Поиск Кабинет

Спонтанная злокачественная трансформация мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток в культуре – происходит ли она в действительности?

Гены & Клетки: Том IV, №4, 2009 год, стр.: 78-82

 

Авторы

Григорян А.С., Кругляков П.В.

ДЛЯ ТОГО ЧТОБЫ СКАЧАТЬ СТАТЬЮ В ФОРМАТЕ PDF ВАМ НЕОБХОДИМО АВТОРИЗОВАТЬСЯ, ЛИБО ЗАРЕГИСТРИРОВАТЬСЯ

В последние годы в научной литературе появились сообщения о туморогенных свойствах, приобретаемых мультипотент-ными мезенхимальными стромальными (ММСК) клетками при культивировании in vitro. В обзоре обсуждаются возможные механизмы этого феномена и вопрос о том, насколько правомерно говорить об опасности применения ММСК в клеточной терапии.

Введение

Мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки (ММСК) человека считаются одним из самых перспективных видов клеточного материала для клеточной терапии широкого спектра заболеваний и тканевой инженерии. Это тип взрослых стволовых клеток, присутствующий в ряде тканей млекопитающих: ММСК могут быть изолированы из плаценты [1], амниотической жидкости [2], пуповинной крови [3] и жировой ткани [4], но на сегодняшний день наиболее богатым и подходящим для клинического использования их источником считается костный мозг [5]. В первичной культуре ММСК, выделенных из костного мозга, содержится недостаточно клеток для трансплантации, в связи с чем требуется их экспансия in vitro, при которой клетки оказываются в условиях, лишь отчасти приближенных к физиологическим. В отличие от условий in vivo, в культурах клетки лишены своего естественного микроокружения, а, следовательно, продуцируемых им активирующих и ингибирующих сигналов. В связи с этим возникает проблема сохранения нативных свойств ММСК при их культивировании и возможность изменения этих свойств, что может привести к негативным побочным эффектам трансплантации.

Генетические аберрации, которые теоретически могут произойти в клетке при культивировании in vitro, и приобретение клеткой туморогенных характеристик вызывает наибольшее беспокойство как исследователей, так и клиницистов [6—9]. Однако насколько обоснованно это беспокойство? В последние годы в научной литературе появилось не более десяти публикаций, где описаны единичные случаи изменения свойств ММСК при экспансии in vitro. Из-за уникальности измененного клеточного материала каждая отдельная группа исследователей не имеет возможности детально изучить механизмы, лежащие в основе процесса нарушения свойств ММСК в культуре, и сделать уверенные выводы о влиянии подобных нарушений на клиническое применение мезенхимальных клеток. В данном обзоре мы предприняли попытку систематизировать сведения, касающиеся изменений, происходящих с ММСК in vitro, и сделать предположения относительно потенциальной опасности этих изменений с точки зрения клинического применения ММСК.

Изменения свойств ММСК экспериментальных животных при культивировании in vitro и последствия трансплантаций таких клеток в организм

Наиболее распространенным модельным объектом современной клеточной биологии и иммунологии является мышь и клеточный материал, изолированный из тканей этого животного. Экспериментальные данные, полученные в работе на мышах, затем экстраполируют на биологию клеток и тканей человека. Мезенхимальные стромальные клетки не являются в этом смысле исключением, и огромное количество работ, касающихся самых различных аспектов биологии ММСК, проводится ежегодно с использованием ММСК мыши и, несколько реже, крысы и других млекопитающих [данные Public Library of Sciences, www.pubmed.org]. В 2006 г. появились первые сообщения о спонтанной трансформации культур мышиных ММСК, что поставило вопрос о возможности подобных негативных изменений в культурах ММСК человека.

Научная группа под руководством Y.F. Zhou, занимающаяся трансплантацией ММСК в целях реваскуляри-зации конечностей при нарушениях кровотока на модели перевязки бедренной артерии у мышей, первой сообщила о развитии аберрантного генотипа и фенотипа у клеток, выращиваемых в культурах [10]. Клетки были получены стандартным методом из костного мозга мышей линии C57BL/6 и культивированы в течение двух недель, за которые ММСК успевали пройти 3^4 удвоения популяции. После прохождения клетками трех пассажей исследователи обнаружили резкое изменение внешнего вида всех культур: в норме адгезивные к пластику и прекращающие деление при достижении плотного монослоя благодаря механизму контактного ингибирования, ММСК после третьего пассажа формировали округлые многослойные колонии, в которых происходила активная пролиферация клеток, что свидетельствовало об утрате контактного ингибирования. Цитофлуориметричес-кий анализ показал, что у клеток менялся профиль экспрессии поверхностных маркеров.

