Поиск Кабинет

Способность миокарда крыс к самообновлению в экспериментах in vitro: пролиферативная активность неонатальных кардиомиоцитов

Гены & Клетки: Том VI, №4, 2011 год, стр.: 66-70

 

Авторы

Голованова Т.А., Белостоцкая Г.Б.

ДЛЯ ТОГО ЧТОБЫ СКАЧАТЬ СТАТЬЮ В ФОРМАТЕ PDF ВАМ НЕОБХОДИМО АВТОРИЗОВАТЬСЯ, ЛИБО ЗАРЕГИСТРИРОВАТЬСЯ

Полное прекращение деления кардиомиоцитов (КМЦ) в сердце млекопитающих в первую неделю постнатальной жизни является неразрешенной загадкой эволюции и непреодолимым препятствием для гистотипической регенерации поврежденного миокарда у человека. Было показано, что в первичной культуре кардиомиоцитов новорожденной крысы воспроизводятся процессы, происходящие в сердце в раннем постнатальном онтогенезе. Как и in vivo после всплеска митотической активности в первые 2–4 сут. жизни, деление КМЦ в культуре также прекращалось через 4–5 сут. после посева. При этом, как и в организме, наблюдалось митотическое деление 60% клеток, после прекращения которого происходило нарастание их объема, что также аналогично процессу гипертрофии клеток в организме. Объем кардиомиоцитов увеличивался с 819±68 мкм3 в 1-е сут. до 1532±212 мкм3 на 3-и и до 3246±190 мкм3 на 6-е сут. культивирования. Причем скорость нарастания объема клеток в культуре практически полностью совпадала со скоростью гипертрофии КМЦ в организме. Как и in vivo гипертрофия сопровождалась образованием полиплоидных и многоядерных, в основном двуядерных клеток. Анализ перераспределения кардиомиоцитов по объему в процессе культивирования указывает на то, что 60% кардиомиоцитов переходят от гиперплазии к гипертрофии, останавливаясь на границе фаз G2/M.

Полученные результаты позволяют утверждать, что первичная культура клеток миокарда адекватно воспроизводит события, происходящие in vivo, и является ценным инструментом для изучения процессов, прекращающих пролиферацию кардиомиоцитов взрослых млекопитающих.

Утрата способности клеток сердечной мышцы млекопитающих к самообновлению, присущему костистым рыбам и амфибиям, которые полностью восстанавливают объем и функцию сердца при удалении 20% миокарда [1], является непреодолимым препятствием для полноценной гистотипической регенерации поврежденного миокарда у человека. Было установлено, что переключение гиперплазии на гипертрофию происходит в сердце млекопитающих между 3-и и 4-и сут. после рождения [2, 3]. Кроме того, было показано, что в постнатальном периоде значительно возрастает доля S-фазных кардиомиоцитов [4], а также снижается экспрессия и активность ряда регуляторов клеточного цикла и утрачивается пролиферативная активность взрослых миоцитов [5], что вызывает их остановку в клеточном цикле [2–6].

Прекращение пролиферации кардиомиоцитов у взрослых млекопитающих и поиски путей, способных заставить их возобновить деление, или клеток, способных дифференцироваться в полноценные кардиомиоциты в локусе повреждения сердечной мышцы, послужило в последнее время толчком к появлению большого количества работ, посвященных этим вопросам. Работа американских ученых [7] о полном восстановлении структуры и функции миокарда однодневных мышей после 15% резекции левого желудочка продемонстрировала наличие регенерационного потенциала у млекопитающих в раннем неонатальном периоде и полного прекращения этой функции в конце первой недели жизни.

Целью нашего исследования было изучение «поведения» клеток миокарда новорожденной крысы в первичной культуре в первые дни после посева для сопоставления с процессами, происходящими в организме млекопитающих в первые дни после рождения. Это позволило создать клеточную модель для последующего изучения причин полного прекращения пролиферации зрелых кардиомиоцитов в сердце млекопитающих.

