Поиск Кабинет

Создание рекомбинантных аденовирусов и лентивирусов, экспрессирующих ангиогенные и нейропротекторные факторы, с помощью технологии клонирования Gateway

Гены & Клетки: Том VII, №3, 2012 год, стр.: 164-168

 

Авторы

Черенкова Е.Е., Федотова В.Ю., Борисов М.А., Исламов Р.Р., Ризванов А.А.

ДЛЯ ТОГО ЧТОБЫ СКАЧАТЬ СТАТЬЮ В ФОРМАТЕ PDF ВАМ НЕОБХОДИМО АВТОРИЗОВАТЬСЯ, ЛИБО ЗАРЕГИСТРИРОВАТЬСЯ

Важной задачей генной и генно-клеточной терапии является поиск оптимального вектора – переносчика генетической информации. Вирусы представляют собой естественную биологическую систему переноса генов в эукариотические клетки. Одними из наиболее эффективных и доступных векторов для доставки рекомбинантных нуклеиновых кислот в клетки являются адено- и лентивирусы. В настоящем исследовании с помощью системы Gatewayклонирования нами были сконструированы аденовирусные и лентивирусные векторы, кодирующие ангиогенные и нейропротекторные факторы: изоформы сосудистого эндотелиального фактора роста vegf121, vegf165, vegf189; основной фактор роста фибробластов fgf2; глиальный нейротрофический фактор gdnf. Эффективность трансдукции клеток линии НЕК293А полученными генетическими конструкциями и экспрессия рекомбинантных белков подтверждены методом иммунофлуоресцентного анализа.

Большинство нейропротекторных стратегий, направленных на предотвращение гибели нейронов при нейродегенеративных заболеваниях, после нейротравм и ишемических инсультов недостаточно эффективны и не приводят к полному функциональному восстановлению больного. При этом ситуация осложняется недоступностью нейропротекторных лекарственных веществ в клинике [1].

К природным нейропротекторным агентам относят нейротрофические факторы (NGF, BDNF, CNTF, GDNF, NT-3/4), эффективно поддерживающие выживание нейронов в патологических условиях и стимулирующие нейрорегенерацию [2]. Особого внимания заслуживают и другие ростовые факторы. В многочисленных исследованиях установлено выраженное нейропротекторное действие IGF, FGF и VEGF при нейродегенеративных заболеваниях, травме спинного мозга, ишемии головного мозга [3–5]. Повышенный интерес к VEGF обусловлен как его ангиогенным, так и нейропротекторным действием [6–9].

Одной из ключевых задач разработки «инструментов» для генной терапии является создание экспрессионных генетических конструкций, обеспечивающих перенос рекомбинантных генов в целевые клетки in vitro и in vivo. Идеальная векторная система в генной терапии не требует инвазивных методов доставки, ограничена действием только на клетки-мишени, обеспечивает экспрессию известного количества трансгенных продуктов в течение определенного периода времени. Аденовирусы являются одними из наиболее часто применяемых векторов в генной терапии, уступая только ретровирусам [10]. Перспективными в разработке методов генной терапии также считаются векторы на основе лентивирусов. Лентивирусы, как и аденовирусы, способны инфицировать различные клетки. В то же время, за счет интеграции в геном клетки-хозяина они обеспечивают долговременную экспрессию и передачу трансгена дочерним клеткам при делении.

Недавно группой американских ученых на основе технологии Gateway-клонирования (Invitrogen, США) была создана коллекция клонов (hORFeome V8.1), кодирующих более 16 100 открытых рамок считывания генов человека [11]. Применение технологии Gateway-клонирования позволяет быстро и эффективно проводить субклонирование с сохранением ориентации открытой рамки считывания в различные экспрессионные векторы для дальнейших исследований по функциональному анализу экспрессии генов и белков. Cистема Gateway-клонирования основана на сайт-специфической рекомбинации бактериофага лямбда, которая происходит между специфическими последовательностями ДНК в пределах очень коротких участков гомологии, обычно 15–30 п.н. В связи с отсутствием этапа ПЦР амплификации, использование системы Gateway-клонирования сводит к минимуму риск возникновения мутаций во время генно-инженерных манипуляций, а применение сайтспецифической рекомбинации позволяет избежать применения многочисленных ферментативных реакций и стадий очистки промежуточных продуктов гидролиза ДНК, характерных для систем рестрикциилигации.