Внутримышечная трансплантация таких видоизмененных клеток приводила к поразительным результатам: ММСК в 100% случаев формировали опухоли как в тканях мышей с отсутствием иммунной системы (мыши линий nude и SCID), так и в мышцах сингенных животных с функциональной иммунной системой. Анализ биопсий опухолей показал, что они являлись саркомами. Опухоли развивались очень быстро — в течение 3^ 4 нед., при этом во всех к окончанию этого срока начинался процесс внутреннего некроза. Метастазы сарком обнаруживались в легких, где также формировались быстро растущие новообразования, состоящие из малодифференцированных мезенхимальных клеток и небольшого количества клеток, дифференцировавшихся в остеогенном направлении, характерном для нормальных ММСК [11].

Клетки, выделенные из образовавшихся сарком, несли множество хромосомных аберраций. Анализ их ка-риотипа показал, что большинство клеток анеуплоидны, а также содержат от одной до семи робертсоновских транслокаций, возникающих в результате слияния двух акроцентрических хромосом. При проверке кариотипа исходных культур ММСК на третьем-четвертом пассажах обнаружилось, что они также несут сходные генетические аномалии, в отличие от клеток эксплантата костного мозга и клеток первого-второго пассажей. Таким образом, туморогенный потенциал был приобретен клетками именно в процессе культивирования и не явился результатом трансплантации, а также не был присущ клеткам костного мозга доноров.

Проверка туморогенности ММСК, выделенных из костного мозга другой линии мышей CBalb/cD, показала аналогичные результаты, то есть приобретение хромосомный аномалий и озлокачествление нельзя приписать к свойствам ММСК одной конкретной линии экспериментальных животных. В то же время, попытка повторить данный эксперимент на ММСК, выделенных из костного мозга беспородных крыс, а также на ММСК человека, напротив, продемонстрировала, что ММСК крысы и человека сохраняют стабильность кариотипа и иммунофенотипа при длительном культивировании, а также не приводят к формированию опухолей после трансплантации животным с индуцированным иммунодефицитом. Тем не менее, в культурах ММСК крыс все же обнаруживалось некоторое количество тетраплоид-ных клеток, что никак не отражалось на их свойствах.

В 2007 г. сразу в двух независимых лабораториях были подтверждены описанные результаты. Исследовательские группы под руководством S. Aguilar и J. Tolar показали аналогичное формирование сарком в легких и костях конечностей у мышей с функциональной иммунной системой, получавших внутривенные инфузии сингенных ММСК, перед трансплантацией культивированных in vitro [12,13]. Туморогенность ММСК приобретали на ранних пассажах, однако в данных работах было продемонстрировано, что накопление клетками хромосомных аберраций при культивировании все же зависит от линии мышей, из чьего костного мозга были изолированы ММСК. Так, например, из 13 культур ММСК, полученных от мышей линии В16/129, ни в одной не происходило накопления генетических аномалий и ни одна не приобрела способности давать начало злокачественным новообразованиям. Культуры ММСК, полученные от других линий, могли накапливать множественные хромосомные аберрации, но при этом не приобретали туморогенности [13]. Тумороген-ностью обладали только те культуры ММСК, в которых наблюдалась активность фермента теломеразы, отвечающего за поддержание длины теломер хромосом. Следует отметить, что в обеих работах в качестве контроля были использованы ММСК человека, которые, как было показано, ни в одном из случаев трансплантации не давали начала злокачественным новообразованиям, а также сохраняли при культивировании стабильный кариотип.

