Поиск Кабинет

Создание рекомбинантных аденовирусов, кодирующих гены нейральных молекул клеточной адгезии ncam1, ncam2 и l1cam

Гены & Клетки: Том VIII, №3, 2013 год, стр: 142-146

 

Авторы

Федотова В.Ю., Черенкова Е.Е., Исламов Р.Р., Ризванов А.А.

ДЛЯ ТОГО ЧТОБЫ СКАЧАТЬ СТАТЬЮ В ФОРМАТЕ PDF ВАМ НЕОБХОДИМО АВТОРИЗОВАТЬСЯ, ЛИБО ЗАРЕГИСТРИРОВАТЬСЯ

Для проведения успешной генной терапии необходимо соблюдение основных условий, таких как адресная доставка терапевтического гена в орган-мишень и его эффективная экспрессия. На сегодняшний день, адресность доставки терапевтических генов является одной из важных проблем генной терапии. Доставка рекомбинантных генов на клеточных носителях, экспрессирующих тканеспецифические молекулы клеточной адгезии, позволяет нас приблизить к поставленной цели.

С помощью технологии клонирования Gateway (Invitrogen) нами были получены рекомбинантные экспрессионные конструкции pAd-NCAM1, pAd-NCAM2 и pAd-L1CAM, кодирующие гены молекул адгезии клеток нервной ткани. Экспрессия рекомбинантных генов была подтвеждена с помощью иммунофлуоресцентного анализа. На основе данных кострукций были созданы и оттитрованы рекомбинантные аденовирусы 5 серотипа. Полученные вирусные векторы, кодирующие нейрональные молекулы клеточной адгезии, в дальнейшем могут быть использованы для модификации клеток, несущих терапевтические гены, с целью повышения эффективности доставки генно-клеточного препарата в орган-мишень.

От нейродегенеративных заболеваний страдает более 36 млн. человек по всему миру. Только количество пациентов с болезнью Альцгеймера составляет около 26 млн человек и предполагается, что эта цифра увеличится более чем в 4 раза к 2050 году. Подавляющее большинство нейродегенеративных заболеваний развиваются у пациентов пожилого возраста. Так, например, у пациентов в возрасте 70–75 лет распространенность нейродегенеративных заболеваний составляет около 5%, а в возрасте старше 80 лет – достигает 15%. По данным Всемирной организации здравоохранения средняя продолжительность жизни за последние 60 лет значительно увеличилась, что в свою очередь увеличивает частоту встречаемости нейродегенеративных заболеваний. Однако самой большой проблемой в этой сфере является отсутствие эффективного лечения, так как существующие методы являются лишь симптоматическими и не способны устранить самой проблемы. Одним из перспективных направлений считается генная терапия. Важным условием для проведения успешной генной терапии является адресная доставка рекомбинантного гена в клетки-мишени и обеспечение его эффективной экспрессии[1]. В то же время на сегодняшний день адресная доставка генов является серьезной проблемой. Для генной терапии применяют векторы на основе вирусов, в частности аденовирусов, обеспечивающие эффективную трансдукцию и относительно длительную экспрессию рекомбинантных генов в клетках различных тканей и органов человека. Аденовирус человека – безоболочечный вирус с икосаэдрическим вирионом, содержащий линейную двухцепочечную молекулу ДНК размером от 26 до 48 т.п.н.[2]. Векторы на их основе широко применяются в генной терапии[3, 4]. Всего насчитывается около 50 серотипов аденовирусов, однако для генной терапии наиболее часто применяются вирусы 2 и 5 серотипов. Важным является тот факт, что аденовирус может инфицировать широкий спектр клеточных типов статической, растущей, или обновля- ющейся популяции и обеспечивать высокий уровень экспрессии трансгена. Кроме того, аденовирусные векторы не встраиваются в геном клетки-хозяина и тем самым не вызывают инсерционного мутагенеза и онкологической трансформации клетки[5]. Титр аденовируса может достигать 1012 инфекционных частиц на миллилитр культуральной среды[3]. Нейральные молекулы клеточной адгезии NCAM (neural cell adhesion molecule) экспрессируются на поверхности нервных клеток, клеток нейроглии, скелетных мышечных волокон, НК-клеток. Межклеточные взаимодействия NCAM в нейроонтогенезе и посттравматической регенерации обеспечивают выживание и миграцию нейронов, направленный рост нейритов, синаптогенез. Через цитозольный домен NCAM участвует в разных внутриклеточных сигнальных каскадах[6–9].

