Поиск Кабинет

Способы мечения клеток для визуализации in vivo

Гены & Клетки: Том VIII, №4, 2013 год, стр.: 33-38

 

Авторы

Соловьева А.О., Зубарева К.Э., Повещенко А.Ф., Нечаева Е.А., Коненков В.И.

ДЛЯ ТОГО ЧТОБЫ СКАЧАТЬ СТАТЬЮ В ФОРМАТЕ PDF ВАМ НЕОБХОДИМО АВТОРИЗОВАТЬСЯ, ЛИБО ЗАРЕГИСТРИРОВАТЬСЯ

На сегодняшний день трансплантация клеток является перспективным направлением лечения различных заболеваний. Терапевтический потенциал клеток зависит от их миграционной активности, изучение которой необходимо для разработки эффективных подходов клеточной терапии. Для исследования выживаемости клеток in vivo и их распределения в организме после трансплантации применя- ются различные подходы. В данном обзоре представлены сравнительные характеристики контрастных агентов, таких как флуоресцентные красители, наночастицы, радиоактивные метки, репортерные гены, описаны особенности их взаимодействия с клетками. Проанализированы основные достоинства и недостатки различных способов контрастирования клеток.

Трансплантация клеток является быстроразвивающимся и перспективным направлением терапии различных заболеваний сердечно-сосудистой [1], нервной [2], эндокринной [3], иммунной систем [4], опорно-двигательного аппарата [5] и др. Такой подход предполагает способность трансплантированных клеток восстанавливать или регулировать функции поврежденных органов за счет пролиферации, дифференцировки, выделения различных биологически активных веществ в зоне патологического очага. Для развития клеточных технологий и применения их в клинической практике необходимо получить детальную информацию о выживаемости, пространственном распределении и точной локализации трансплантированных клеток в организме реципиента. В данном обзоре представлены и проанализированы характеристики наиболее часто применяемых способов маркирования клеток.

J.V. Frangioni с соавт. (2004) были предложены следующие характеристики идеального маркера для изучения распределения и функционирования трансплантированных клеток в организме реципиента: биосовместимость, безопасность экзогенных контрастных агентов; отсутствие необходимости генетической модификации клетки; определение единичной клетки в любой локализации; возможность оценки количества клеток; минимальное снижение количества контрастного агента при делении клетки; минимальный перенос контрастных агентов окружающим клеткам; длительная визуализация трансплантированных клеток (месяцы, годы) [6]. На сегодняшний день маркера, соответствующего всем выше изложенным параметрам, не существует. Каждый метод мечения клеток имеет свои достоинства и недостатки, поэтому выбор оптимального маркера будет зависеть от поставленных исследователем задач.

Маркеры для исследования миграции трансплантированных клеток можно разделить на два класса: эндогенные (Y-хромосома), конститутивно присутствующие в клетках и экзогенные, внесенные извне. Последние в свою очередь можно разделить на прямые неспецифические (флуоресцентные красители, наночастицы, радиоактивны метки) и непрямые специфические (репортерные гены) (рис.).

Эндогенные маркеры Наиболее достоверными маркерами для трекинга (отслеживания) клеток являются их «внутренние, собственные» – нормальные компоненты клеток [6]. К таким маркерам можно отнести гены Y-хромосомы при сингенной трансплантации клеток самцов-доноров самкам-реципиентам. Данная метка детектируется методом ПЦР и флуоресцентной гибридизацией in situ, а маркер характеризуется высокой стабильностью, отсутствием влияния на функциональную активность клетки и возможностью использования в долгосрочных экспериментах. Эта метка применяется на протяжении последних десятилетий [7, 8], но до сих пор не потеряла своей актуальности при исследовании количественного распределения трансплантированных клеток в организме реципиента [9–12]. Однако основным её недостатком является невозможность применения для прижизненной визуализации трансплантированных клеток в организме реципиента.

Экзогенные маркеры

Неспецифическое прямое мечение клеток Флуоресцентные красители для исследования миграции трансплантированных клеток в организме реципиента успешно используются на протяжении многих лет. Метод основан на поглощении красителей клетками из культуральной среды. По механизму окрашивания клеток красители делятся на мембранные (Dil, Dio, PKH26 и др.), цитоплазматические (CFSE, CFDA и др.) и ядерные (Hoechst, DAPI и др.). Мембранные флуоресцентные красители представляют собой липофильные производные карбоцианинов, которые проникают в клетки путем латеральной диффузии. маркеры, применяемые для изучения миграционной активности клеток, не должны влиять на их функциональную активность, что и показано для данной группы красителей[13].