Говоря о трансформации ММСК животных, нельзя не упомянуть исследование, проведенное под руководством Н. Li в 2007 г. Авторы этой работы предположили, что в процессе старения ММСК становятся основным типом клеток, в котором происходит накопление хромосомных аберраций, приводящих в конечном итоге к развитию в организме мышей опухолей мезенхимального происхождения [14]. Свое предположение исследователи основывали на том, что некоторые культуры ММСК мыши, не претерпевающие злокачественной трансформации на ранних пассажах, могут озлокачеств-ляться при длительном культивировании в течение более чем десяти пассажей [15]. Согласно гипотезе Н. Li и его коллег, при старении в костном мозге животного может происходить аналогичный процесс, в результате которого ММСК костного мозга становятся источником опухолей. В своей работе ученые показали, что ММСК мыши, прошедшие большое количество удвоений в культуре, при системной инъекции приводили к развитию у животных множественных фибросарком в ткани печени, селезенки, семенников, брыжейке кишечника и в костной ткани. Сходными свойствами обладали ММСК, выделенные из костного мозга старых животных, уже на ранних пассажах, причем у некоторых животных при старении фибросаркомы развивались спонтанно, т.е. без экспериментального вмешательства. Было показано, что источником этих спонтанно развивавшихся фибросарком также были костномозговые стромальные клетки, которые при выделении и системной трансплантации реципиентам вновь давали начало злокачественным новообразованиям, подпадая, таким образом, под определение «раковых стволовых клеток» («cancer stem cells») [16]. Li Н. и его коллеги работали на мышах линии C57BL/6J, для чьих ММСК не было ранее продемонстрировано склонности к злокачественной трансформации, по крайней мере, на ранних пассажах.

При старении в клетках происходили многочисленные нарушения продукции ростовых факторов (в частности, Fgf1), факторов, ответственных за реорганизацию внеклеточного матрикса, за миграцию и, что особенно важно, происходило подавление экспрессии генов-супрессоров опухолевого роста р21, р53 и itga5, а также реактивация факторов, экспрессирующихся в эмбриональных стволовых клетках (Klf4, 0ct4, Sox2 и c-myc), а также в клетках агрессивных злокачественных опухолей [17]. Таким образом, изменения, происходившие при старении с ММСК мыши, были аналогичны изменениям, обнаруживаемым в клетках злокачественных опухолей человека [18].

Изменения свойств ММСК человека при культивировании in vitro и последствия трансплантаций таких клеток в организм

Данные относительно ММСК человека противоречивы. В 2007 г. было проведено весьма доказательное исследование, показавшее, что ММСК человека, выделенные из костного мозга здоровых доноров, не склонны к накоплению хромосомных аберраций при длительном (до 25 пассажей) культивировании, сохраняют стабильный кариотип in vitro и по достижении «точки кризиса» или «лимита Хейфлика» апоптотически гибнут [6,7]. Авторы данной работы изучили 10 культур ММСК, и ни в одной из них в стандартных условиях культивирования не происходило нарушений экспрессии поверхностных маркеров, изменений кариотипа, реактивации протоонкогенов и активации теломеразы. Тем не менее, исследователи особенно отметили, что клетки, полученные от разных доноров, имеют существенно различные характеристики, а именно — на разных пассажах достигают «точки кризиса» (от 3-го до 25-го) и обладают различной пролиферативной активностью.

В то же время, ранее, в 2005 г., исследовательской группой под руководством D. Rubio для ММСК, выделенных из жировой ткани человека, было показано, что, после прохождения клетками около 50 пассажей in vitro, в них может происходить накопление геномных нарушений и, как следствие, злокачественная трансформация [19]. Способность таких клеток к туморогенезу авторы проверяли на мышах с индуцированным облучением иммунодефицитом (Balb/c-SCID). Туморогенные ММСК (тММСК), прошедшие стадию кризиса, характеризовались потерей свойства контактного ингибирования в культуре in vitro, отсутствием экспрессии основных поверхностных маркеров МСК — CD90 и CD105, имели измененное строение веретена деления и нарушенную морфологию. Большинство из них несло трисомии, полиплоидии и другие числовые и структурные аберрации в хромосомном наборе. Системная трансплантация таких клеток мышам приводила к формированию множественных опухолей у всех (п = 38) экспериментальных животных. В клетках опухолей обнаруживалась реактивация протоонкогена с-тус и высокая экспрессия анги-огенного фактора VEGF. Авторы данной работы также проанализировали 10 культур ММСК от разных доноров, показав, что после прохождения более чем 50 пассажей и обхода «точки кризиса» пролиферация и накопление геномных нарушений происходит в 50% культур. Аналогичные результаты были получены в экспериментах с ММСК, выделенных из жировой ткани мышей линий C57BL/6 и CD1.