NCAM1 – гомофильно связывающийся гликопротеин, экспрессируется на поверхности нервных клеток, клеток нейроглии, скелетных мышечных волокон. Гомофильное связывание происходит между NCAM молекулами соседних клеток (trans-) и молекулами NCAM одной клетки (cis-). Механизм гомофильного связывания NCAM в trans- и cis- еще недостаточно исследован. NCAM1 играет решающую роль в развитии нейронов, синаптической пластичности и регенерации[10].

Нейральные молекулы клеточной адгезии NCAM2 и L1CAM могут обеспечивать как гомо-, так и гетерофильные взаимодействия. NCAM2 экспрессируется в различных тканях[11], но преимущественно в головном мозге, а также на поверхности НК-клеток[12], стимулирует рост нейритов и фасцикуляцию, играет важную роль в организации аксонов и дендритов в обонятельной системе[13].

L1CAM – это гликопротеин, опосредующий клеточную адгезию как путем гомофильного взаимодействия с L1CAM молекулами, экспрессируемыми соседними клетками, так и гетерофильного связывания. Лигандами могут выступать интегрины, CD24, нейроканы, нейропилин-1 и другие представители семейства молекул нейральной клеточной адгезии. Сайты связывания для большинства лигандов L1CAM определены. L1 экспрессируется на нейронах и нейролеммоцитах периферической нервной системы, не экспрессируется на незрелых нейронах. В зрелых нейронах продуцируется преимущественно на нейритах при образовании нервных волокон. В развивающемся мозге его находят в области клеточных контактов, на миелинизированных нейронах отсутствует[14, 15].

Целью нашей работы стало создание и определение титра рекомбинантных аденовирусов, экспрессирующих нейральные молекулы клеточной адгезии NCAM1, NCAM2 и L1CAM.

Материал и методы

В работе использовались плазмидные векторы: pCMV-SPORT6-NCAM1, pBluescriptR-NCAM2 (Harvard Medical School) и полученная нами ранее pcDNA-hL1CAM[16], несущие кДНК генов ncam1, ncam2 и l1cam, соответственно. Для последующих этапов клонирования, с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) кДНК вышеуказанных генов была амплифицирована с добавлением фланкирующих сайтов attB. Присоединение сайтов проводили в два этапа с помощью высокоточной полимеразы Phusion High fidelity DNA Polimerase (Finnzymes), способной синтезировать длинные последовательности генов с высокой точностью и скоростью. На первом этапе для фланкирования последовательностей использовали геноспецифичные праймеры (табл. 1, комбинации 1–3), на втором – адаптерные (табл. 1, комбинация 4) для увеличения длины attB сайтов. После окончания второго раунда ПЦР амплификации реакционную смесь очищали от компонентов реакции с помощью набора EZ-10 Spin Column PCR products purification kit (BIO BASIC), согласно инструкции производителя.

Реакцию рекомбинации между очищенным ПЦРпродуктом и вектором-донором pDONR221 (Invitrogen) проводили по технологии BP-рекомбинации Gateway (Invitrogen), по стандартному протоколу, предложенному производителем. На следующий день полученной рекомбинационной смесью трансформировали клетки E.coli, штамм TOP10, после чего клетки рассевали на агаризованную селективную среду, а выросшие колонии анализировали методом ПЦР-скрининга с использованием геноспецифичных праймеров (табл. 1, комбинации 5–7). Позитивные клоны использовали для выделения плазмидной ДНК, необходимой для следующего этапа клонирования. Выделение производили с помощью набора GeneJET Miniprep Plasmid Kit (Fermentas), по методике производителя.

Полученные плазмидные конструкции pDONR221NCAM1, pDONR221-NCAM2, pDONR221-L1CAM использовали для следующего этапа LR-рекомбинации по технологии Gateway (Invitrogen) и создания экспрессионных конструкций на основе pAd⁄CMV⁄V5-DEST (Invitrogen) (далее pAd). Реакции проводили согласно инструкции производителя. После чего по описанной выше методике трансформировали клетки E.coli, штамм TOP10, и анализировали выросшие колонии методом ПЦР с использованием геноспецифичных праймеров (табл. 1, комбинации 5–7). Позитивные клоны также использовали для выделения плазмидной ДНК с помощью набора GeneJET Miniprep Plasmid Kit (Fermentas).