Целью нашего исследования стали разработка и создание рекомбинантных аденовирусов и лентивирусов, кодирующих гены ангиогенных и нейропротекторных факторов (vegf121, vegf165, vegf189, fgf2, gdnf) по технологии Gateway-клонирования (Invitrogen, США).

Материал и методы

Клонирование кДНК генов vegf121, vegf165, vegf189 и gdnf в плазмидный вектор pENTR-D/TOPO. Амплификация фрагментов кДНК генов vegf и gdnf проводилась на термоциклере С1000 Thermo Cycler (BioRad) с помощью высокоточной полимеразы Phusion High fidelity DNA Polymerase (FINNZYMES). Праймеры синтезированы компанией «Синтол» (Россия), нуклеотидные последовательности приведены в табл. 1. Очищенные продукты ПЦР-амплификации клонировали (с применением топо-изомеразы) в плазмидный вектор pENTR-D/TOPO (Invitrogen) с последующей трансформацией в компетентные клетки E. coli Top 10. ПЦР-скрининг колоний проводили с использованием вектор-специфичных праймеров (табл. 1). Получение целевых рекомбинантных плазмид подтверждали данными секвенирования и рестрикционного анализа.

Клонирование кДНК гена fgf2 в плазмидный вектор pDONR221 с помощью технологии Gatewayклонирования (Invitrogen, США). ПЦР-амплификацию фрагмента гена основного фактора роста фибробластов проводили в два этапа: первый этап служит для присоединения attB – сайтов с использованием геноспецифичных праймеров hFGF2 – attB1 и hFGF2 – attB2, нуклеотидные последовательности которых представлены в табл. 1. Второй этап ПЦРамплификации проводили с использованием адаптерных праймеров GW-attB1 и GW-attB2 (Литех, Россия), предназначенных для увеличения длины нуклеотидной последовательности att-сайтов. BP – рекомбинацию проводили по стандартному протоколу, предложенному компанией Invitrogen, с последующей трансформацией в компетентные клетки E. coli Top 10. ПЦР-скрининг колоний и подтверждение получения целевых рекомбинантных плазмид проводили, как описано выше.

Создание экспрессионных конструкций на основе аденовирусов и лентивирусов при помощи технологии Gateway-клонирования (Invitrogen, США). Для создания экспрессионных конструкций на основе аденовирусов и лентивирусов проводили LR-рекомбинацию кДНК генов из плазмид-доноров pENTR-VEGF121, pENTR- VEGF165, pENTR- VEGF189, pENTR-Gdnf и pDONR-FGF2 в плазмидные векторы pAd/CMV/V5Dest (Invitrogen) (для создания аденовирусных конструкций) или pLX303 (AddGene № 25897) (для создания лентивирусных конструкций). Трансформация компетентных клеток E. coli, ПЦР-скрининг колоний и подтверждение получения целевых рекомбинантных плазмид проводили, как описано выше.

Генетическая модификация (трансфекция) клеток HEK293A рекомбинантными плазмидами. Клетки линии НЕК293А (Invitrogen, США) культивировали при 37°С во влажной атмосфере, содержащей 5% CO2, в среде Игла, модифицированной Дульбекко (DMEM), содержащей 10% сыворотку крови плодов коровы (FBS), 1% смеси антибиотиков пенициллина и стрептомицина и 2 мМ L-глутамина. Трансфекцию клеток линии НЕК293А с помощью полученных генетических конструкций (pAd-FGF2, pAd-GDNF, pAd-VEGF121, pAd-VEGF165, pAd-VEGF189; pLX-FGF2, pLX-VEGF121, pLX-VEGF121, pLX-VEGF165, pLX-VEGF189) проводили с помощью трансфекционного реагента TurboFect (Fermentas, Канада) согласно методике, рекомендованной производителем. Анализ экспрессии белков проводили через 48 ч после трансфекции с помощью иммунофлуоресцентного анализа.

