Поиск Кабинет

Сравнение влияния интрамиокардиальной аутотрансплантации различных клеток костного мозга на репарацию миокарда кроликов после инфаркта

Гены & Клетки: Том II, №1, 2007 год, стр.: 48-53

 

Авторы

Матюков А.А., Цупкина Н.В., Власов Т.Д., Гоиценко В.В., Давыденко В.В., Ялфимов АН., Пинаев Г.П.

ДЛЯ ТОГО ЧТОБЫ СКАЧАТЬ СТАТЬЮ В ФОРМАТЕ PDF ВАМ НЕОБХОДИМО АВТОРИЗОВАТЬСЯ, ЛИБО ЗАРЕГИСТРИРОВАТЬСЯ

В работе представлены! результаты! исследования по сравнительной оценке влияния интрамиокардиальной аутотрансплантации мультипотентных мезенхимных стромальных клеток костного мозга и ядросодержащих клеток костного мозга на репарацию миокарда после инфаркта. Экспериментыi проведеныi на кроликах породыi Шиншилла. Инфаркт миокарда моделировался путем лигирования передней нисходящей ветви левой коронарной артерии. Оценку результатов проводили по площади рубцовой ткани и индексу дила-тации левого желудочка через 12 месяцев после трансплантации клеток. Для определения размера инфаркта миокарда использовали методику окрашивания 1,3,5-трифенилтетразолием хлоридом. Были сформированы три группы животных. Животным 1-й группы (контроль, n=13) в пораженную зону инъекционным способом вводилась ростовая среда а-МЕМ, животным 2-й группы (n=14) вводилась культура мультипотентных мезенхимных стро-мальных клеток костного мозга (2x10е), животным 3-й группы (n=14)—ядросодержащие клетки костного мозга (2x10е). В работе показано, что трансплантация мультипотентных мезенхимных стро-мальных клеток костного мозга приводит к уменьшению площади рубца и дилатации левого желудочка по сравнению с контрольной группой. После трансплантации ядросодержащих клеток костного мозга отмечается расширение зоны некроза, увеличение площади рубца и выраженная дилатация всех камер сердца.

Введение

Сердечно-сосудистые заболевания продолжают занимать ведущее место среди причин инвалидности и смертности населения в экономически развитых странах [1]. Высокий уровень летальности во многом определяется особенностями регенерации миокарда. В организме взрослых млекопитающих гибель и замещение дифференцированных клеток происходит по-разному. Эти процессы могут осуществляться либо путем деления дифференцированных клеток с образованием потомков идентичного гено- и фенотипа [гепатоциты], либо путем замещения погибших дифференцированных клеток потомками недифференцированных ранних предшественников [клетки крови] [2]. У человека на поздних стадиях онтогенеза кардиомиоциты утрачивают способность к регенерации. В результате этого погибшие в ходе инфаркта кардиомиоциты замещаются соединительной тканью, что, в конечном итоге, приводит к нарушению функции сердца [3].

Новый терапевтический подход для предотвращения развития сердечной недостаточности основан на использовании живых клеток, подвергнутых обработке или модификации вне организма. Среди методов клеточной трансплантации наибольшую популярность получила аутотрансплантация мультипотентных мезенхимных стромальных клеток костного мозга и ядросодержащих клеток костного мозга [4]. Растущее число экспериментальных работ демонстрирует положительный эффект трансплантации этих клеток на регенерацию поврежденного миокарда [5].

Цель работы

Сравнить влияние аутотрансплантации мультипотентных мезенхимных стромальных клеток [ММСК] костного мозга и ядросодержащих клеток [ЯСК] костного мозга на репарацию миокарда кроликов после инфаркта.

Материалы и методы

Эксперименты проведены на кроликах-самцах породы Шиншилла массой 2,7-3,0 кг. Возраст животных к началу эксперимента составлял 3-4 месяца.

1. Получение мультипотентных мезенхимных стромальных клеток и ядросодержащих клеток костного мозга

В работе использовали культуру ММСК и ЯСК, полученных из аспирата костного мозга.