Все полученные конструкции были проанализированы секвенированием, результаты обрабатывали с помощью программы SeqScanner (Applied Biosystems).

Для подтверждения экспрессии генов нейральных молекул клеточной адгезии использовали клеточную линию HEK293A (Invitrogen). В данной клеточной линии экспрессируются гены, кодируемые Е1 (E1a и E1b) регионом аденовируса, необходимые для его репликации[17, 18]. Клетки данной линии трансфицировали экспрессионными плазмидными векторами pAd-NCAM1, pAd-NCAM2, pAd-L1CAM по стандартной методике с помощью трансфицирующего агента TurboFect Transfection Reagent (Fermentas). Иммунофлюоресцентный анализ проводили 1) с использованием моноклональных антител мыши к NCAM1 (Сорбент, 2423000), конъюгированных с фикоэритрином (РЕ); 2) первичных поликлональных антител кролика к NCAM2 (Santa Cruse, 134876) и вторичных антител осла к иммуноглобулину G кролика, конъюгированных с флуоресцентной меткой Alexa 488 (Invitrogen, A21206); 3) первичных поликлональных антител кролика к L1CAM (Santa Cruse, 15326) и вторичных антител осла к иммуноглобулину G кролика, конъюгированных с флуоресцентной меткой Alexa 555 (Invitrogen, А31572). Результаты анализировали на инвертированном флуоресцентном микроскопе AxioObserver Z1 (Carl Zeiss).

После подтверждения экспрессии целевых генов (ncam1, ncam2, l1cam) полученные аденовирусные плазмидные векторы pAd-NCAM1, pAd-NCAM2, pAd-L1CAM подвергли ферментативному гидролизу рестриктазой PacI (Fermentas) для освобождения концевых инвертированных повторов, необходимых для сборки и репликации вируса. Линейными конструкциями, очищенными с применением набора EZ-10 Spin Column PCR products purification kit (BIO BASIC), трансфицировали клетки линии НЕК293А (Invitrogen) c помощью TurboFect Transfection Reagent (Fermentas). Через 10 сут. после трансфекции культуральную среду вместе с клетками подвергали криолизу с последующим центрифугированием для удаления остатков клеток. Таким образом, были получены первичные вирусные стоки Ad5-NCAM1, Ad5-NCAM2 и Ad5-L1CAM. Затем для получения более высоких вирусных титров вирусный сток амплифицировали, повторно заражая клетки линии НЕК293А первичными стоками.

Для обеспечения в последующем воспроизводимых и достоверных результатов определяли титр полученного рекомбинантного аденовируса. Для этого приготовили 10-кратные серийные разведения вируса в диапазоне от 10-4–10-8 и инфицировали клетки линии НЕК293А. Затем клетки покрывали 0,4% агарозой, а на 8 сут. подсчитывали количество вирусных бляшек и определяли титр БОЕ/мл (бляшкообразующие единицы/мл) по следующей формуле: БОЕ/мл = количество бляшек / объем вирусного инокулята (мл) / степень разведения.

Результаты и обсуждение

На сегодняшний день при терапии больных с нейродегенеративными заболеваниями, а также с ишемическими и травматическими повреждениями мозга, основной задачей является стимулирование регенерации нервных клеток. Поддержание жизни нейронов и восстановление утраченных межклеточных связей может значительно повысить продолжительность и уровень жизни пациентов с нейротравмами или нейродегенеративными заболеваниями, затрагивающими разные типы нервных клеток и разные структуры ЦНС[19].

Многочисленные опыты по трансплантации клеток пуповинной крови животным с экспериментальными ишемическими и дегенеративными поражениями мозга, подтвердили эффективность клеточной терапии[20]. Однако для повышения эффективности терапии с применением клеток пуповинной крови (поддержание выживаемости клеток реципиента, стимулирование клеточной пролиферации, восстановления межклеточных контактов и образования утраченных тканевых структур), активно исследуются возможности их генетической модификации с помощью плазмидных и вирусных векторов, экспрессирующих факторы роста и молекулы адгезии[21].

Генетическая модификация мононуклеарных клеток пуповинной крови с помощью векторов, экспрессирующих, помимо терапевтического гена, и ген молекулы адгезии нервных клеток, повышает их способность к хоумингу и выживаемости в нервной ткани реципиента, а, следовательно, увеличивает продолжительность действия терапевтического гена на нервные клетки[22, 23].