Материал и методы

В работе использовали новорожденных крыс линии Wistar, усыпленных ингаляцией СО2 (согласно международным правилам работы с животными). При ферментативном разрушении сердечной мышцы использовали метод Лэма с соавт. (2002) в собственной модификации [8]. Выделенные сердца промывали в растворе Рингера (мМ: 146 NaCl, 5 KCl, 2 CaCl2, 1 MgCl2, 11 глюкозы, 10 HEPES, pH-7,4), измельчали и инкубировали в этом же растворе с добавлением коллагеназы I типа (Sigma, США) в концентрации 1 мг/мл и 0,12% трипсина (Биолот, РФ) в течение 20–30 мин при температуре 37оС. Полученную суспензию отстаивали в течение 2–3 мин для осаждения неразрушенных кусочков ткани. Супернатант осаждали на центрифуге при 1500 об/мин в течение 10 мин. Клетки переносили в теплую питательную среду DMEM c 10% сыворотки плодов коров (Биолот, РФ) с добавлением 50 ед/мл пенициллина и 50 мкг/мл стрептомицина (Биолот, РФ) и преинкубировали в стеклянных чашках Петри (Медполимер, РФ) в течение 30–40 мин для очистки популяции от примеси посторонних клеток. Клетки выращивали в 40 мм чашках Петри на 2 полосках покровного стекла (12×24 мм), предварительно покрытых слоем поли-д-лизина в концентрации 0,1 мг/мл (Эпидбиомед, Россия). Рассев производили в концентрации 1×105 кл/мл. Культивирование проводили в СО2инкубаторе при 5% СО2, влажности 95% и температуре 37°С. Питательную среду меняли дважды в неделю.

Для построения кривой роста клетки выращивали в 24-луночных планшетах (Costar, США) в 0,5 мл питательной среды. Каждый день в камере ФуксаРозенталя подсчитывали количество клеток в лунках, снимая их с поверхности с помощью смеси 0,25% трипсин/0,03% версен (Биолот, РФ) в соотношении 1:3. Данные 4 экспериментов с тремя повторами в каждом усредняли.

Способность сердечных клеток к делению оценивали по митотическому индексу (МИ) и накоплению митотических клеток в присутствии колхицина (Кх). МИ (отношение числа митотических ядер к интерфазным) и долю многоядерных клеток определяли на окрашенных гематоксилином препаратах путем подсчета 1000 клеток на каждый срок фиксации с использованием тринокулярного светового микроскопа H 605T (WPI, США). Клетки выращивали на покровных стеклах и ежедневно фиксировали смесью ледяной уксусной кислоты и спирта (1:3). Кх в конечной концентрации 0,05 мкг/мл добавляли ежедневно в очередные 3 лунки планшета с клетками и определяли долю к-митозов на микроизображениях, полученных на следующий день (через 24 ч).

Кинетику изменений и морфологию клеток прослеживали путем прижизненного микрофотографирования растущей популяции в чашках Петри на инвертированном микроскопе с использованием цифровой камеры или на окрашенных гематоксилином препаратах. Морфометрические параметры клеток определяли на микроизображениях клеток, снятых с поверхности смесью трипсин/версен (1:3), с помощью программы ВидеоТестМорфология (ВидеоТестМорфология, РФ). Объем клеток вычисляли по формуле:

V = 3,14/6·d2·D,

где d – малый диаметр (ширина); D – большой диаметр клетки (длина).

Микроизображения получали с помощью цветной цифровой камеры Leica DFC300 FX (Германия) и инвертированного микроскопа PIM-III (WPI, США) с объективом ×40.

Статистическую обработку результатов производили с помощью программы Microsoft Excel 7.0. Данные представляли как среднее ± ошибка среднего (M±m).

Результаты

За 4–5 сут. культивирования количество клеток увеличивалось более чем в 4 раза (рис. 1). Данные по накоплению к-митозов, (рис. 2А) демонстрируют всплеск митотической активности со 2-х по 4-е сут. культивирования. Доля клеток, остановленных в метафазе с помощью Кх, достигала 20–23% ежедневно. Затем количество митотических клеток снижалось и держалось на уровне 6–7% в последующие дни наблюдения (7–8 сут.). Таким образом, было установлено, что около 70% кардиомиоцитов вступали в деление на протяжении первых 2–5 сут. развития in vitro, а МИ в этот период колебался в диапазоне от 1,6 до 0,4 % (табл.). При этом митотическое деление на стадиях профазы, метафазы и анафазы регистрировалось не только в первые 5 дней развития клеток миокарда в культуре, но и на всех сроках наблюдения – до 8 сут. (рис. 3). В качестве редкого события было зарегистрировано, что гипертрофированные 6–8-суточные кардиомиоциты не только вступали в митоз, но и могли завершить его благополучным цитокинезом (рис. 3Г).

