Поиск Кабинет

Способность миокарда крыс к самообновлению в экспериментах in vitro: колонии сокращающихся неонатальных кардиомиоцитов

Гены & Клетки: Том VII, №1, 2012 год, стр.: 67-72

 

Авторы

Голованова Т.А., Белостоцкая Г.Б.

ДЛЯ ТОГО ЧТОБЫ СКАЧАТЬ СТАТЬЮ В ФОРМАТЕ PDF ВАМ НЕОБХОДИМО АВТОРИЗОВАТЬСЯ, ЛИБО ЗАРЕГИСТРИРОВАТЬСЯ

В первичной культуре клеток миокарда новорожденной крысы на фоне гипертрофии основной популяции зрелых кардиомиоцитов иммуноцитохимически выявлено формирование колоний из мелких (dср = 6,2±0,5 мкм) резидентных c-kit+ и Sca+ стволовых клеток (СК) и предшественников кардиомиоцитов (ПК) Isl1+-типа. С 8-го дня культивирования были выявлены первые сокращающиеся колонии (~1–2 клона на 100 тыс. клеток). Клетки колоний были способны к спонтанной дифференцировке, демонстрируя созревание сократительного аппарата и Ca2+ ответы на кофеин (5 мМ) и K+ (120 мМ). Формирование электромеханического сопряжения с типичным для сердечной мышцы Ca2+-зависимым высвобождением Ca2+ происходило на протяжении 3-х недель. Вначале в колониях регистрировались локальные, слабые, спонтанные, асинхронные и аритмичные сокращения с частотой 2–3 уд/мин, но со временем сокращения становились синхронными и охватывали все клетки колоний, а частота доходила к концу месяца до 58–60 уд/мин. Первые сокращающиеся клоны были образованы Isl1+ ПК, а c-kit+-колонии из-за, возможно, более продолжительного периода пролиферации начинали сокращаться на 9–10 дней позже.

Таким образом, впервые выявлены и изучены сокращающиеся колонии, образованные из СК и ПК при кокультивировании со зрелыми клетками миокарда. Описанный процесс имитирует регенерационный кардиомиогенез от резидентной клетки-предшественницы до колоний зрелых сокращающихся кардиомиоцитов и представляет собой полноценную модель для фундаментальных исследований, тестирования лекарственных препаратов и выявления регенерационного потенциала СК и ПК с целью возможного применения резидентных самообновляющихся клеток в терапии поврежденного миокарда.

Значительные успехи в изучении биологии стволовых клеток (СК) привели к всплеску интереса к ним в плане возможного применения для восстановления поврежденных органов и тканей. В кардиологии из-за ограниченной регенеративной способности сердечной мышцы эти исследования, направленные на поиск источников самообновляющихся кардиомиоцитов, являются особенно актуальными. Если одни исследования нацелены на изучение эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) [1, 2], мультипотентных мезенхимных стромальных клеток (ММСК) [3] или индуцированных плюрипотентных СК [4], то в других – в качестве материала для обеспечения регенерации миокарда рассматриваются наработанные вне организма резидентные СК миокарда и/или предшественники кардиомиоцитов (ПК) [5–7]. При этом во всех случаях для восстановления поврежденной ткани клетки должны не только пролиферировать, но и дифференцироваться в специализированные, полностью функциональные кардиомиоциты, способные интегрироваться в миокард. Однако, несмотря на интенсивные исследования, успехи в области использования клеточных технологий для восстановления миокарда остаются весьма скромными [8, 9]. Поэтому создание клеточных моделей, позволяющих прослеживать все этапы пролиферации и дифференцировки СК и/или ПК, актуально как для фундаментальной науки, так и для клинической практики.

В нашей работе впервые выявлены и описаны колонии сокращающихся кардиомиоцитов, сформированные в первичной культуре клеток миокарда новорожденной крысы. Показано, что в процессе культивирования образуются колонии из резидентных СК c-kit+- и Sca+-типа и ПК Isl1+-типа. Причем последние демонстрируют полное созревание кардиомиоцитов, имитируя регенерационный кардиомиогенез от клетки-предшественницы до колоний зрелых сокращающихся кардиомиоцитов.

Колонии дифференцированных кардиомиоцитов, образованные резидентными СК и ПК в культуре, представляют собой полноценную модель для фундаментальных исследований, а также для поиска и тестирования лекарственных препаратов. Более того, изучение пролиферации и дифференцировки резидентных СК и ПК позволит выявить их регенеративный потенциал с целью возможного применения резидентных самообновляющихся клеток в терапии поврежденного миокарда.

