U/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 2 mM L-глутамина в присутствии 2,5 мкг/мл фитогемагглютинина (ФГА) совместно с ММСК или фибробластами 2-го пассажа (в соотношении 10:1). Регистрация количества не поделившихся и поделившихся спонтанно или в условиях митогенной активации Т-лимфоцитов осуществлялась на 6 сут. со-культивирования методом проточной цитофлуорометрии (FС 500, Beckman Coulter, США) с использованием моноклональных антител к СD3 (Beckman Coulter, США). Культуры МПК окрашивались моноклональными антителами или негативным контролем и инкубировались при комнатной температуре в темноте в течение 15 мин.

Для оценки пролиферативного ответа в соответствии с распределением флуоресценции были установлены границы популяции CD3+Т-клеток среди живых лимфоцитов. Пролиферация Т-лимфоцитов оценивалась как доля не поделившихся (CFSEhigh) и поделившихся (CFSElow) Т-клеток. Результат регистрировался на 50 000 событий в случае.

Для оценки иммуносупрессивного влияния ММСК и фибробластов на пролиферацию Т лимфоцитов рассчитывали коэффициент супрессии (КС) по формуле:

КС-коэффициент супрессии; ПТм+MSC/Фб – количество поделившихся митоген-стимулированных Т-лимфоцитов в совместной культуре МПК с ММСК или фибробластами, %; ПТм – количество поделившихся митоген-стимулированных Т-лимфоцитов в культуре МПК, %.

Оценка концентрации TNF-α методом иммуноферментного анализа

Продукция TNF-α оценивалась в 5-дневных супернатантах различных культур клеток мезенхимального происхождения (ММСК и фибробластов), а также 6-дневных супернатантах от ко-культур интактных и митоген-активированных МПК с ММСК или дермальными фибробластами. Количественное определение концентрации TNF-α проводили методом твердофазного иммуноферментного анализа с использованием тест-системы производства Вектор-Бест (Россия). Результаты регистрировали на спектрофотометре BRIO-SIRIO (SEAC, Италия), измеряя оптическую плотность в двухволновом режиме: основной фильтр – 450 нм, референс-фильтр – 620 нм.

Статистический анализ

Статистическую обработку полученных данных проводили с применением пакета прикладных программ «STATISTICA 6.0» (StatSoft, США). По данным проведенных исследований рассчитана медиана (Ме) и интерквартильный размах (25 и 75 процентили). Для сравнения динамики изменения показателя в исследуемых группах использовали непараметрические методы: критерий Вилкоксона, U-критерий Манна – Уитни. Различия считали статистически значимыми при p<0,05[21].

Результаты и обсуждение

Морфофенотипическая характеристика культур ММСК и фибробластов человека

В исследованиях иммунорегуляторных свойств различных клеток мезенхимального происхождения были использованы культуры ММСК костного мозга (ММСК-КМ) и ММСК жировой ткани (ММСК-ЖТ), а также фибробласты, выделенные из кожи человека и контрольная культура постнатальных фибробластов крайней плоти линии Foreskin (коллекция АТСС CRL 2429, Институт цитологии РАН, СанктПетербург, Россия). Первичные культуры и ранние пассажи ММСК-ЖТ, фибробластов кожи и постнатальные фибробласты линии Foreskin (2-й пассаж) на светооптическом уровне характеризовались сходным гомогенным клеточным составом, включающим веретеновидные, фибробластоподобные клетки с четко выраженным ядром и цитоплазматической перинуклеарной зернистостью (рис. 1).

В то же время, первичные культуры ММСК-КМ отличались гетерогенностью и включали, помимо фибробластоподобных, также мелкие округлые клетки, очевидно гемопоэтического происхождения, которые исчезали при последующих пересевах (рис. 1А).

Влияние клеток мезенхимального происхождения на митоген-индуцированную пролиферацию МПК

Оценка иммуносупрессивного влияния клеток мезенхимального происхождения на ФГАиндуцированную пролиферацию Т-лимфоцитов проводилась с помощью аллогенного со-культивирования ММСК и фибробластов с мононуклеарами периферической крови с дальнейшим подсчетом коэффициентов супрессии. На рис. 2 представлены оригинальные точечные диаграммы и их проекции в виде гистограмм результатов проточной цитофлуориметрии, отражающие изменение пролиферации СD3+ Т клеток здорового донора в ответ на поликлональный митоген ФГА в присутствии и в отсутствии аллогенных культур фибробластов и ММСК. На рис. 2А отображена спонтанная пролиферация СD3+ Т-лимфоцитов в 6-дневной культуре (количество поделившихся CFSElow Т клеток – 2,0%); добавление ФГА (рис. 2Б) значительно стимулировало пролиферацию Т-клеток, и процент поделившихся клеток составил 72,7%.

Фибробласты и ММСК, добавленные к митогенстимулированным МПК, в разной степени супрессировали пролиферацию Т-лимфоцитов. Наиболее выраженное иммуносупрессивное действие на митоген-индуцированную пролиферацию лимфоцитов оказывали ММСК-КМ и фибробласты линии Foreskin (рис. 2В, Д), где количество пролиферирующих Т клеток резко уменьшалось до 14,6% и 18,1%, соответственно. В присутствии аутогенных ММСКЖТ и дермальных фибробластов количество пролиферирующих СD3+ Т-лимфоцитов в ответ на митоген снижалось до 41,4% и 45,8%, соответственно (рис. 2 Г, Е).

