Поиск Кабинет

Сравнение различных методов выделения, мечения и трансплантации звёздчатых клеток печени крысы

Гены & Клетки: Том VIII, №3, 2013 год, стр: 147-151

 

Авторы

Шафигуллина А.К., Трондин А.А., Бурганова Г.Р., Титова А.А., Мавликеев М.О., Шарипова Э.И., Табанакова А.В., Газизов И.М., Калигин М.С., Титова М.А., Ризванов А.А., Гумерова А.А., Киясов А.П.

ДЛЯ ТОГО ЧТОБЫ СКАЧАТЬ СТАТЬЮ В ФОРМАТЕ PDF ВАМ НЕОБХОДИМО АВТОРИЗОВАТЬСЯ, ЛИБО ЗАРЕГИСТРИРОВАТЬСЯ

На сегодняшний день всё больше исследований по священо изучению роли звёздчатых клеток печени (ЗКП) в регенерации органа. При этом остаются нерешёнными важные методические вопросы, в частности, технология выделения ЗКП, способы мечения выделенных клеток и их наиболее эффективной трансплантации. В ходе данной ра боты было проведено сравнение двух методов выделения клеток: метод коллагеназно-проназной перфузии печени с последующим разделением клеток в градиенте плотности гистоденза и ассоциированного выделения ЗКП и гепато цитов методом Сеглена. Также был проведён анализ эф фективности различных методов мечения ЗКП: мембран ными флуоресцентными метками РКН26 и геном зелёного флуоресцентного белка (GFP), доставляемого в клетки ме тодом электропорации с помощью химического реагента TurboFect или аденовируса. Далее меченые клетки были трансплантированы здоровым крысам двумя методами: в селезёнку и в систему воротной вены. На основании полученных результатов можно заключить, что для выде ления ЗКП оптимальным является метод коллагеназно проназной перфузии печени с последующим разделением клеток в градиенте плотности гистоденза, для мечения клеток – доставка гена GFP аденовирусом, для трансплан тации – введение клеток в систему воротной вены.

В настоящее время звёздчатые клетки печени (ЗКП) привлекают к себе все большее внимание как важный «участник» процесса регенерации пече ни. Бóльшая часть исследований направлена на из учение роли эндогенных ЗКП в регенерации печени путём иммуногистохимического исследования с ис пользованием специфических маркёров: десмина – маркера ЗПК[1, 2], α-SMA – маркёра портальных миофибробластов и активированных ЗКП[2]. Однако последние годы ЗКП всё чаще рассматриваются как прогениторные клетки печени[3], что определяет не обходимость изучения свойств этих клеток (путей ми грации, хоуминга, возможностей дифференцировки и т.д.) после трансплантации для выяснения эффек тивности использования ЗКП в клеточной терапии заболеваний печени. В данном случае возникает ряд технических и методологических вопросов: разработка и выбор оптимальных методов выделения ЗКП, мечения выделенных клеток и способов трансплантации.

На сегодняшний день ЗКП печени крыс могут быть выделены двумя методами: 1) методом колла геназно-проназной перфузии печени с последующим разделением клеток в градиенте плотности гисто денза[4]; 2) методом ассоциированного получения гепатоцитов и ЗКП (по Сеглену)[5]. В литературе данных по сравнению эффективности данных мето дов нет, что и стало одной из задач данной работы. Следующий вопрос – метод мечения клеток. Для мечения клеток необходим метод простой и инфор мативный, стабильный и позволяющий детектиро вать трансплантированные клетки на протяжении длительного периода времени, в том числе после их деления. Известно множество различных методов получения меченых клеток: методы генетической модификации, молекулярно-биологические ме тоды введения плазмиды, несущей ген зелёного флуоресцентного белка (GFP), а также химические методы с применением мембранных красителей. Бесспорно, самым эффективным методом явля ется выделение клеток из ткани трансгенных зе лёных мышей. Сопоставимым по эффективности является метод выявления трансплантированных клеток по Y-хромосоме – для этого в качестве до нора клеток выступает мужская особь, а в каче стве реципиента – женская. Определение клеток по Y-хромосоме может быть проведено методом ПЦР в режиме реального времени[6] или методом гибри дизации in situ[7]. Главное преимущество данных методов заключается в том, что нет необходимости проводить дополнительные процедуры по мечению клеток, а благодаря наследованию признака выявить GFP или Y-хромосому можно и в дочерних клетках. Ограничивают широкое применение данных методов высокая стоимость и необходимость специального оборудования и навыков. Также общепринятым яв ляется проведение лабораторных экспериментов на самцах животных, тогда как при трансплантации клеток самкам при интерпретации результатов необ ходимо учитывать их физиологические особенности. Некоторыми исследователями проведены экспери менты по ксенотрансплантации, однако в данном случае большую роль в приживлении клеток играет иммунная система[8], поэтому данный метод не может быть применён в клинических исследованиях. Альтернативный метод, позволяющий метить клетки, – использование флуоресцентных мембран ных меток PKH (Sigma)[9]. Данный метод прост в проведении и позволяет получить высокий процент меченых клеток.