В предыдущих экспериментах было показано, что при трансфекции плазмидами, содержащими ген l1cam, эмбриональных стволовых клеток мыши происходило не только встраивание этой молекулы в клеточную мембрану клеток, но и секреция её растворимой формы[24]. Затем после трансплантации в травмированный спинной мозг данные клетки формировали отростки и оставались жизнеспособными в течение месяца, в то время как нетрансфицированные клетки выживали лишь в течение 7 сут. В опытах по введению трансгенным мышам с моделью бокового амиотрофического склероза мононуклеарных клеток пуповинной крови человека, экспрессирующих рекомбинантный L1CAM, генетически модифицированные клетки обнаруживались в спинном мозге через 3 мес. после введения. Предположительно, выживаемость пуповинных клеток была обусловлена специфичным взаимодействием рекомбинантного белка L1CAM на мембране генетически модифицированных клеток с нервной тканью реципиента[19].

Таким образом, экспрессия генов ncam1, ncam2, l1cam с последующим встраиванием белков в клеточную мембрану мононуклеарных клеток крови пуповины может иметь важное стимулирующее влияние на нейрорегенерацию за счёт образования гомофильных и гетерофильных взаимодействий с клетками ЦНС, что в свою очередь усиливает адресную миграцию клеток, повышает их выживаемость и продолжительность экспрессии терапевтического гена.

В настоящем исследовании в результате двух раундов амплификации были получены ПЦР-продукты генов ncam1, ncam2 и l1cam ожидаемого размера, фланкированные attB-сайтами (рис. 1), которые затем использовались для получения рекомбинантных вирусных векторов путем BP-рекомбинации с вектором-донором pDONR221 (Invitrogen). Рекомбинационной смесью трансформировали клетки E.coli, штамм TOP10. Позитивные клоны, несущие рекомбинантные плазмиды с интересующими нас генами, определялись с помощью ПЦР-скрининга. После этого часть клонов использовали для выделения плазмидной ДНК рекомбинантных векторов pDONR221-NCAM1, pDONR221-NCAM2, pDONR221NCAML. На следующем этапе после проведения LR-рекомбинации с последующей трансформацией, также проводили ПЦР-скрининг, а позитивные клоны были использованы для выделения плазмидной ДНК экспрессионных конструкций pAd-NCAM1, pAdNCAM2, pAd-L1CAM. На всех этапах ПЦР-скрининга отбирались только те клоны, размер вставки в которых соответствовал ожидаемому.

Далее для подтверждения экспрессии рекомбинантных белков был проведен иммунофлюоресцентный анализ клеток линии НЕК293А, модифицированных полученными экспрессионными конструкциями pAd-NCAM1, pAd-NCAM2, pAd-L1CAM. Показана положительная реакция со специфичными к нейральным молекулам антителами (рис. 2). После подтверждения экспрессии рекомбинантного белка полученные конструкции были линеаризованы и использованы для продукции рекомбинантных аденовирусов 5 серотипа.

Были получены аденовирусные векторы, экспрессирующие нейральные молекулы клеточной адгезии. Титр полученных вирусов составил: Ad5-NCAM1 (2,64×108 БОЕ/мл), Ad5-NCAM2 (1,97×109 БОЕ/мл), Ad5-L1CAM (1,5×108 БОЕ/мл).

Согласно данным, полученным нами ранее, модификация мононуклеарной фракции пуповинной крови человека плазмидными конструкциями, кодирующими ген молекулы L1CAM, повышала хоуминг, а также пролиферацию и выживаемость модифицированных клеток[25, 26].

Однако по сравнению с плазмидными векторами, при применении вирусных экспрессионных векторов увеличивается продолжительность и уровень экспрессии клонированных генов, а, следовательно, и продолжительность действия терапевтических молекул на клетки-мишени. Кроме того вирусная трансдукция более эффективна и не требуют какихлибо дополнительных травмирующих клетку физических или химических воздействий.

В заключение, полученные нами аденовирусные векторы, экспрессирующие нейральные молекулы клеточной адгезии NCAM1, NCAM2 и L1CAM, в дальнейшем будут использованы для генетической модификации мононуклеарных клеток пуповинной крови. Использование нейральных молекул клеточной адгезии предположительно должно повысить выживаемость и адресную доставку модифицированных клеток к месту нейродегенерации, и таким образом усилить эффект трансплантированных клеток, экспрессирующих терапевтический ген, на нейрорегенерацию.

Подняться вверх сайта