Поиск Кабинет

Сравнение эффективности методов получения функционально активных кардиомиоцитов человека

Гены & Клетки: Том VIII, №2, 2013 год, стр.: 47-55

 

Авторы

Худяков А.А., Курапеев Д.И., Костарева А.А., Малашичева А.Б.

ДЛЯ ТОГО ЧТОБЫ СКАЧАТЬ СТАТЬЮ В ФОРМАТЕ PDF ВАМ НЕОБХОДИМО АВТОРИЗОВАТЬСЯ, ЛИБО ЗАРЕГИСТРИРОВАТЬСЯ

Задача получения кардиомиоцитов человека in vitro важна как с точки зрения фундаментальной науки, так и для «регенеративной медицины». Опубликовано множество протоколов получения культуры кардиомиоцитов той или иной степени эффективности, однако на практике каждый исследователь сталкивается с тем, что опубликованные методики приходится адаптировать в конкретной лаборатории для конкретных задач. Целью настоящей работы было сравнить три метода получения кардиомиоцитов в культуре: 1) из образца миокарда путём получения клеток-предшественниц и их последующей дифференцировки в кардиомиоцитарном направлении; 2) из мультипотентных мезенхимных стромальных клеток жировой ткани; 3) из фибробластов кожи человека путём их репрограммирования и последующей дифференцировки в кардиомиоциты c использованием опубликованного ранее протокола[18] c авторскими модификациями.

Показана невысокая эффективность получения кардиомиоцитов в культуре из клеток-предшественниц миокарда взрослого человека и из мультипотентных мезенхимных стромальных клеток; эффективность получения кардиомиоцитов с применением репрограммированных клеток оказалась значительно выше. Обсуждены преимущества и недостатки каждого метода и перспективы их использования.

Заболевания сердечно-сосудистой системы являются основной причиной смертности в развитых странах. Поскольку способность миокарда к регенерации низка, текущие терапевтические подходы ограничены. В связи с этим актуальным является получение культуры кардиомиоцитов человека in vitro. Такие культуры могут стать источником кардиомиоцитов для замещения рубцовой ткани в очаге повреждения и также важны в качестве модели для изучения нормального и патологического состояний сердца на клеточном и молекулярном уровне. Техника изолирования зрелых кардиомиоцитов крыс была впервые описана в 1977 г.[1]. Изучение изолированных кардиомиоцитов ограничено, поскольку эти клетки не способны пролиферировать в культуре и могут поддерживаться в течение сравнительно короткого периода времени[2]. Данная модель позволяет изучать электрофизиологические характеристики, но не развитие кардиомиоцитов. Большинство долговременных исследований на культуре кардиомиоцитов проводится с использованием эмбриональных и неонатальных кардиомиоцитов, что исключает возможность проведения подобных исследований на человеке.

Другой подход получения культуры кардиомиоцитов заключается в индукции направленной дифференцировки клеток различных типов в кардиомиоцитарном направлении. Было показано, что ряд тканеспецифичных стволовых клеток и клеток-предшественниц, таких как мультипотентные мезенхимные стромальные клетки (ММСК)[3] и эндотелиальные прогенеторные клетки[4], обладают способностью дифференцироваться в кардиомиоциты. Опубликовано несколько методов получения культур клеток-предшественниц кардиомиоцитов (КПКМ) из миокарда взрослого организма (человека или животных) путём диссоциации ткани, получения резидентных стволовых клеток сердца и последующей индукции их дифференцировки в кардиомиоцитарном направлении[5–7].

Возможным источником кардиомиоцитов могут являться ММСК, получаемые из костного мозга или жировой ткани. Существуют протоколы, обеспечивающие дифференцировку ММСК в кардиомиоцитарном направлении[8–10]. В основном эти методы сводятся к активации клеток 5-азацитидином и последующей спонтанной дифференцировке в кардиомиоцитно-мышечном направлении.