Наиболее распространённым и изученным яв ляется метод мечения клеток с помощью гена GFP. Методы доставки гена GFP в клетки очень разно образны – метод электропорации, химический ме тод с помощью липосом или специальных реагентов (например, TurboFect), а также с помощью вирусных векторов. При работе с белком GFP необходимо пом нить, что он обладает повышенной иммуногенностью, в связи с этим клетки, экспрессирующие ген белка GFP, элиминируются иммунной системой[10]. Тем не менее, метод выявления трансплантированных клеток по GFP прост и информативен, широко при меняется и поэтому необходимо определить наи более оптимальный метод мечения ЗКП с помощью гена GFP. Поэтому задачей данной работы стало срав нение различных методов доставки в ЗКП гена GFP и мечения ЗКП с помощью флуоресцентной мембран ной метки РКН, как наиболее перспективных.

Следующим важным вопросом является поиск наиболее эффективного метода трансплантации кле ток. В целом все методы введения гемопоэтических стволовых и мультипотентных мезенхимальных стро мальных клеток могут быть разделены на 3 группы: прямое или адресное введение в определенный ор ган, «полупрямое» и системное введение[11]. При мером прямого введения могут быть исследования Y. Sato с соавт. (2005), когда клетки были введены непосредственно в поражённую печень[12]; примеры полупрямого введения – внутриселезёночное[13] и интраперитонеальное[14]; пример системного вве дения – введение в хвостовую вену[15, 16]. Также клетки могут быть введены в воротную вену[10] или в печеночную артерию[17], что, несомненно, повы шает количество клеток, поступающих с током крови в печень[18]. Пути введения ЗКП малоизучены, поэ тому нами были выбраны два пути введения: в систе му воротной вены и в селезёнку, из которой с током венозной крови клетки теоретически должны достичь системы воротной вены и далее – печени.

Материал и методы

Исследование было проведено на белых бес породных крысах-самцах рода Вистар весом 250– 300 г, находящихся на стандартном рационе вивария и имеющих свободный доступ к воде. Проведение ис следований одобрено Республиканским комитетом по Этике при Министерстве здравоохранения Респуб лики Татарстан (протокол № 3 от 21.03.2011). Выделение ЗКП было проведено двумя метода ми: 1) методом коллагеназно-проназной перфузии печени с последующим разделением клеток в гради енте плотности гистоденза[4] и 2) методом Сеглена для ассоциированного выделения гепатоцитов и ЗКП [5]. Сравниваемые параметры: чистота культуры, выживаемость клеток, техническая простота метода выделения.