Материал и методы

Получение культуры клеток миокарда описано в предыдущей работе [10]. Кинетику изменений и морфологию клеток прослеживали путем прижизненного микрофотографирования растущей популяции в чашках Петри на инвертированном микроскопе PIM-III (WPI, USA) с использованием цифровой камеры Leica DFC300 FX (Germany) или на фиксированных смесью ледяной уксусной кислоты и спирта (1:3) и окрашенных гематоксилином препаратах на тринокулярном микроскопе H605T (WPI, USA). Микроизображения и видеоролики колоний сокращающихся кардиомиоцитов получали с помощью цифровой камеры и инвертированного микроскопа с объективом ×40.

Регистрацию концентрации свободного внутриклеточного кальция ([Са2+]i) осуществляли с помощью компьютерной системы анализа внутриклеточного содержания ионов (Intracellular Imaging & Photometry System, USA). Программа InCytIm2TM рассчитывала концентрацию ионов кальция по методу Гринкевича [11] как соотношение интенсивностей флуоресценции (F340/F380) с учетом калибровочной кривой. В опытах по измерению [Са2+]i применяли раствор Рингера, содержащий кальций (2 мМ СаСl2), а также бескальциевый раствор Рингера. В качестве раствора с высоким содержанием ионов К+ использовали раствор Рингера с содержанием KCl 120 мМ и NaCl 26 мМ. Для измерения [Са2+]i стекла с клетками инкубировали в растворе Рингера с флуоресцентным красителем Фура-2АМ (Sigma) в концентрации 10 мкМ в течение 1 ч при 26°С. Эксперименты проводили при комнатной температуре.

Уровень дифференцировки кардиомиоцитов в составе формирующихся в первичной культуре колоний определяли по способности рецепторов наружной мембраны и саркоплазматического ретикулума (СР) отвечать повышением [Са2+]i на действие соответствующих агонистов. Были использованы: ацетилхолин (АцХ, Sigma) в концентрации 20 мкМ; кофеин (Кф, Sigma) в концентрации 5 мМ, взаимодействующий с рианодиновыми рецепторами СР, раствор Рингера с повышенным содержанием K+ (120 мМ), вызывающего деполяризацию мембраны и запускающего электромеханическое сопряжение (ЭМС), а также АТФ (180 мкМ), взаимодействующую с пуринэргическими рецепторами.

Для выявления пролиферирующих резидентных ПК и СК культуры, выращенные на покровных стеклах, фиксировали с помощью параформальдегида (2,5–4%), пермеабилизировали в течение 10 мин в фосфатном буферном растворе с добавлением 0,25% Тритона X-100 и использовали 2 варианта иммуноцитохимического окрашивания.

При 1-м варианте ПК и СК метили с помощью антител к антигенам СК и ПК: мышиных анти-c-kit моноклональных антител (5 мкг/мл, Invitrogen), мышиных анти-Sca-1 поликлональных антител (1:100, Abcam) и кроличьих моноклональных анти-islet1 антител (1:100, Abcam). В качестве маркера зрелых миоцитов использовали кроличьи анти-GATA4 поликлональные антитела (1:500, Abcam). Вторичными антителами были козьи антимышиные фикоэритрин-конъюгированные антитела (1:100, Invitrogen), козьи антимышиные конъюгированные с FITC антитела (1:100, Abcam) и ослиные антикроличьи FITC-конъюгированные антитела (1:100, Abcam). Для подавления аутофлуоресценции клетки окрашивали в течение 5 мин. кристаллическим фиолетовым в концентрации 2 мг/мл. Идентификацию клеток колоний осуществляли с помощью флуоресцентного микроскопа PFM (WPI, USA) при увеличении ×100.

В другом варианте иммуноокрашивания применяли первичные мышиные моноклональные антитела к Isl1 (Abcam) и Sca (Abcam) антигенам, конъюгированные с Alexa 405 (Invitrogen), согласно Zenonтехнологии (Invitrogen). Для выявления c-kit+ СК применяли коммерческие конъюгированные с FITC антитела (Abcam). Зрелые кардиомиоциты метили Родамин-Фаллоидином (Sigma) в концентрации 10 мкг/мл. Клетки тестировали с помощью конфокального микроскопа Leica TCS SP5 (Germany) при увеличении ×40.