На сегодняшний день наиболее разработанной стратегией получения культуры кардиомиоцитов и клеток, подобных кардиомиоцитам, является использование эмбриональных стволовых клеток (ЭСК)[11, 12]. ЭСК обладают способностью к дифференцировке во многие клеточные типы – плюрипотентностью, что даёт широкие возможности для изучения процессов раннего развития[13]. Однако трансляция результатов исследований, связанных с ЭСК, в клиническую практику в настоящее время затруднена в виду различного рода ограничений, касающихся использования эмбрионального материала – источника ЭСК.

С открытием индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (иПСК)[14], которые аналогичны по свойствам ЭСК, получение кардиомиоцитов стало возможным еще и из этого типа клеток. Разработано множество комбинаций репрограммирующих факторов, чаще всего представляющих собой различные комбинации 6 генов (Oct4, Sox2, Klf4, cMyc, Nanog и Lin28), в некоторых случаях требующие добавок в виде ферментов или малых молекул[15, 16].

Задачей данной работы было сравнить эффективность разных методов получения кардиомиоцитов с точки зрения возможности и перспективности их применения в исследованиях по изучению патогенеза врождённых и наследственных заболеваний сердца. Мы выбрали три метода – первый, опубликованный ранее метод получения кардиомиоцитов из клетокпредшественниц, которые присутствуют в миокарде взрослого человека[5]. Также данный протокол не требует внесения генетических конструкций, что значительно снижает сложность и стоимость его осуществления. Вторым был выбран метод получения кардиомиоцитов из ММСК жировой ткани[9], благодаря доступности эксплантации тканевого источника. Третий способ – получение кардиомиоцитов при помощи технологии репрограммирования клеток – был выбран, так как его применение предполагает возможность исследовать клетки от конкретного пациента, а также в связи с его высокой эффективностью (согласно данным литературы). Недостатки и преимущества каждого из методов рассмотрены и обсуждаются в работе.

Материал и методы

Исследование проводилось в соответствии со стандартами Хельсинкской Декларации (1989), всеми пациентами, у которых получали биологический материал, было подписано информированное согласие.

Получение КПКМ из ткани миокарда и их дифференцировка в кардиомиоциты

Получение КПКМ из миокарда и индукцию их дифференцировки в кардиомиоцитарном направлении проводили, как это было описано ранее[6]. Полученный в ходе операции на сердце фрагмент ткани миокарда (auricula cordis) отмывали от остаточной крови, измельчали и подвергали ферментативной обработке коллагеназой А (0,7 мг/мл) в течение 2 ч при 37°С. Затем ткань пропускали через нейлоновый фильтр с диаметром пор 40 мкм. Суспензию клеток высевали в клональной плотности на 6-луночные платы в среде, содержащей 22,5% EGM-2, (Lonza, США), 67,5% M199, 10% FBS, 1x раствор аминокислот MEM (Invitrogen, США), 1x гентамицин, (Invitrogen, США). Через 3–4 нед. клетки пересевали в плотности 104 кл/см2, через сутки среду заменяли на дифференцировочную (47% IMDM, 47% Ham’s F12, 2% лошадиной сыворотки, 1x раствор аминокислот MEM, 1x инсулин-трансферрин-селен, 1x гентамицин (Invitrogen, США). Через 6–8 ч среду заменяли на дифференцировочную, содержащую 5μM 5-азацитидина (Sigma-aldrich, США). В течение следующих трёх суток в среду добавляли 5-азацитидин. На шестой день с момента начала индукции дифференцировки к среде добавляли 10-4 M аскорбиновой кислоты (Sigma-aldrich, США) и 1 нг/мл TGF-β1 (Peprotech, США). Начиная с этого момента, добавляли аскорбиновую кислоту раз в двое суток и TGF-β1 дважды в неделю. Замену среды проводили каждые 2–3 сут. Продолжительность дифференцировки составляла 24 сут.