В основе обоих методов выделения ЗКП лежит перфузия печени через систему воротной вены, различия заключаются в растворах для перфузии. В первом методе перфузия печени была прове дена следующими растворами: 1) буферным сба лансированным солевым раствором Гейса (Gey`s Balanced Salt Solution, GBSS, Sigma) объёмом 80 мл, скорость перфузии 10 мл/мин; 2) GBSS в комбинации с проназой (Pronase E, Sigma) для ли зиса гепатоцитов объёмом 80 мл (0,264 г – про наза), скорость перфузии 10 мл/мин; 3) GBSS в комбинации с проназой (0,08 г) и коллагеназой для лизиса соединительнотканной стромы печени (0,16 г, Collagenase Type I, Sigma) объёмом 100 мл, скорость перфузии 3,33 мл/мин). Для лучшей ра боты ферментов температура растворов поддержи валась на уровне 37°С в условиях водяной бани. После окончания перфузии печень извлекали из брюшинной полости и измельчали в стерильных условиях ламинара, полученную суспензию кле ток инкубировали в растворе GBSS в комбинации с 0,04 г проназы Е, 0,048 г коллагеназы I и 0,08 г ДНК-азы в течение 30 мин в водяной бане при температуре 37°С. Полученную суспензию клеток переносили в чистую пробирку и отмывали от фер ментов путём центрифугирования в течение 5 мин при 500 g и ресуспендирования в растворе GBSS. Разделение фракций непаренхиматозных клеток было проведено в градиенте плотности гистоденза (Histodenz, Sigma), при этом клетки были ресуспен дированы в 28,7% растворе гистоденза с после дующим подслаиванием полученной суспензии к 7% раствору гистоденза. В результате центрифу гирования в течение 17 мин при 3000 rpm витамин А-содержащие ЗКП были в верхнем слое (рис. 1). Выделенные ЗКП переносили в чистую пробирку и для отмывки от гистоденза общий объём клеточ ной суспензии доводили до 15 мл раствором GBSS и центрифугировали клетки в течение 15 мин при 800 g, удаляли супернатант, клеточный осадок ре суспендировали в небольшом объёме питательной среды и рассевали на культуральные чашки.

По методу Сеглена перфузия печени была про ведена растворами: 1) этиленгликольтетраацета та (Ethylene Glycol Tetraacetic Acid, EGTA) объёмом 50 мл, скорость перфузии 10 мл/мин; 2) буферного сбалансированного солевого раствора Гейса (GBSS, Sigma) объёмом 30 мл при скорости перфузии 10 мл/мин и 3) раствором 0,5% коллагеназы (Био лот) объёмом 50 мл в течение 5 мин, скорость перфузии 10 мл/мин. После окончания перфузии печень, как и в предыдущем методе, извлекали из брюшинной полости и измельчали, клеточную су спензию сразу центрифугировали в течение 10 мин при скорости вращения 450 g.

Количество выделенных клеток и их выживае мость определяли путём подсчёта клеток в камере Горяева при разведении клеточной суспензии в три пановом синем в соотношении 1:10. ЗКП культиви ровали в питательной среде ДМЕМ (Sigma) с 10% содержанием фетальной бычьей сыворотки (FBS, Sigma), 146 мг/мл L-глутамина и 100 Ед/мл пени циллина, 100 мкг/мл стрептомицина (Sigma) в инку баторе при 37°C и 5% содержании СО2 во влажной атмосфере.

В следующем экспериментальном блоке было проведено сравнение эффективности 4-х разных методов мечения клеток: 1) метод генетической модификации путём электропорации плазмидой pEGFР-N2, отвечающей за экспрессию GFP[21]; 2) метод введения плазмиды pEGFР-N2 с помо щью специального реагента TurboFect (Fermentas); 3) метод трансфекции клеток аденовирусом со встро енным геном GFP[22]; 4) применение мембранного красного флуоресцентного красителя PKH26 (Sigma) [23]. Сравниваемые параметры: эффективность трансфекции (количество меченых клеток), выжива емость клеток, длительность сохранения флуоресценции, а также возможность введения клеток сразу после мечения или необходимость культивирования клеток с целью их восстановления после мечения. Для трансплантации меченых ЗКП были выбраны 2 метода введения: 1) в селезёнку; 2) в систему воротной вены. Анализ результатов трансплантации ЗКП был проведён иммуногистохимическим методом с антителами к EGFP.

Результаты и обсуждение

Сравнение методов выделения ЗКП крысы. Обо ими методами нами были получены ЗКП крысы. По скольку метод Сеглена направлен на ассоциирован ное получение ЗКП и гепатоцитов, то для получения чистой культуры ЗКП требовалось от 7 до 10 сут. для элиминации гепатоцитов. Также необходимо от метить, что в присутствии гепатоцитов ЗКП росли медленнее.