Работа D. Rubio и коллег стала первым описанием спонтанной трансформации не только ММСК, но и вообще клеток человека в культуре. В том же году полученные ими результаты были воспроизведены в независимой лаборатории на ММСК, полученных из костного мозга человека, с тем лишь замечанием, что в качестве еще одного прогностического фактора трансформации научная группа под руководством Y. Wang предложила экспрессию клетками поверхностного маркера эндотелиальных клеток-предшественниц CD133 [20]. Также Y. Wang и коллеги отметили, что трансформация происходит лишь в 1 из 40 культур МСК, а не в 50% случаев — по-видимому, это в большой степени зависит от генотипа доноров ММСК.

В 2008 г. группа D. Rubio подтвердила свои результаты, проведя исчерпывающий анализ генетических изменений, происходящих с ММСК при длительном культивировании, с помощью ДНК-микрочипов [21]. Исследователи предположили, что, поскольку озлока-чествление нормальной клетки — сложный многоступенчатый процесс [22], то должен существовать общий механизм, приводящий к трансформации ММСК в культуре. Анализ изменения экспрессии генома ММСК после вступления в фазу клеточного старения, до и после прохождения точки кризиса, действительно выявил определенные закономерности, общие для всех трансформированных культур, и позволил сформулировать последовательность ключевых молекулярных событий, приводящих к трансформации ММСК.

Согласно концепции D. Rubio, трансформация ММСК проходит в два последовательных этапа:

1. На первом этапе происходит активация протоонкогена с-тус и подавление активности гена-супрессора опухолевого роста р16, благодаря чему после прохождения стадии кризиса клетки продолжают активно пролиферировать. При этом также происходит экспрессия гена теломеразы tert и ее активация в клетке, делеция локуса Ink4a/Arf и активация протоонкогена Rb. Недавно этой же группой исследователей на ММСК мыши было показано, что для запуска злокачественной трансформации клеток достаточно одновременного ингибирования двух генов-супрессоров опухолевого роста, р21 и р53 [23], но насколько эти данные соотносимы с ММСК человека, на данный момент не выяснено.

2. На втором этапе трансформации в клетке происходят нарушения экспрессии генов, ассоциированных с митохондриальным метаболизмом, генов, чьи продукты отвечают за репарацию ДНК, а также регуляторов клеточного цикла.

В 2009 г. в научной литературе появилось последнее сообщение о злокачественной трансформации ММСК человека, изолированных из костного мозга [24]. Группа исследователей из Университета Бергена (Норвегия) продемонстрировала, что при длительном культивировании (более 100 пассажей) 45,8% культур ММСК (в работе — 11 из 24) претерпевают злокачественную трансформацию. При этом в клетках происходят события, аналогичные описанным ранее [19,20], а также обнаруживается потеря дифференцировочного потенциала — трансформированные ММСК при специфической индукции были способны вступать лишь в ранние стадии остеогенной дифференцировки, и не отвечали на адипогенные и хондрогенные стимулы. Авторы данной работы также особенно отмечают агрессивность и активное метастазирование образовывавшихся из трансплантированных ММСК сарком. Быстрый рост опухолей G.V. Rosland и коллеги, как и другие исследователи, склонны связывать с повышенной продукцией недифференцированным мезенхимными клетками сарком эндотелиального фактора роста сосудов VEGF, что характерно и для нормальных ММСК [25].

Заключение

Суммируя результаты немногочисленных исследований в области злокачественной трансформации ММСК в культуре, можно назвать ряд неотъемлемых признаков, последовательно приобретаемых клетками как экспериментальных животных, так и человека при озлокачествлении:

1. Изменение внешнего вида клеток, потеря ими характерной фибробластоподобной формы;

2. Потеря контактного ингибирования;

3. Ускорение пролиферации (период удвоения популяции — около 12ч);

4. Изменение строения веретена деления;

5. Накопление числовых и структурных хромосомных аберраций;

6. Реактивация гена теломеразы tert и ряда протоонкогенов, чья экспрессия характерна для эмбриональных стволовых клеток, в частности, с-тус и Rb; подавление генов-супрессоров опухолевого роста Cpi 6, р21, р53);

7. Многочисленные нарушения экспрессии генов, чьи продукты ответственны за ключевые процессы в клетке: пролиферацию, контроль клеточного цикла, метаболизм (так называемых housekeeping genes);

8. Приобретение туморогенных характеристик, образование сарком и фибросарком при трансплантации экспериментальным животным с индуцированным иммунодефицитом .