Результаты

Как было описано в первом сообщении [10], пролиферация клеток неонатального миокарда крыс линии Wistar прекращается после 5-го дня культивирования и сменяется гипертрофией кардиомиоцитов. Однако изучение монослоя культивируемых клеток после этого срока позволило выявить образование незначительного количества колоний разного размера (рис. 1). При культивировании наблюдалось трехмерное увеличение размеров колоний. Более того, на 8-й день развития были выявлены редкие (∼ 1–2 колонии на 100 тыс. клеток), спонтанно пульсирующие колонии с частотой сокращений 2–3 уд/мин (рис. 2А). Клетки, локализованные в центральной части колоний, были значительно мельче окружающих их крупных кардиомиоцитов и, по-видимому, составляли субпопуляцию клеток с объемом до 250 мкм3 [10]. Через сутки после посева они имели dmax = 6,9±0,6 мкм и dmin = 5,4±0,4 мкм (Vср = 141±6 мкм3), в отличие от кардиомиоцитов, которые исчерпали свой пролиферативный потенциал в первые дни культивирования и были отнесены к клеткам 2-й и 3-й субпопуляций [10], с dmax ср=12,3±0,4 мкм и dmin ср = 11,0±0,3 мкм (Vср = 819±68 мкм3).

Регистрация [Са2+]i в отдельных клетках сокращающихся колоний выявила разрозненные асинхронные флуктуации уровня свободного кальция на этом сроке развития (рис. 2Б). Однако по мере культивирования сокращения становились синхронными, а частота доходила до 58–60 уд/мин к концу месячного срока развития культуры (рис. 3).

Основываясь на данных о наличии в миокарде млекопитающих резидентных Sca-1+ и c-kit+ СК [5, 6] и Isl1+ ПК [7], для установления принадлежности клеток колоний к определенному типу пролиферирующих клеток сердца иммуноцитохимически определяли экспрессию Sca-1, c-kit и Isl1 антигенов. На 13 сут. развития клеток миокарда новорожденной крысы в культуре были обнаружены колонии разного размера, содержащие все варианты тестируемых клеток. При этом, по данным флуоресцентной микроскопии, самыми крупными, объемными и дифференцированными оказались колонии, образованные клетками Isl1+-типа (рис. 4А).

Их размеры были сопоставимы с размерами сокращающихся колоний. К 13 сут. культивирования антитела к Sca-1 антигену выявляли небольшие скопления мелких клеток, которые, по всей видимости, представляли колонию кардиомиоцитов на начальной стадии ее формирования. Клоны с клетками c-kit+-типа были крупнее Sca-1+ колоний (рис. 4В) и по размеру были схожи с колониями, содержащими Isl1+-клетки. Видно, что большое количество недифференцированных клеток (c-kit+) располагалось внутри колонии, а зрелые кардиомиоциты (GATA+) – по периферии. По-видимому, из-за незавершившейся пролиферации колонии, образованные c-kit+клетками, были неспособны к сокращению на этом сроке культивирования.

Последовательное сканирование оптических срезов при конфокальной микроскопии позволило установить, что толщина колоний на протяжении 10–17 сут. развития в культуре варьирует от 13 до 97 мкм. При этом на 11–13 сут. размеры Isl1+- и c-kit+-колоний по Z-оси вполне сопоставимы, в то время как Sca1-позитивные колонии были гораздо меньше. Их толщина в эти сроки не превышала 19–20 мкм, но к 17 сут. достигала 56–60 мкм. Средние срезы объемных колоний (рис. 4Б) показывают расположение резидентных ПК и СК внутри колоний. Видно, что Isl1+-клетки (12-й срез из 24) локализуются компактно в центре колонии, имеющей толщину 36 мкм (см. рис. 4Б). По периферии располагаются зрелые кардиомиоциты как исходные, так и дифференцированные из резидентных ПК – часть клеток с развитым цитоскелетом (актин) экспрессировали Isl1-антиген. В c-kit-колонии зона, занимаемая СК (12-й срез из 24), значительно больше, а размер колонии по оси Z составляет 35 мкм. Периферийно расположенные клетки также представлены кардиомиоцитами, частично дифференцированными из СК c-kit+-типа. Плоская колония (19 мкм), сформированная резидентными Sca-1+-клетками, содержала незначительное количество СК в центре (11-й срез из 20), а также отдельные дифференцированные из СК кардиомиоциты.

Факт дифференцировки клеток в составе колоний был подтвержден экспериментами по измерению активности рецепторов наружной мембраны и СР. В отличие от пролиферирующих клеток формирующихся колоний, которые не давали Са2+-ответов на аппликацию АцХ, K+ и Кф, отдельные клетки слабо сокращающейся колонии на 10 сут. развития четко реагировали повышением [Са2+]i на действие АцХ, K+, АТФ и Кф (рис. 5). Выброс Са2+ из СР в ответ на подачу Кф демонстрировало окончательное формирование ЭМС и кардиодифференцировку клеток в составе колоний, образованных в первичной культуре клеток миокарда новорожденной крысы. Более того, было показано, что в бескальциевой среде клетки не демонстрировали Са2+-ответа на действие Кф (см. рис. 5). Это свидетельствует в пользу того, что в процессе роста и созревания сокращающихся колоний резидентные ПК и СК делятся и дифференцируются в кардиомиоциты с формированием типичного, характерного для сердечной мышцы кальций-зависимого высвобождения кальция из СР (CICR). Эти процессы происходят несинхронно: часть клеток, прекратив деление, начинают дифференцировку, в то время как другие СК и ПК еще продолжают пролиферацию.