Метод Сеглена является менее затратным в фи нансовом плане, более простым в исполнении, одна ко более высокие показатели жизнеспособности ЗКП (90%) и чистоты культуры (99,5%) были получены при выделении клеток методом коллагеназно-прона зной перфузии печени с последующим разделением клеток в градиенте плотности гистоденза. Данный метод мы рекомендуем для получения чистой куль туры ЗКП.

Сравнение методов мечения ЗКП. При сравнении различных методов мечения клеток были получены следующие результаты. Наименее эффективным по количеству меченых клеток (около 50%), их вы живаемости (30%) стал метод электропорации. Длительность сохранения свечения составила всего 7 сут., а необходимость последующего культивиро вания клеток в течение 12 ч. для их восстановле ния увеличивает потери клеток (при снятии клеток с чашки перед трансплантацией). Метод введения плазмидной конструкции pEGFР-N2 с помощью спе циального реагента TurboFect позволил получить около 60% меченых клеток при хорошем уровне их выживаемости (рис. 2), однако длительность све чения составила всего около 10 сут., то есть клет ки, меченные данным методом, могут применяться только в краткосрочных экспериментах.

Метод вирусной трансфекции обладает рядом пре имуществ: простота (культивирование в течение 1 ч в условиях инкубатора[19]), высокая эффективность (90%) и высокий уровень выживаемости клеток (порядка 90%). Важно отметить, что после вирусной трансфекции нет необходимости в дополнительном восстановлении клеток перед трансплантацией. Максимальное количество меченых клеток (100%) было достигнуто при витальном мечении их мембранным флуоресцентным красителем РКН26 (табл.).

Так же, как и при вирусной трансфекции, клет ки, меченные мембранными метками РКН26, могут быть трансплантированы сразу после процедуры мечения. Главным недостатком красителя РКН26 является то, что мембранная метка неустойчива к действию различных химических веществ, приме няемых при фиксации и заливке тканей в парафин и иммуногистохимическом окрашивании, поэтому последующую визуализацию клеток лучше прово дить лишь на гистологических срезах, выполнен ных на криостате. Ещё одним недостатком является размывание красителя при делении клеток, по этому данный метод не подходит для длительных экспериментов и экспериментов, предполагающих пролиферацию трансплантированных клеток[20]. Таким образом, передача метки дочерним клеткам без ослабления флуоресценции возможна лишь при мечении клеток аденовирусом или ретровиру сом, несущим ген GFP. На основании полученных результатов наиболее оптимальным методом мече ния клеток мы считаем использование аденовируса, несущего ген EGFP.

Сравнение методов трансплантации ЗКП. Мече ные ЗКП были трансплантированы здоровым кры сам. Нами было проведено сравнение двух методов введения: в селезёнку и в систему воротной вены. При трансплантации ЗКП в селезёнку крыс GFP+ клетки были обнаружены только в самой селезёнке, в печени введённых клеток не было. Вероятно, это связано с тем, что ЗКП обладают высокой адгезией и поэтому остались в месте введения, в самой селезёнке, и кровеносного русла не достигли.

Напротив, при введении ЗКП в систему воротной вены в печени крыс были обнаружены GFP+-клетки, напоминающие по форме гепатоциты (рис. 3). Та ким образом, при введении ЗКП в систему воротной вены клетки успешно достигали печени и встраи вались в паренхиму органа. Серьёзной проблемой при внутривенном введении клеток стала высокая частота осложнений в виде кровотечения, которую удалось решить путём применения коллагеновой гемостатической губки – место вкола перед извлечением иглы инсулинового шприца, которым вводили клетки, прижимали губкой размером 5×5 мм. Удостоверившись в отсутствии кровотечения, накладывали швы. Частота кровотечений и летальных исходов прооперированных животных была сведена к минимуму. Таким образом, для трансплантации ЗКП предпочтительным является метод введения в систему воротной вены, а для исключения кровотечения при введении клеток рекомендуется применение гемостатических средств.

Подводя итог можно заключить, что наиболее эффективным для выделения ЗКП является метод коллагеназно-проназной перфузии печени крысы с последующим разделением клеток в градиенте плот ности гистоденза, оптимальным методом мечения клеток – вирусная трансфекция с помощью адено вируса, несущего ген GFP, а наилучшим методом трансплантации клеток – введение в воротную вену печени.

Подняться вверх сайта