Иммунофлуоресцентный анализ экспрессии рекомбинантных белков. Для фиксации трансфицированных клеток НЕК293А в лунки культурального планшета после удаления питательной среды добавляли охлажденный метанол, затем планшет инкубировали при -20°С в течение 10 мин. После инкубации клетки промывали трис-буферным раствором TBS (50 мM Трис, 150 мM NaCl, pH 7,6). Проницаемость клеточных мембран увеличивали с помощью 0,1% раствора тритона Х-100 (Helicon, Россия). Инкубацию с первичными антителами (табл. 2) проводили в TBS в течение 1 ч. Затем клетки промывали TBS и далее инкубировали со вторичными антителами (табл. 2) в течение 1 ч. Ядра клеток окрашивали флуоресцентным красителем DAPI (4’,6-diamidino-2-phenylindole; Invitrogen, США). Результаты анализировали с помощью флуоресцентного микроскопа AxyoObserver Z1 (Carl Zeiss, Германия).

Получение рекомбинантных аденовирусов. Для получения рекомбинантных аденовирусов Ad5-GDNF, Ad5-FGF2, а также Ad5-VEGF (изоформы 121, 165, 189) аденовирусный плазмидный вектор перевели из кольцевой в линейную форму с помощью рестрикции ферментом PacI. Полученными очищенными линейными плазмидами трансфицировали клетки линии HEK293A с помощью трансфекционного реагента TurboFect. После трансфекции каждые 2–3 сут. меняли среду на свежую пока не стали заметны области цитопатического эффекта. На 10 сут. после трансфекции суспензию клеток из лунки собирали в стерильную 2 мл пробирку. После сбора клеточной суспензии проводили несколько циклов замораживания/оттаивания с последующим центрифугированием для подготовки неочищенного вирусного лизата. Вирусный сток хранили при -80°С.

Получение рекомбинантных лентивирусов, экспрессирующих ангиогенные и нейропротекторные факторы. Для получения рекомбинантных лентивирусов проводили трансфекцию клеток HEK293T (АТСС, CRL-11268) при плотности монослоя в 70–80% кальциево-фосфатного методом по стандартному протоколу рекомбинантными плазмидами pLX303, psPAX2 (Addgene, США) и pCMV-VSV-G (Addgene, США). Эффективность трансфекции оценивали по количеству GFP-позитивных клеток методом флуоресцентной микроскопии. Клеточный лизат собирали через 2 сут. после трансфекции с последующим центрифугированием и фильтрацией супернатанта. Вирусный сток хранили при -80°С.

Результаты и обсуждение

Первоначально в результате ПЦР-амплификации и на последующих этапах клонирования с помощью технологии BP-рекомбинации и ТОРО-клонирования были получены векторы-доноры: pDONR-FGF2, а также pENTR-GDNF, pENTR-VEGF121, pENTR-VEGF165, pENTR-VEGF189. Экспрессионные аденовирусные плазмиды pAd-FGF2, pAd-GDNF, pAd-VEGF121, pAdVEGF165, pAd-VEGF189, а также лентивирусные плазмиды pLX303-FGF2, pLX303-GFNF, pLX303-VEGF121, pLX303-VEGF165, pLX303-VEGF189 были получены с использованием LR-рекомбинации (Invitrogen). Наличие целевых фрагментов подтверждено данными рестрикционного анализа и автоматического секвенирования.

Генетическую модификацию клеток HEK293A рекомбинантными плазмидами проводили с помощью трансфекционного реагента Turbofect. Эффективность экспрессии генов подтверждена иммунофлуоресцентным анализом. Показано, что клетки НЕК293А, модифицированные рекомбинантными плазмидами со вставками генов ангиогенных и нейропротекторных факторов, специфично реагируют с первичными антителами к основному фактору роста фибробластов, глиальному нейротрофическому фактору и сосудистому эндотелиальному фактору роста (рис. 1–2).