Наиболее предпочтительными для исследований in vivo являются красители семейства PKH (PKH2, PKH26, PKH67). Это связано с длительным сохранением метки (до месяца), что позволяет проводить продолжительный мониторинг миграции клеток, и высокой интенсивностью флуоресценции[14, 15]. Также из этой группы красителей в экспериментальных исследованиях на животных часто используется флуорофор Dil, который привлекателен также за счет относительно низкой стоимости[15, 16].

К цитоплазматическим красителям относятся главным образом кальцеин, 2`,7`-бис-(2карбоксиэтил)-5(6)-карбоксифлуоресцеин (BCECF), диацетат флуоресцерина (FDA), 5(6)-карбоксифлуоресцеин диацетат (CFDA), эфир ацетоксиметила (CFDA-AM) и CFSE[17]. Механизм их проникновения в клетку основан на присутствии в структуре молекулы липофильных ацетатных (ацетоксиметильных) остатков, которые способствуют преодолению цитоплазматической мембраны. Эти функциональные группы чувствительны к внутриклеточным эстеразам. Отщепление ацетатных групп ферментами препятствует выходу красителей из клетки, поэтому скорость элиминации красителя из клетки зависит как от количества заряженных групп в структуре вещества, так и от скорости его взаимодействия с эстеразами. Из представленной группы наиболее устойчивым красителем является CFSE (до месяца), поэтому для долговременного мониторинга миграции клеток в основном применяется именно он[18, 19].

Мембранные и цитоплазматические красители используются для исследования пролиферации, так как при каждом делении клетки интенсивность флуоресценции снижается вдвое[20].

Ядерные красители. Красители данной группы связываются с АТ-богатыми участками малой бороздки ДНК клеток. Для этих красителей показано отсутствие (или минимальное) влияния на жизнеспособность и дифференцировочный потенциал клеток[21]. Однако, связываясь с ДНК, эти соединения ингибируют пролиферацию клеток. Наиболее широко используемыми красителями данной группы являются DAPI и Hoechst33342. Скорость выведения маркера, по-видимому, зависит от типа изучаемых клеток. Так, в лимфоцитах показано присутствие красителя Hoechst до 4 сут.[22, 23], а в мультипотентных мезенхимальных стромальных клетках костного мозга – до 1 мес.[24].

В работах других авторов описан метод идентификации отдельной популяции гемопоэтических клеток, которые имеют уникальную способность быстро выводить Hoechst33342[25, 26].

Достоинствами способа маркировки клеток с использованием красителей являются доступность, простота исполнения, отсутствие генетической модификации клеток и возможность применения для исследования пролиферации. К недостаткам данного способа относятся нестабильность метки (выведение красителя из клетки) и возможность переноса красителя в окружающие клетки. Основные достоинства и недостатки наиболее часто применяемых красителей представлены в табл.

Наночастицы представляют собой комплексы или частицы, имеющие размер до 100 нм; широко используются как в исследовательской, так и в клинической практике[27, 28]. Наночастицы применяются для изучения распределения клеток после трансплантации и могут быть синтезированы с лабильными размерами, формой, структурой, физическими свойствами (электронными, магнитными, оптическими, термическими)[29, 30].

Условия визуализации с применением наночастиц отличаются по своей чувствительности, разрешению, глубине проникновения и возможности количественного анализа[31].

Наночастицы по способу детекции делят на три класса:

1) флуоресцентные наночастицы для флуоресцентной визуализации;

2) магнитные наночастицы для магнитно-резонансной томографии (МРТ);

3) радиоизотопы, заключенные в наночастицы, для позитронно-эмиссионной томографии (ПЭТ) и однофотонной эмиссионной компьютерной томогра- фии (ОФЭКТ).

Флуоресцентные наночастицы для флуоресцентной визуализации. Оптическая визуализация является одной из наиболее широко используемых технологий для изучения миграции трансплантированных клеток из-за её быстрой системы оценки, большого временного разрешения, низкой стоимости, отсут- ствия излучения и высокой чувствительности (пре- дел чувствительности 10–12 М метки)[32].