Дифференцировка ММСК жировой ткани в кардиомиоцитарном направлении

ММСК получали из биоптата жировой ткани здоровых доноров по описанной ранее методике[17]. Культуры вели в среде α-МЕМ (Панэко, Россия) с добавлением 10% фетальной сыворотки Hyclone, 50 МЕ/мл пенициллина и 50 мкг/мл стрептомицина (Invitrogen, США). Для подтверждения принадлежности полученных культур к ММСК проводили иммунофенотипирование с использованием антител к CD19, CD34, CD45, CD73, CD90, CD105, CD146, CD166 по стандартной методике на цитофлюориметре Millipore Guava easyCytе. Дифференцировку в кардиомиоцитарном направлении индуцировали при помощи 5-азацитидина, как это было описано ранее[9].

Получение и культивирование репрограммированных клеток

Репрограммирование осуществлялось при помощи трансдукции клеток лентивирусными векторами, несущими полицистронную кассету STEMCCA, содержащую кодирующие последовательности генов OCT4, SOX2, KLF4 и c-MYC[18]. Набор плазмид для сборки лентивирусных частиц был любезно предоставлен Dr. Kaomei Guan (Медицинский университет, Гёттинген, Германия).

Для репрограммирования использовали культуру фибробластов кожи человека на 5 пассаже. Культура фибробластов кожи была любезно предоставлена Натальей Юдинцевой (Институт Цитологии РАН)[19]. Фибробласты кожи культивировали в среде DMEM (Invitrogen, США), содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки (Invitrogen, США). 2,4×103 фибробластов трансдуцировали супернатантом клеток, содержащим лентивирусные частицы. Через 6 сут. после трансдукции клетки пересевали в соотношении 1:4 на фидерный слой мышиных эмбриональных фибробластов, инактивированных 0,01 мг/мл митомицина С (Serva, Германия). Дальнейшее культивирование осуществлялось в среде для ЭСК, включающей DMEM/F12 (Invitrogen, США), 20% заменителя сыворотки KOSR (Invitrogen, США), раствор заменимых аминокислот (Invitrogen, США), b-меркаптоэтанол (Sigma-aldrich, США), 10 нг/мл bFGF (Peprotech, США).

Спустя 3 нед. индивидуальные колонии репрограммированных клеток изолировали механически и культивировали в течение 10 пассажей. Колонии пассировали в соотношении 1:4 при помощи раствора коллагеназы IV (Worthington Biochemical, США) в концентрации 200 ед./мл в среде DMEM.

Дифференцировка репрограммированных клеток в кардиомиоциты

Индукцию дифференцировки проводили методом формирования эмбриоидных тел. Колонии репрограммированных клеток снимали с чашек при помощи коллагеназы и переносили в чашки Петри (диаметр 6 см) с гидрофобной поверхностью. На следующий день среду меняли на дифференцировочную: IMDM (Invitrogen, США) с 20% эмбриональной телячьей сыворотки (Invitrogen, США), добавляли ингибитор p38 MAPK киназы SB 203580 (конечная концентрация 10 мкМ, Calbiochem, Германия). На 8 сут. эмбриоидные тела пересаживали в лунки 6-луночного планшета, покрытые 0,1% раствором желатина на PBS. Среду меняли каждые 4 сут. Дифференцировку осуществляли в течение 35 сут. Эффективность дифференцировки оценивали процентным отношением количества спонтанно сокращающихся эмбриоидных тел к общему числу на 35 сут.

Анализ экспрессии маркеров методом ПЦР с обратной транскрипцией

РНК из клеток выделяли при помощи TRIzol®Reagent (Invitrogen, США) согласно рекомендациям производителя. 1 мкг выделенной РНК использовали в реакции обратной транскрипции, используя RevertAid™ First Strand cDNA Synthesis Kit, Fermentas в соответствии с рекомендациями производителя. Далее проводили ПЦР по следующей схеме: 95°С – 30 с, затем 35 циклов (95°С – 30 с, Tm – 30 мин, 72°С – 45 с) и 72°С – 7 мин. Использовавшиеся праймеры указаны в таблице. Температуру отжига праймеров (Tm) определяли при помощи онлайн-сервиса Oligo Analizer (Integrated DNA technologies, http://eu.idtdna.com/analyzer/ applications/oligoanalyzer/).