Аспират костного мозга получали путем пункции крыла подвздошной кости после премедикации [дроперидол 0,5 мг/кг, ксилазин 14 мг/кг] под местным обезболиванием 0,5% раствором новокаина. Аспират в количестве 10 мл помещали в пробирку, содержащую антикоагулянт CPDS [citrate phosphate dextrose solution). Полученный костный мозг фракционировали с помощью центрифугирования [1600g, 20 мин] в градиенте плотности Перколла [63%]. Образовавшееся интерфазное кольцо с ЯСК костного мозга промывали в растворе Хенкса без СаР+ и Mg2+ и осаждали центрифугированием. Осадок суспендировали в среде а-МЕМ и использовали либо для дальнейшего культивирования, либо для трансплантации без культивирования.

Жизнеспособность ЯСК костного мозга определяли в камере Г оряева с помощью окраски трипановым синим.

Клетки культивировали в среде а-МЕМ [ICN, США] с 10% сыворотки эмбрионов коров [Hyclone, Новая Зеландия] и гентамицина сульфата [50 мкг/мл] в СО2-инкубаторе при 5 % концентрации углекислого газа. Смену среды производили через каждые трое суток. После первой смены среды в нее добавляли аскорбиновую кислоту [50 мкг/мл]. Клетки, достигшие субконфлюэнтного состояния, пересевали при помощи раствора трипсина и ЭДТА [Gibco, США].

Характеристику клеточных культур проводили путем окрашивания стандартной смесью реактивов BCIP-NBT [Sigma, США] на щелочную фосфатазу [ЩФ] для идентификации клеток остеогенной дифференцировки и суданом-III [BDH Chemicals Ltd, Англия] для идентификации клеток адипоцитарной дифференцировки.

2. Моделирование инфаркта миокарда

Для моделирования инфаркта миокарда кроликам после премедикации [дроперидол 0,5 мг/кг, метацин 0,8 мг/кг] и эндотрахеальной интубации в условиях искусственной вентиляции легких под управляемым наркозом [кетамин 32 мг/кг, ксилазин 14 мг/кг, дитилин 3 мг/кг] в четвертом межребе-рье слева выполнялась торакотомия. Затем осуществлялась перикардиотомия и перевязка передней нисходящей ветви левой коронарной артерии на расстоянии 1,0 см от верхушки сердца [рис. 1 ]. Сразу после коронароокклюзии в зону предполагаемого инфаркта интрамиокардиально с помощью инсулинового шприца вводили клетки или эквивалентное количество ростовой среды [рис. 2]. Рану послойно ушивали, пневмоторакс ликвидировали путем активной аспирации воздуха из плевральной полости. Интраоперационная летальность составила 10%, послеоперационная - менее 2%.

3. Окрашивание клеток

Окрашивание клеточных культур и ЯСК костного мозга проводили с помощью флуорохрома Hoechst [Sigma, США] в концентрации 1 мкг/мл. Для обнаружения меченых клеток часть животных в каждой экспериментальной группе выводили из эксперимента через 20 суток, данный срок был обусловлен длительностью функционирования метки. Идентификацию окрашенных клеток осуществляли после ферментативной обработки миокарда смесью трипсин-кол-лагеназы [Sigma, США]. Меченые клетки выявляли с помощью флуоресцентного микроскопа «Ах^сор» [Zeiss, Г ермания].

4. Определение размера экспериментального инфаркта миокарда и дилатации левого желудочка

Для определения размера инфаркта миокарда в эксперименте использовали методику окрашивания 1,3,5-трифе-нилтетразолием хлоридом [ТТС], позволяющую на макроскопическом уровне отграничить необратимо поврежденную ткань миокарда от ткани, сохранившей жизнеспособность. У животных сразу после эвтаназии [через 12 месяцев после трансплантации клеток] извлекали сердце, промывали физиологическим раствором и разрезали в поперечном направлении с помощью специального устройства на 3 сегмента одинаковой толщины [рис. 3], плегический раствор не использовали, так как сердце во всех группах эксперимента подвергалось равнозначной контракции. Затем срезы помещали в 1% раствор ТТС [ICN, США], окрашивающий жизнеспособный миокард с сохраненной активностью НАД-зависимых ферментов в ярко-красный [кирпичный] цвет, и инкубировали в течение 15 минут при температуре 37 °С и рН 7,4. Окрашенные срезы миокарда фотографировали с базальной поверхности цифровой камерой Olimpus 2020. Общую площадь рубца вычисляли по трем срезам и представляли в процентном отношении от площади среза.

Дилатацию левого желудочка рассчитывали как отношение площади просвета к площади миокарда.

Все эксперименты на животных выполнены в соответствии с требованиями этического комитета СПбГМУ им. акад. И.П. Павлова.