Обсуждение

В первичной культуре клеток миокарда неонатальных крыс линии Wistar были впервые выявлены и охарактеризованы колонии, образованные резидентными СК и ПК трех типов Sca-1+, c-kit+ и Isl1+. Варьирование размеров колоний как по площади, так и по высоте (см. рис. 1), а также разница в сроках появления первых сокращений свидетельствуют о различиях в скоростях пролиферации и дифференцировки рассмотренных типов СК и ПК. Было установлено, что Sca-1-позитивные СК пролиферируют значительно медленнее других резидентных клеток и образуют мелкие плоские колонии, неспособные к сокращениям, по крайней мере, в течение 25 сут. культивирования. Колонии, образованные c-kit+- и Isl1+-клетками, имели сходные морфометрические параметры, но различные темпы пролиферации и дифференцировки. И, если в Isl1+-колониях разрозненные слабые асинхронные сокращения были зафиксированы уже на 8 сут. культивирования, то первые сокращения клеток c-kit+-колоний были отмечены на 9–10 сут. позже. Поскольку на 13 сут. большое скопление незрелых клеток сосредоточено, по данным иммуноцитохимии, в центре колоний (рис. 4В), указанная задержка может быть обусловлена более продолжительным периодом пролиферации СК c-kit+-типа.

Последующая синхронизация сокращений и нарастание их частоты со временем подразумевает созревание дигидропиридиновых и рианодиновых (РиР) рецепторов и становление ЭМС, соответствующего зрелым дифференцированным кардиомиоцитам. Постепенное сближение рецепторов, обусловленное развитием Т-трубочек, способствует формированию CICR и позволяет дифференцированным клеткам колоний осуществлять типичные для сердечной мышцы сокращения с частотой, доходящей до 58–60 уд/мин. По данным многочисленных исследований CICR в эмбриональном периоде отсутствует, появляясь только через несколько недель постнатальной жизни [12]. При рождении вклад высвобождения Са2+ из СР через РиР составляет не более 15%, в то время как в трехнедельном возрасте доходит до 88% общего внутриклеточного выброса [13]. При дифференцировке резидентных СК и ПК в культуре от момента инициации слабых спонтанных пульсаций отдельных клеток до синхронизированных высокоамплитудных сокращений всей колонии проходит около 18–20 дней, что сходно с модификацией механизма ЭМС от сарколеммно-зависимого при рождении до CICRзависимого в трехнедельном возрасте. Сходная картина наблюдается и в культивируемых ЭСК [2, 14]. Однако, если инкубирование ЭСК воспроизводит эмбриональное развитие клеток сердца [15], то формирование колоний сокращающихся кардиомиоцитов имитирует регенеративный кардиомиогенез.

Таким образом, иммуноцитохимические исследования с использованием антител к антигенам Sca-1, c-kit и Isl1 позволили сопоставить выявленные нами резидентные клетки миокарда с СК и ПК, описанными другими авторами [5–7]. При этом, в отличие от вышеуказанных исследователей, которые стимулировали СК и ПК к дифференцировке, мы регистрировали полную, и, что очень важно, спонтанную дифференцировку резидентных ПК в составе колоний в культуре клеток миокарда крысы во время совместного культивирования со зрелыми кардиомиоцитами.

При формировании колоний резидентные СК и ПК последовательно проходят стадии митотического деления и дифференцировки, формируя сообщество зрелых кардиомиоцитов, способных к сокращению и, возможно, к интеграции в зрелый миокард. Вероятно, что подобные процессы происходят в миокарде (in vivo) при различных ситуациях, запускающих пролиферацию резидентных клеток (инфаркт, ишемия, травмы, повышенная нагрузка). Мы предполагаем, что стадии развития СК и ПК, рассмотренные нами в первичной культуре при образовании сокращающихся колоний в модели естественного окружения, воспроизводят регенерационные процессы в поврежденном миокарде. В связи с этим, формирование колоний в культуре может быть моделью для изучения пролиферации и дифференцировки ПК, а также возможности влияния на эти процессы различных физических факторов или естественных физиологических или биохимических модуляторов. Кроме того, это эффективная модель для изучения природы формирования пейсмекерной активности клеток миокарда, а также для исследования действия фармакологических препаратов на частоту сердечных сокращений.

Подняться вверх сайта