Иммуноцитохимический анализ

Использовали следующие антитела: к Oct4 (Santa Cruz, США), к Nanog, SSEA-1, Tra-1-81, Tra-1-60 (Milllipore, США), к десмину, клону D33 (Dako, Дания), к тропомиозину (Santa Cruz, США), к α-актинину (Santa Cruz, США), к тропонину Т (Thermo Scientific, США). Для иммуноцитохимической реакции колонии репрограммированных клеток выращивали на покровных стёклах. Сокращающиеся спонтанно кластеры кардиомиоцитов механически изолировали и культивировали в течение 3 сут. на среде IMDM, содержащей 5% эмбриональной телячьей сыворотки и раствор заменимых аминокислот, на чашках Петри с гидрофобной поверхностью. Для получения суспензии клетки инкубировали в растворе коллагеназы II (300 ед./мл) и коллагеназы IV (200 ед./мл) (Worthington Biochemical, США) в среде DMEM в течение 30 мин, регулярно перемешивая. Полученную суспензию центрифугировали в течение 3 мин при 1200 g, супернатант удаляли, ресуспендировали в среде IMDM, содержащей 3% эмбриональной телячьей сыворотки и раствор заменимых аминокислот, и высевали на покровные стёкла, предварительно покрытые желатином.

Препараты анализировали при помощи флуоресцентного микроскопа Axio Observer (Carl Zeiss, Германия). Обработку изображения производили в программе Axiovision Rel.4.7 (Carl Zeiss, Германия).

Результаты

Получение кардиомиоцитов из КПКМ

На начальном этапе работы мы следовали опубликованному протоколу получения кардиомиоцитов из резидентных стволовых клеток миокарда[6]. Из фрагмента послеоперационного миокарда человека была получена культура так называемых КПКМ. Далее эти клетки были индуцированы к дифференцировке, как это описано ранее[6]. Через 24 сут. клетки изменяли морфологию, однако спонтанных сокращений мы не наблюдали. Для подтверждения дифференцировки в кардиомиоцитарном направлении мы проверили экспрессию маркеров, специфичных для кардиомиоцитов. В дифференцированных клетках детектировались саркомерные белки: α-актинин и тропонин I (рис. 1), мРНК, специфичных для кардиомиоцитов маркеров тропонина Т и MEF 2C и несколько повышалась экспрессия маркера кардиомиоцитарной линии Nkx 2.5, который на высоком уровне уже присутствовал в клетках-предшественницах, что свидетельствовало о кардиомиоцитарной природе полученных из миокарда клеток (рис. 2).

Однако маркер мышечной дифференцировки MHC (тяжёлая цепь миозина), а также специфические для кардиомиоцитов маркеры (десмин и сердечный актин) ни в предшественниках, ни в дифференцированных клетках выявить не удалось.

Таким образом, из фрагмента миокарда взрослого человека была получена культура клеток-предшественниц, способных к дифференцировке в кардиомиоцитарном направлении с экспрессией ряда специфичных для кардиомиоцитов маркеров.

Получение кардиомиоцитов из ММСК жировой ткани

ММСК жировой ткани были получены по описанной ранее методике и проанализированы на экспрессию стандартной для ММСК панели маркеров[17]. По данным иммунофенотипирования донорские клетки 3 пассажа имели следующий фенотип: CD73+/CD90+/CD105+; эндотелиальные и гемопоэтические маркеры (CD19, CD 34, CD45) определялись на минимальном уровне.

Была индуцирована дифференцировка ММСК в кардиомиоцитарном направлении с помощью 5-азацитидина, как это было описано ранее[9]. Полученные в результате клетки были проанализированы таким же образом, как это описано выше для предшественников кардиомиоцитов. По нашим оценкам (согласно визуальному подсчёту клеток) 0,1% клеток экспрессировал α-актинин и тропонин I. Таким образом, воздействие 5-азацитидина не приводило к эффективной дифференцировке ММСК в кардиомиоцитарном направлении.