Результаты исследования

В результате культивирования клеток, выделенных из аспирата костного мозга, была получена культура ММСК. После окрашивания ММСК смесью реактивов BCIP-NBT и суданом-III окрашенных положительно клеток выявлено не было, что свидетельствовало об отсутствии спонтанной остеогенной и адипоцитарной дифференцировки.

Для изучения механизмов влияния трансплантированных клеток на репарацию ишемизированного миокарда, необходимо было определить местонахождение введенных клеток. Детекция флуоресцентно окрашенных клеток в миокарде кроликов показала их присутствие в зоне ишемического повреждения.

Все животные были разделены на 3 группы. Животным 1-й группы [контроль, n=13] в пораженную зону инъекционным способом вводилась ростовая среда а-МЕМ, животным 2-й группы [n=14] вводилась культура ММСК [2x106], животным 3-й группы [n=14] - ЯСК костного мозга [2x1 06].

Макроскопическое исследование нативных сердец кроликов контрольной группы [без лечения] показало значительное увеличение размеров сердца и наличие выраженной аневризмы левого желудоч ка по сравнению со здоровым сердцем [неоперированные животные]. В сердцах кроликов, которым выполнялась трансплантация ММСК, на передней стенке левого желудочка выявлялись рубцовые изменения, размеры сердца были незначительно увеличены. В группе животных, которым осуществляли трансплантацию ЯСК, размеры сердца значительно превышали размеры здорового сердца, а левый желудочек был аневризматически изменен [рис. 4].

Результаты определения площади рубца после окрашивания срезов сердца кролика ТТС показали, что в контрольной группе площадь рубца составила 20,2±1,9%. В опытных группах максимальные изменения были выявлены в группе животных, которым выполнялась трансплантация ЯСК костного мозга: общая площадь рубца составила 35,8±1,6%. Положительные изменения были отмечены после трансплантации культуры ММСК - площадь рубцовой ткани в этих сердцах соответствовала 6,0±2,6% (рис. 5, 6). Результаты определения индекса дилатации левого желудочка показали, что в группе животных, которым инт-рамиокардиально трансплантировали ЯСК костного мозга, этот показатель в 2 раза превышал значения контрольной группы (0,34±0,03 и 0,19±0,02). Индекс дилатации левого желудочка сердец кроликов, перенесших трансплантацию ММСК, был в 2 раза меньше по сравнению с контрольной группой и составил 0,11±0,02 (рис. 7).

Обсуждение результатов

Представленные результаты показывают, что интрамио-кардиальная трансплантация ММСК костного мозга приводит к положительным изменениям в поврежденном миокарде, что проявляется в уменьшении площади рубца и дилатации левого желудочка по сравнению с контрольной группой. D. Orlic et al. (2001) показали, что недифференцированные ММСК обладают тропностью к поврежденным тканям и при трансплантации в зону альтерации активно участвуют в репара-тивных процессах [6]. Эти же авторы продемонстрировали способность ММСК дифференцироваться в кардиомиоци-ты. ММСК вырабатывают некоторые гемопоэтические и негемопоэтические ростовые факторы, интерлейкины и хе-мокины, а также экспрессируют рецепторы некоторых ци-токинов и ростовых факторов. In vitro показано, что ММСК продуцируют цитокины: IL (interleukin)-1a, IL-ip, IL-6, IL-11, IL-12, IL-14, IL-15, рецепторы для IL-1 a, IL-1 p, IL-1, IL-3, IL-4, IL-7, IL-8, TNFa (tumor necrosis factor alpha) [7, 8]. Многие из этих цитокинов продуцируются конститутивно, а другие - только после стимуляции. P. Azarnous et al. (2005) продемонстрировали способность ММСК после трансплантации в поврежденный миокард крыс вырабатывать HIF-1 a (hypoxia-inducible factor 1 alpha), который оказывает цитоп-ротективное действие и ингибирует апоптоз [9]. Кроме того, ММСК могут продуцировать факторы SDF-1 (stromal cell derived factor 1), SCF (stem cell factor), G-CSF (granulocyte colony-stimulating factor), способные дополнительно вызывать мобилизацию и хоуминг ММСК костного мозга в ишемизированный миокард и пролиферацию трансплантированных ММСК [10]. SCF также обладает мощным антиапоптотичес-ким действием, усиливает хоуминг предшественников эндо-телиоцитов из костного мозга и стимулирует пролиферацию миофибробластов [11]. Кроме того, МмсК участвуют в процессах неоангиогенеза за счет секреции ангиогенных факторов, таких как VEGF (vascular endothelial growth factor), bFGF (basic fibroblast growth factor), HGF (hepatocyte growth factor), TGF-p (transforming growthfactor beta), ангиопоэ-тин-1, и экспрессии на своей поверхности рецепторов для VEGF (VEGFR2), фибронектина, ламинина, молекул адгезии ICAM-1 (intercellular adhesion molecule-1), ICAM-2 (intercellular adhesion molecule-2), VCAM-1 (vascular cell adhesion molecule-1) [12]. Вырабатываемые ММСК ангиоген-ные факторы способны мобилизовать прогениторные эндотелиальные клетки из костного мозга, стимулировать пролиферацию эндотелиоцитов сосудов поврежденного миокарда и вызывать дифференцировку трансплантированных в миокард ММСК в эндотелиоциты, гладкие миоциты, перициты, фибробласты, которые затем становятся компонентами сосудистой стенки [13].