На первом этапе получения рекомбинантных аденовирусов кольцевую плазмиду pAd со вставкой интересующего гена перевели в линейную форму с помощью рестрикционного расщепления эндонуклеазой PacI. Расщепление вектора способствует взаимодействию левого и правого инвертированных повторов и удалению бактериальных последовательностей (участка начала репликации pUC и гена резистентности к ампициллину). Упаковка и репликация рекомбинантного аденовируса происходит в клетках линии HEK293A, содержащих Е1-участок, удаленный в рекомбинантных аденовирусных векторах. Таким образом, делеция Е1-области обеспечивает место для трансгенной вставки и блокирует репликацию вируса. На раннем этапе репликации вируса экспрессируются четыре несмежных области генома (с E1 по Е4) .Они служат, отчасти, в качестве ведущих регуляторов транскрипции, начиная с процесса экспрессии вирусного гена и заканчивая репликацией генома. После начала репликации ДНК, поздний промотор ведет большую часть вирусной транскрипции.

Через 72 ч после трансфекции очищенными рекомбинантными плазмидами были зафиксированы первые признаки цитопатического эффекта, характеризующегося характерными изменением морфологии клеток, принимающих округлую форму. Через 10 сут. после трансфекции суспензию клеток собирали и подвергали нескольким циклам замораживанияоттаивания. Полученные рекомбинантные аденовирусы хранили при -80°С для дальнейших исследований в экспериментах in vivo.

Для эффективной продукции лентивирусов в клетках HEK293T была проведена трансфекция кальциево-фосфатным методом рекомбинантными плазмидами pLX303 со вставками генов ангиогенных и нейропротекторных факторов, а также упаковочными плазмидами psPAX2 и pCMV-VSV-G. Введенная в пакующие клетки в составе плазмиды pCMV-VSV-G (packaging vector plasmid) пакующая кассета под контролем промотора цитомегаловируса экспрессирует гены, необходимые для формирования инфицирующей вирусной частицы. Но из кассеты исключен ген env, кодирующий белки-предшественники оболочки, определяющие его способность выходить за пределы клетки. Современная генерация пакующих систем включает обычно две плазмиды: одна кодирует Gagи Gag-pol-белки (Gag формируют сердцевину вируса, Pol – его ферментную систему соответственно); вторая – Rev-белок (избирательно активирует синтез структурных белков вируса и обеспечивает экспорт из ядра длинных молекул вирусной РНК). Векторная плазмида (transfer vector plasmids) содержит кассету, экспрессирующую мРНК, включающую все cisактивирующиеся элементы и последовательности, кодирующие пакующий сигнал. Такие плазмиды содержат трансген-экспрессирующую кассету с геном, предназначенным для экспрессии в новом хозяине и находящимся под контролем внутреннего промотора, обычно позиционированного между 3'-Tat/Rev SA-сайтом и 3'-LTR. Для формирования оболочки векторной вирусной частицы в систему включен оболочечный вектор psPAX2 (envelope vector). Он содержит кассету, определяющую синтез гликопротеинов оболочки вируса. Однако, так как вектор не содержит структурных вирусных генов gag, pol и env, образования полноценных вирусных частиц не происходит.

В качестве положительного контроля была также проведена трасфекция плазмидой pWPT-GFP (Addgene) в комплексе с упаковочными плазмидами. Эффективность экспрессии зеленого флуоресцентного белка подтверждена с помощью флуоресцентной микроскопии через 24 ч. после трансфекции.

Таким образом, с использованием системы клонирования Gateway были получены рекомбинантные аденовирусы и лентивирусы, экспрессирующие разные изоформы сосудистого эндотелиального фактора роста (vegf121, vegf165, vegf189), основной фактор роста фибробластов fgf2 и глиальный нейротрофический фактор gdnf. Подтверждённая эффективность трансдукции клеток адено- и лентивирусными векторами и экспрессия терапевтических генов позволяют начать доклинические испытания полученных генетических конструкций в генной и генноклеточной терапии нейродегенеративных и ишемических заболеваний человека.

Подняться вверх сайта