Репрограммирование фибробластов кожи человека

Репрограммированные клетки получали из фибробластов кожи путём их трансдукции лентивирусом, содержащим набор кодирующих последовательностей: Oct 3/4, Klf4, Sox2, cMyc, необходимых для экспрессии 4 функциональных транскрипционных факторов. В ходе исследования были получены и проанализированы несколько линий репрограммированных клеток, как это общепринято.

Характеристика репрограммированных клеток включала анализ ряда маркеров плюрипотентности, экспрессирующихся в иПСК и ЭСК. Методом ПЦР с обратной транскрипцией c использованием праймеров, комплементарных 5’-некодирующему участку мРНК, была показана эндогенная экспрессия транскрипционных факторов: Oct 3/4, Nanog, Sox2, cMyc, что свидетельствует о состоянии плюрипотентности репрограммированных клеток (рис. 3). С помощью иммуноцитохимического исследования была выявлена экспрессия поверхностных антигенов: Tra-1-60, Tra-1-81, SSEA-3 и транскрипционных факторов: Oct 3/4, Nanog (рис. 4). Экспрессия маркеров плюрипотентности между линиями практически не различалась.

Дифференцировка репрограммированных клеток в кардиомиоциты

Индукцию дифференцировки линий репрограммированных клеток в кардиомиоциты осуществляли по ранее опубликованному методу[18] с авторскими модификациями. Преимуществом такого протокола является возможность его применения для эффективной дифференцировки репрограммированных клеток, полученных из различных типов исходных клеток. Это позволяет использовать большой спектр тканей в качестве источника первичной культуры клеток для репрограммирования.

Ключевой стадией дифференцировки является состояние эмбриоидных тел – клеточных агрегатов, формирующихся при помещении колоний репрограммированных клеток на неадгезивную поверхность. Модификацией опубликованного метода являлось применение ингибитора p38 MAPK киназы SB 203580[20].

На 7-е сут. дифференцировки наблюдали спонтанные ритмические сокращения отдельных эмбриоидных тел. Сокращение эмбриоидных тел учащалось в присутствии адреналина и угнеталось верапамилом с проявлением характерной для кардиомиоцитов фармакокинетики. На 35-е сут. дифференцировки в кардиомиоцитах выявляли специфические транскрипционные факторы и белки саркомера. Была выявлена мРНК транскрипционных факторов GATA 4 и MEF 2C и белки саркомера: тяжёлая и лёгкая цепи миозина, сердечная изоформа тропонина Т, десмин, тропомиозин, α-актинин (рис. 5). Наблюдалась поперечная исчерченность клеток, характерная для зрелых кардиомиоцитов.

Таким образом, использование данного метода привёло к получению функционально активных кардиомиоцитов.

Обсуждение

Нами проведено сравнение трех методов получения кардиомиоцитов человека in vitro: из КПКМ, из ММСК жировой ткани и из репрограммированных клеток. Метод получения кардиомиоцитов из ММСК являлся весьма привлекательным из-за доступности биологического материала, а также из-за технической простоты и относительно низкой стоимости. Однако, согласно нашим данным, индукция дифференцировки ММСК при помощи 5-азацитидина приводила к появлению крайне низкого количества кардиомиоцит-подобных клеток, и, по-видимому, можно говорить об относительной неэффективности этого метода. В литературе не существует единого мнения на эту тему. Так, сообщалось об успешном получении кардиомиоцитов этим способом[9], в то же время, опубликованы данные и о неэффективности метода[21]. Недавно было показано, что среди популяции ММСК жировой ткани существует небольшая субпопуляция клеток, экспрессирующих ранние маркеры кардиомиоцитов – GATA4 и Nkx2.5, – и высказано предположение, что именно такие клетки могут служить предшественниками кардиомиоцитов в популяции ММСК[22]. Кроме того, опубликованы работы, показывающие возможность дифференцировки ММСК в кардиомиоциты и мышечные клетки при помощи ко-культивирования с первичными мышечными клетками, что также указывает на существование мышечного и кардиогенного потенциала в популяции ММСК[23–25], однако эффективные методы индукции дифференцировки этих клеток в мышечном и кардиомиоцитарном направлении остаются предметом дальнейших исследований.