Для отслеживания клеток с помощью оптической визуализации применяются квантовые точки, которые состоят из флуоресцентных полупроводниковых наночастиц (диаметр 2–5 нм). В одной из первых работ показано применение квантовых точек в качестве метки для исследования распределения клеток в организме реципиента с помощью флуоресцентной микроскопии[33].

Способ контрастирования клеток с помощью квантовых точек имеет следующие преимущества: высокая фотостабильность и интенсивность флуоресценции, широкая полоса возбуждения и узкий пик флуоресценции, положение которого регулируется выбором размера нанокристалла и его составом. Эти свойства позволяют использовать одновременно несколько нанокристаллов в качестве меток различных популяций трансплантированных клеток в одном эксперименте. Однако существующие на данный момент квантовые точки не подходят для клинического применения из-за высокой токсичности. Для нивелирования этого недостатка в настоящее время ведутся активные разработки по созданию биосовместимых покрытий наночастиц (напр. хитозан, альгинат и др.), снижающих токсичность[31]. Магнитные наночастицы для МРТ. Магнитно-резонансная томография – это неинвазивный способ визуализации, основанный на измерении электромагнитного отклика ядер атомов водорода. МРТ практически не имеет ограничений по объему и глубине изучаемого объекта, поэтому отлично подходит для исследования целого организма[34, 35]. Пространственное разрешение МРТ составляет около 10 мкм, а средний размер клеток – 5–50 мкм, поэтому МРТ может применяться для исследования миграции трансплантированных клеток.

Магнитные наночастицы для применения в качестве контрастных агентов для МРТ состоят из магнитного ядра (например, оксид железа), покрытого оболочкой (например, сульфид цинка или кадмия), на поверхности которой располагаются функциональные группы. Безопасность и удобство МРТ с применением магнитных частиц позволило провести несколько клинических исследований, включая определение миграции дендритных клеток у пациентов с меланомой, нервных стволовых клеток у пациентов с повреждением головного мозга, CD34+-гемопоэтических стволовых клеток у пациентов с хроническим повреждением спинного мозга, клеток островков Лангерганса у больных сахарным диабетом[36].

Радиоизотопы, заключенные в наночастицы, для ПЭТ и ОФЭКТ. Однофотонная эмиссионная компьютерная томография – это диагностический метод создания томографических изображений с использованием главным образом агентов с гамма-излучающими радиоизотопами (технеций-99м (99mTc), индий-111 (111In), йод-123 (123I), йод-131 (131I)). Позитронно-эмиссионная томография – это радионуклидный томографический метод исследования, основанный на детекции позитрон-излучающих радиоизотопов (кислород-15[15O], углерод-11[11C], азот-13[13N], фтор-18[18F])[37]. Первая группа агентов продуцирует гамма-лучи различных энергетических уровней, которые детектируются ОФЭКТ камерой. Позитрон-излучающие радиоизотопы производят высокоэнергетические гамма-лучи, которые характеризуются способность глубоко проникать в ткани, что обуславливает возможность применения такого подхода для исследований не только на мелких животных, но и на человеке[38].

Одним из самых больших преимуществ ПЭТ и ОФЭКТ является высокая чувствительность (ОФЭКТ 10-10–10-11 М, ПЭТ 10-11–10-12 М), что допускает применение малых, нефармакологических доз (нанограммы) метки для визуализации[39]. С применением контрастных агентов (2-[F-18]-фтор-2дезокси-D-глюкоза для ПЭТ, октреотид для ОФЭКТ), зарегистрированных Управлением по контролю качества пищевых продуктов и лекарственных препаратов США (FDA), проведено множество доклинических и несколько клинических исследований[40].

Основными недостатками данных методов являются: низкое пространственное разрешение, что не позволяет установить точную локализацию трансплантированных клеток в органе; радиационная нагрузка на пациента; короткий период жизни радиоизотопов, который ограничивает продолжительность отслеживания клеток[41].

Решением этих проблем может стать применение наночастиц. Такие радиоизотопы, заключенные в наночастицы, получают путем хелатирования радиоизотопных ионов в предварительно синтезированные наночастицы, что приводит к уменьшению облучающего воздействия на пациента и увеличению срока детекции. Для подобных целей применяют наночастицы на основе различных полимеров[42] или неорганические наночастицы (квантовые точки)[43].

Такой подход позволяет совмещать в одном исследовании два способа детекции: высокую чувствительность ПЭТ с высоким пространственным разрешением МРТ или флуоресцентной визуализации[43, 44]. Например, показано, что аминосилан, покрытый магнитными наночастицами, может функционировать с флуоресцентным красителем (флуоресцеином) и позитрон-излучающим радиоизотопом (галлий-68)[45].