Параллельно делению клеток было зарегистрировано нарастание среднего объема кардиомиоцитов от 819±68 мкм3 – в 1-е сут., до 1532±212 мкм3 – на 3-и сут. и до 3246±190 мкм3 – на 6-е сут. развития (рис. 2Б).

Значительный разброс клеток миокарда по размеру уже в первые сутки культивирования (следующий день после посева) позволил нам провести условное разделение клеток по объему на 6 субпопуляций: 1 – до 249 мкм3, 2 – от 250 до 499 мкм3, 3 – от 500 до 999 мкм3, 4 – от 1000 до 1999 мкм3, 5 – от 2000 до 3999 мкм3 и 6 – от 4000 до 16000 мкм3 (рис. 4А). Анализ кривых на рис. 4 показывает, что доля клеток 3-й субпопуляции резко падает в первые дни развития культуры, а 2-й субпопуляции – сначала незначительно возрастает с 12 до 17%, а затем снижается до 2–4%. Поскольку при продвижении клеток по митотическому циклу размеры клеток в начале (фаза G1) и конце (фазы G2/M) цикла должны отличаться приблизительно в 2 раза, ко 2-й субпопуляции можно отнести кардиомиоциты, находящиеся в фазе G1, а к 3-ей – клетки в фазе G2/M. Из этого предположения следует, что на следующий день после посева кардиомиоцитов новорожденной крысы преобладали клетки, находящиеся на завершающих стадиях митотического цикла (G2/M). На этот срок культивирования их доля составляла 60%, а после 4 сут. инкубирования доля клеток, принадлежащих к 2-й и 3-й субпопуляциям, не превышала 5% от общего количества клеток.

Из рис. 4Б видно, что параллельно делению миоцитов наблюдается гипертрофическое нарастание объема у части культивируемых клеток. Уже на следующий день после посева 23% клеток превышают размеры пролиферирующих (2-я и 3-я субпопуляции) кардиомиоцитов, имея объем от 1000 до 2000 мкм3. Сначала доля этих клеток возрастает, а затем по мере нарастания количества клеток с объемом от 2000 до 4000 мкм3 (48%) и даже с объемом 4000– 16 000 мкм3 (15%) на 4-й день культивирования – падает. Фракция очень крупных клеток, более 16 000 мкм3, не превышала 3–5%.

Процесс гипертрофии кардиомиоцитов сопровождался появлением полиплоидных (рис. 3И) и многоядерных, в основном двуядерных клеток (см. табл., рис. 3Ж, З). Наличие клеток с двумя ядрами регистрировалось со 2-х сут. (около 1%), доходя до 9,5% к 8-м суткам развития в культуре. Доля кардиомиоцитов с бóльшим числом ядер (3–4) колебалась в диапазоне от 0,1 до 0,2% на всех сроках наблюдения. «Поведению» очень мелких клеток с объемом менее 250 мкм3 будет посвящено следующее сообщение.

Обсуждение

Сопоставление наших результатов в экспериментах in vitro с данными других авторов, полученными на крысах in vivo, выявляет совпадение ряда параметров развития сердечных клеток в постнатальном периоде. Так, нами было установлено, что в первые 4 дня развития в первичной культуре около 60% клеток вступает в митотическое деление, а затем доля делящихся клеток снижается до 6–7% (рис. 2А). В исследованиях на животных было показано, что количество кардиомиоцитов увеличивается на 68% в первые 3 дня постнатального развития [3]. Затем доля клеток, способных к пролиферации, опускается до 16% и держится на этом уровне на протяжении всей жизни животных [9], а объем возрастает в 2,5 раза с 3-го по 12-й день роста крыс (с 1416±320 до 3533±339 мкм3) [3]. Однако в наших исследованиях объем кардиомиоцитов к 3-му дню культивирования возрастал в 1,9 раз, а к 6-му дню – в 4 раза (рис. 2Б).