Дифференцировка выделенных из миокарда клеток-предшественниц в направлении кардиомиоцитов[6] приводила к видимым изменениям во всей дифференцирующейся популяции, однако из функциональных белков кардиомиоцитов мы смогли детектировать экспрессию лишь α-актинина и тропонина I, в то время как другие белки, характерные для функциональных кардиомиоцитов – десмин и тропонин Т – выявить не удалось. Таким образом, можно говорить скорее о получении этим способом популяции клеток, подобных кардиомиоцитам. Это подтверждают опубликованные данные о том, что дифференцировочная способность клеток-предшественников кардиомиоцитов недостаточна для регенерации миокарда при его повреждении[22]. Несмотря на всё это, данный метод имеет дальнейшие перспективы, в частности, при изучении популяции резидентных стволовых клеток миокарда. Существуют данные о том, что в миокарде разных желудочков и разных предсердий содержатся популяции резидентных стволовых клеток разной потентности[5, 26]. Приведённый метод получения клеток-предшественниц кардиомиоцитов смог бы пролить свет на этот вопрос при исследовании постоперационного и донорского миокарда.

Наиболее эффективным оказался способ получения кардиомиоцитов путём дифференцировки репрограммированных клеток. Репрограммирование осуществлялось факторами Oct 3/4, Klf4, Sox2, cMyc. Был проведён анализ экспрессии полученными клетками общепринятой панели маркеров (рис. 3, 4). Эффективность дифференцировки в кардиомиоциты составила около 10%, что соответствует опубликованным другими группами исследователей данным[18]. На функциональную зрелость кардиомиоцитов указывали несколько факторов: экспрессия специфических белков; способность к спонтанным сокращениям, специфическая реакция на добавление фармакологических препаратов. Необходимо отметить, что наблюдаются различия в экспрессии кардиоспецифичных маркеров между кардиомиоцитами, полученными из различных линий репрограммированных клеток (рис. 5, 6).

К неоспоримому преимуществу этого метода можно отнести то, что его использование даёт возможность получить клетки от конкретного пациента из доступного малоинвазивным способом биоматериала (например, биоптата кожи или жировой ткани). В настоящее время общепринято, что репрограммированные клетки являются перспективным источником для разработок в рамках регенеративной медицины, а также мощным исследовательским инструментом при изучении патогенеза заболеваний. Тем не менее, необходимо отметить ряд существенных ограничений, с которыми встретится исследователь при использовании этого подхода. Процесс получения репрограмированных клеток занимает около 3 мес. В каждом конкретном случае необходимо получить и охарактеризовать несколько линий репрограммированных клеток, а затем наиболее эффективно репрограммированные линии индуцировать к дифференцировке. В настоящее время нет единого мнения о том, какой именно протокол получения кардиомиоцитов из иПСК и ЭСК наиболее эффективен[27, 28]. Существует несколько основных разновидностей методов с большим количеством модификаций, которые непрерывно совершенствуются. Кроме того, известно, что результаты индукции дифференцировки могут зависеть не только от протокола, но и от конкретных сред, сывороток и культуральных компонентов: даже в пределах продукции одного производителя разные партии расходных материалов могут предопределять существенную разницу в уровне дифференцировки клеток.

Успешное получение репрограммированных клеток человека из фибробластов кожи и их дифференцировка в кардиомиоциты позволяет говорить о создании модели кардиомиогенеза и получении культуры кардиомиоцитов in vitro. Полученная модель будет использована нами для исследований механизмов развития сердечных патологий.

Подняться вверх сайта