Несмотря на то, что контрастные агенты на основе наночастиц часто используются для исследования миграции клеток, есть определенные риски, связанные со снижением количества контрастного агента при делении клетки, переносом наночастиц в окружающие клетки и недостаточным количеством информации о влиянии метки на функциональную активность клеток.

Непрямое специфическое мечение клеток Репортерные гены. Выявление продукта экспрессии репортерных генов является одним из подходов для визуализации трансплантированных клеток. Метод основан на использовании генов, которые кодируют зеленый флуоресцентный белок (GFP) и его производные; β -галактозидазу; тимидинкиназу и др.[46, 47]. Однако этот подход требует инвазивных методов детекции (биопсия или эксплантация органа с последующим гистологическим анализом) за исключением поверхностных «просвечивающих» тканей, в которых возможна неинвазивная детекция GFP[48].

Для неинвазивного in vivo мониторинга распределения трансплантированных клеток применяется биолюминесцентная визуализация, основанная на детекции видимого света, выделяемого в результате реакции фермента люциферазы с субстратом люциферином[49]. Чувствительность детекции зависит от длины волны испускаемого света, уровня экспрессии фермента в целевых клетках, локализации источника люминесценции в животном, эффективности оптики и чувствительности детектора[50]. Длина волны эмиссии люциферазы и ее аналогов составляет более 600 нм, что соответствует красной и инфракрасной области спектра, которая глубоко проникает в ткани млекопитающих[51, 52]. Данная область спектра характеризуется минимальным рассеиванием и поглощением окружающими тканями, что увеличивает эффективность детекции[53].

Большое количество репортерных генов используются для радионуклидной визуализации. Как правило, такие гены делят на три различных класса: кодирующие либо рецепторы, либо ферменты, либо белкипереносчики. При использовании рецептор-основанных репортеров радиоактивная метка связывается с рецептором допамина D2 (D2R), который кодирует репортерный ген. Ферменто-основанные системы используют репортерный ген для продукции специфических ферментов, таких как тирозинкиназа вируса простого герпеса I типа (HSV1-TK), который модифицирует радиоактивную метку, препятствуя ее выходу из клетки. Третий класс репортерных генов кодируют белки-переносчики радиоактивных меток (симпортеры). Например, для переноса радиоактивного йода используется переносчик йодида натрия[54].

Использование репортерных генов позволяет оценить распределение введенных клеток в реальном времени в течение продолжительного периода. Преимуществом данного метода является дополнительная возможность изучения функциональной активности клеток. Также одним из преимуществ использования репортерных генов является то, что сигнал генерируется только живыми клетками. Однако флуоресцентные белки характеризуются низкой фотостабильностью, что ограничивает продолжительность их использования. Этот метод подходит только для исследования на небольших животных, поскольку ограничен глубиной проникновения волны эмиссии метки в ткани. Недостатком этого метода также является необходимость модификации генетического материала клетки, что может привести к изменению её функциональной активности, а также трудоемкость процесса получения культуры клеток, стабильно экспрессирующей репортерный ген на протяжении продолжительного периода времени.

Заключение

На данный момент существует значительное разнообразие контрастирующих агентов и систем их детекции. Каждый способ мечения клеток имеет свои достоинства и недостатки, поэтому выбор оптимального варианта определяется конкретными задачами исследования.

Перспективы развития данного направления связаны с поиском контрастных агентов, способных передавать информацию не только о распределении клеток, но и об их функциональном состоянии и взаимодействии с микроокружением.

Также на настоящий момент ведется разработка новых универсальных маркеров, которые могут детектироваться одновременно несколькими методами визуализации, что позволит получить максимальную информацию о распределении трансплантированных клеток. Например, mbGluc-biotin – это новый репортерный ген, который можно одновременно детектировать посредством ОФЭКТ, магнитно-резонансной и флуоресцентной томографии[65]. Это позволяет сочетать высокую чувствительность ОФЭКТ с высоким пространственным разрешением МРТ или флуоресцентной визуализации.

Быстрый прогресс в разработке маркеров, наряду с усовершенствованием систем визуализации in vivo приближают применение контрастирующих агентов в клинической практике в качестве диагностического средства при клеточной трансплантации.

Подняться вверх сайта