Много работ посвящено изучению вопроса прекращения пролиферации кардиомиоцитов в постнатальном периоде. Эксперименты на кардиомиоцитах крыс разного возраста (1–12 сут. после рождения) показали, что почти все кардиомиоциты были одноядернымии и объем клеток не изменялся до трехсуточного возраста. На 4-й день появлялись двуядерные миоциты и регистрировалось увеличение объема клеток. Доля клеток с 2 ядрами достигала 90% к 12 сут., причем образованию двуядерных клеток предшествовал синтез ДНК без последующего митотического деления [3]. По нашим данным доля двуядерных миоцитов в первые 3 дня составляла около 1%, увеличиваясь до 3% после завершения волны делений и достигала 9–10% к 8 дню развития в первичной культуре (см. табл.).

Прекращение деления кардиомиоцитов после всплеска митотической активности дало основание считать, что переключение пролиферации на гипертрофию происходит в постнатальном периоде между 3-м и 4-м днями развития [2, 3]. Другими авторами было обнаружено значительное возрастание в процессе развития доли S-фазных миоцитов [4]. Была установлена связь между снижением экспрессии и активности ряда регуляторов клеточного цикла (циклинов и циклин-зависимых киназ) в процессе развития сердечных миоцитов и потерей способности к пролиферации у миоцитов взрослых млекопитающих [5]. А. Лери с соавт. (2000) изучали теломеразную активность, отражающую пролиферативную способность клеток. Авторы регистрировали активность теломеразы в кардиомиоцитах молодых крыс, полностью зрелых крыс и стареющих особей, опровергнув мнение, что кардиомиоциты являются окончательно дифференцированными клетками, потерявшими способность к пролиферации [10]. В наших исследованиях на первичной культуре клеток миокарда новорожденных крыс было выявлено наличие делящихся кардиомиоцитов на различных стадиях митоза уже во время их гипертрофического развития с 6-го по 8-й дни культивирования. Были обнаружены клетки на стадии профазы (рис. 3А), анафазы (рис. 3В) и даже кардиомиоциты, благополучно завершающие деление, на стадии цитокинеза (рис. 3Г). Фигуры митоза были также зафиксированы в многоядерных кардиомиоцитах, причем ядра находились в различных фазах клеточного цикла. Например, в трехядерной клетке 2 ядра – в профазе, а одно – в интерфазе (рис. 3Е), а в двуядерном миоците – одно в интерфазе, а другое – в метафазе (рис. 3Д).

По мнению Г. Брукс с соавт. (1998) прекращение деления кардиомиоцитов млекопитающих характеризуется их задержкой в клеточном цикле [6]. Согласно этой гипотезе авторы предположили, что арест клеток происходит в фазе G1, после чего кардиомиоциты становятся на путь гипертрофии [2, 3]. Однако по другим данным 80% зрелых кардиомиоцитов останавливаются на границе фаз G0/G1 и 15–20% клеток задерживаются в фазах G2/M [4–6].

Анализ перераспределения кардиомиоцитов по объему в процессе культивирования в наших экспериментах (рис. 4А) позволяет предположить, что исходные G2-миоциты с объемом 500–999 мкм3 не переходят в разряд более мелких G1-клеток (объем 250–499 мкм3), по-видимому, из-за блока в G2/M фазе, а начинают увеличиваться в размерах, формируя субпопуляцию крупных кардиомиоцитов с объемом 1000–1999 мкм3 (рис. 4Б). Исходя из доли G2-популяции на следующий день после посева (рис. 4А), мы предполагаем, что 60% кардиомиоцитов переходят от гиперплазии к гипертрофии, останавливаясь на границе фаз G2/M.

В качестве гипотезы, объясняющей прекращение пролиферации кардиомиоцитов через несколько дней после рождения, было выдвинуто предположение, что во время эмбрионального развития клетки миокарда программируются на фиксированное и ограниченное число делений [11]. При этом клетки переходят к постмитотическому состоянию автономно, независимо от окружающей среды – и в организме, и в культуре.

Таким образом, суммируя приведенные данные, можно заключить, что в первичной культуре полностью воспроизводятся процессы, которые происходят в неонатальном миокарде млекопитающих. При этом совпадают не только сроки перехода от гиперплазии к гипертрофии, но и количество делящихся клеток в первые дни после посева (около 60–70%), а также размеры гипертрофированных кардиомиоцитов. Это позволяет рассматривать первичную культуру клеток миокарда новорожденной крысы в качестве адекватной модели для изучения процессов, блокирующих пролиферацию кардиомиоцитов.

Подняться вверх сайта