Для отражения степени выраженности ингибирующего влияния клеточных культур на пролиферацию CD3+ лимфоцитов был рассчитан коэффициент супрессии пролиферативного ответа k (%). На рис. 3 представлены коэффициенты супрессии клеток мезенхимального происхождения на митоген-индуцированную пролиферацию Т-лимфоцитов.

В ходе статистической обработки результатов выявлены более высокие коэффициенты супрессии ММСК-КМ (69,2 (65,8–73,8)), по сравнению с ММСК-ЖТ (38,6 (30,5–47,8), р<0,05), а также фибробластов линии Foreskin (62,6 (61,9–63,6)), при сравнении с дермальными фибробластами (33,3 (28,7–39,3), р<0,05). При этом отсутствовали статистически значимые различия в степени супрессии пролиферации CD3+ Т-лимфоцитов между ММСК-КМ и фибробластами линии Foreskin, а также между ММСК-ЖТ и дермальными фибробластами.

Иммунорегуляторный потенциал ММСК и клеточно-молекулярные механизмы его реализации являются предметом многочисленных научных исследований[6, 7, 10]. В последние годы появляются данные о том, что антипролиферативный эффект является универсальным свойством клеток мезенхимального происхождения[9]. Так, M. Haniffa с соавт. (2007) показали, что дермальные фибробласты оказывают иммуносупрессивный эффект на антигениндуцированную пролиферацию МПК, механизмы реализации которого отличаются в зависимости от источника получения клеток[5].

Оценка концентрации TNF-α в супернатантах различных культур клеток мезенхимального происхождения и их кокольтур с МПК

В таблице представлена продукция TNF-α в супернатантах различных культур клеток мезенхимального происхождения.

Установлено, что ММСК и фибробласты секретируют провоспалительный цитокин на низком уровне, при этом, достоверных отличий как между различными пассажами каждой из культур, так и между исследуемыми культурами клеток не было выявлено. Полученные нами результаты согласуются с данными литературных источников о низком уровне конститутивной экспрессии TNF-α как ММСК, так и фибробластами[8].

В нестимулированных культурах МПК здоровых доноров концентрация TNF-α в среднем составила 64,07 (32,83–71,49) пг/мл (рис. 4).

При этом, добавление ММСК-КМ и фибробластов линии Foreskin к МПК без митогенной стимуляции не влияло на продукцию последними TNF-α: 46,71 (20,52–59,48) пг/мл и 49,61 (21,59–64,13) пг/мл, соответственно, в то время как ММСК-ЖТ способствовали увеличению продукции изучаемого цитокина до 185,62 (136,33-228,2) пг/мл, р<0,05.

Культивирование МПК в присутствии фибробластов, выделенных из кожи человека, недостоверно (р>0,05) повышало уровень TNF-α до 131,96 (62,06–201,86) пг/мл.

В присутствии ФГА наблюдалось статистически значимое увеличение концентрации TNF-α в супернатантах МПК до 274 (221,71–301,49) пг/мл (рис. 5). Добавление к активированным лимфоцитам ММСК-КМ и фибробластов линии Foreskin снижало продукцию TNF-α (150,11 (81,66–218,55) пг/мл и 114,83 (49,76–178,9) пг/мл, соответственно). Совместное культивирование активированных МПК и ММСК-ЖТ достоверно стимулировало выработку TNF-α, уровень которого достигал 334,77 (321,3– 390,74) пг/мл. Подобный тип влияния на продукцию цитокина стимулированными лимфоцитами оказывали и дермальные фибробласты кожи, не достигая при этом уровня статистически значимых значений (263,43 (232,47–294,41) пг/мл).

Выводы

1. Культуры клеток мезенхимального происхождения, обладающих морфо-фентотипическим сходством, в разной степени ингибируют митоген-индуцированную пролиферацию аллогенных Т-лимфоцитов периферической крови здоровых доноров. При этом степень выраженности супрессивного влияния ММСК-КМ и фибробластов линии Foreskin аналогична и достоверно превышает способность ММСК-ЖТ и дермальных фибробластов ингибировать пролиферацию лимфоцитов периферической крови.

2. Культуры ММСК и фибробластов конститутивно продуцируют TNF-α на низком уровне и разнонаправленно влияют на секрецию цитокина. ММСК-КМ и фибробласты линии Foreskin ингибируют продукцию TNF-α активированными МПК, не оказывая при этом влияния на продукцию TNF-α нестимулированными МПК, в то время как ММСК-ЖТ достоверно повышают уровень цитокина во всех культурах МПК. Дермальные фибробласты не оказывают достоверного влияния на секреторную активность клеток иммунной системы, при этом изменяют их функцию подобно ММСК-ЖТ.

3. Нами показано, что ММСК-ЖТ человека, не обладая выраженным супрессивным действием на митоген-индуцированную пролиферацию Т-лимфоцитов, оказывают стимулирующее влияние на функциональные свойства как активированных, так и интактных иммуннокомпетентных клеток с повышением продукции TNF-α.

Таким образом, представляется целесообразным дальнейшее углубленное изучение механизмов иммуномодулирующего действия ММСК человека и фибробластов, выделенных из различных источников.

Подняться вверх сайта