Таким образом, выявленное нами положительное влияние ММСК на репарацию поврежденного миокарда можно объяснить как прямым (дифференцировка ММСК в кардио-миоциты, эндотелиоциты и другие клетки), так и опосредованным (секреция цитокинов, стимулирующих неоангиогенез, ингибирующих апоптоз и т.д.) действием.

Трансплантация ЯСК костного мозга, наоборот, приводит к ухудшению течения инфаркта миокарда, сопровождается усилением фиброза и увеличением дилатации левого желудочка с формированием выраженной аневризмы. Как известно, инфаркт миокарда сопровождается острой воспалительной реакцией, в ходе которой происходит последовательная смена спектра синтезируемых цитокинов и клеточных популяций, в конечном итоге, приводящая к заживлению и формированию рубца [14]. Введенные инт-рамиокардиально в зону ишемии ЯСК костного мозга, по-видимому, изменяют течение воспаления. ЯСК костного мозга представляют собой гетерогенную популяцию и содержат ММСК, прогениторные эндотелиальные клетки, ге-мопоэтические стволовые клетки, нейтрофилы, моноциты, лимфоциты и другие клетки крови, способные секретировать множество различных цитокинов [15]. Попадая искусственно в ишемизированный миокард, ЯСК качественно и количественно изменяют воспалительную реакцию. Трансплантированные клетки, по-видимому, начинают секретировать протеолитические ферменты и хемоаттрактанты (IL-8, monocyte chemoattractant protein-1, macrophage inflammatory protein 1 alpha, 1 beta], которые дополнительно привлекают из крови в зону альтерации гранулоциты, усиливая тем самым воспалительную реакцию [16]. Высвобождаемые протеолитические ферменты лизируют межклеточные коллагеновые сшивки и активируют матриксные металлопро-теиназы. В результате каскада ферментативных реакций происходит деградации внеклеточного матрикса и расширение зоны инфаркта. В условиях повреждения кардиомиоциты начинают вырабатывать тканевые ингибиторы металлопроте-иназ [17, 18]. Однако, видимо количества синтезируемых ингибиторов недостаточно для подавления активности образующихся металлопротеиназ.

Еще один механизм влияния ЯСК костного мозга на течение воспаления, по-видимому, связан с прогениторными эндотелиальными клетками. ЯСК в больших количествах секретируют ангиогенные факторы: VEGF, bFGF, TGF-p, PDGF (platelet-derived growthfactor] и другие. Эти факторы стимулируют пролиферацию эндотелиоцитов сосудов поврежденного миокарда и трансплантированных прогениторных эндотелиальных клеток [19]. В результате этого трансплантированные и вновь образованные эндотелиоциты начинают синтезировать ангиотензин-II, эндотелин-1 и другие факторы, которые усиливают интерстициальный и перивас-кулярный фиброз [20].

Выводы

Таким образом, в ходе проведенного исследования нами было показано, что интрамиокардиальная трансплантация ММСК костного мозга приводит к выраженному положительному влиянию на репарацию ишемизированного миокарда. Трансплантация ЯСК костного мозга в острейшую фазу инфаркта миокарда не сопровождается положительными морфологическим изменениям, а, наоборот, ухудшает течение репаративных процессов.

Подняться вверх сайта