В целом, работы в данной области можно разделить на исследования, где описаны спонтанные изменения генетического материала клеток на ранних пассажах, и на исследования, касающиеся длительного культивирования ММСК и нарушений, возникающих в клетках в связи с процессами старения и обхода «точки кризиса». Следует отметить, что, по утверждениям большинства авторов, к трансформации в культуре склонны главным образом ММСК мыши, и только для них на сегодняшний день продемонстрирован феномен злокачественной трансформации на ранних пассажах. Мы предполагаем, что это связано с инбредностью линий. Известно, что в генетическом материале инбредных мышей накапливаются так называемые «молчащие» мутации, а также для них характерен феномен дрифта генов [26]. Этим можно объяснить и различную склонность к трансформации культур ММСК, полученных от разных линий мышей, хотя к настоящему времени не было проведено специальных исследований, авторы которых ставили бы перед собой задачу оценить зависимость вероятности злокачественной трансформации ММСК либо других типов клеток от степени инбредности линии экспериментальных животных.

Несмотря на то, что авторы обсуждавшихся работ показали, что в первичных культурах ММСК животных не обнаруживается структурных и числовых нарушений хромосомного набора, нельзя утверждать, что клетки начинают трансформироваться непосредственно в культуре. В 2006 г. в лаборатории профессора 3. Файнберга (A. Feinberg) было доказано, что задолго до появления единичных мутаций и перестроек генома происходят нарушения эпигенетических профилей ДНК клеток [27]. В своей работе профессор Файнберг особенно отметил, что клетки, несущие эпигенетические нарушения (главным образом, ошибки в метилировании ДНК), имеют нормальную морфологию и нормальный кариотип, и лишь при детальном исследовании профиля эпигенетических модификаций в них можно выявить признаки скорой трансформации. По-видимому, отдельные подобные клетки могут находиться в костном мозге и, попав в благоприятные условия культуры in vitro, эти клетки начинают активно пролиферировать, благодаря чему происходит ускоренная перестройка их генома и быстрое накопление хромосомных аберраций, приводящее к изменениям морфологии клеток и их иммунофенотипа. Теоретически, подобные ММСК, пребывающие в стадии «пре-трансформации», могут обнаруживаться и в костном мозге человека, однако на сегодняшний день к такому заключению нет экспериментальных предпосылок, описанных в научной литературе. Таким образом, применительно к мыши можно сделать заключение о том, что мезенхимальные стромальные клетки являются источником спонтанно развивающихся сарком, но применительно к человеку такого заключения сделать нельзя.

Характеристики ММСК мыши и человека существенно разнятся, и МСК мыши нельзя в полной мере считать модельным объектом для изучения ММСК человека [28, 29]. Несомненно, склонность ММСК мышей инбредных линий к трансформации на ранних пассажах должна обратить особенное внимание на контроль свойств ММСК человека, предназначенных для клинического применения, однако ни в коей мере не указывает на опасность трансплантации ММСК, подвергшихся недолгой (по крайней мере, до 10 пассажей) экспансии в культуре. Следует ожидать, что ММСК, полученные от отдельных доноров, могут нести эпигенетические нарушения и находиться в «пре-трансфор-мированном» состоянии, в результате чего произойдет их злокачественная трансформация в культуре на ранних пассажах. Возможная регистрация подобных случаев для ММСК человека, учитывая значительное количество уже собранных экспериментальных и клинических данных, не должна быть расценена как указание на негативное воздействие на клетки процесса культивирования. Тем не менее, очевидно, что длительное культивирование, при котором клетки проходят огромное количество делений, может, в отсутствие физиологического микроокружения и функциональной иммунной системы, привести к нежелательным последствиям.

Подняться вверх сайта