Поиск Кабинет

Создание и оценка биологического действия ген-активированного остеопластического материала, несущего ген VEGF человека

Гены & Клетки: Том VIII, №3, 2013 год, стр: 78-85

 

Авторы

Деев Р.В., Дробышев А.Ю., Бозо И.Я., Галецкий Д.В., Королев В.О., Еремин И.И., Филоненко Е.С., Киселев С.Л., Исаев А.А.

ДЛЯ ТОГО ЧТОБЫ СКАЧАТЬ СТАТЬЮ В ФОРМАТЕ PDF ВАМ НЕОБХОДИМО АВТОРИЗОВАТЬСЯ, ЛИБО ЗАРЕГИСТРИРОВАТЬСЯ

Разработка новых эффективных остеопластических ма териалов высоко востребована в практике травматологии и ортопедии, хирургической стоматологии и челюстно-ли цевой хирургии. Целью исследования являлось создание ген-активированного костного графта (ГАКГ) из носителя на основе коллагена и гидроксиапатита и плазмидной конструк цией, имеющей в своем составе генVEGF-A165 человека, а также оценка его биологического действия in vitro и in vivo. Было установлено, что ко-инкубирование ГАКГ с культурой мультипотентных мезенхиальных стромальных клеток приво дит к повышению экспрессии ими белка VEGF. При импланта ции ГАКГ в дефекты теменных костей кроликов наблюдалась трансфекция клеток реципиентного ложа, что сопровожда лось более выраженным ангиогенезом, по сравнению с кон тролем. На сроках 15 и 30 сут. определялся больший объ ем костного регенерата при использовании ГАКГ. При этом, источником репаративного остеогенеза являлись не только теменные кости, но и фрагменты ГАКГ (даже из центральной части дефекта), большинство из которых были окружены новообразованной костной тканью. В контроле остеоиндук тивного действия материала не наблюдалось. Таким образом, ГАКГ с плазмидной конструкцией, име ющей в своем составе ген VEGF-A165 человека, обладает ангиогенной активностью, обеспечивающей остеоиндуктив ное действие.

Одной из наиболее актуальных проблем травма тологии и ортопедии, хирургической стоматологии и челюстно-лицевой хирургии является эффективное лечение пациентов, нуждающихся в реконструктив ных операциях[1–3]. Воспалительные заболевания, травмы, врожденные аномалии развития и дефор мации костей, онкологическая патология, а также первые этапы их хирургического лечения неизбежно приводят к формированию костных дефектов или атрофии костной ткани. В зависимости от объемов утраченной костной ткани, степени морфофункциональных нарушений, специфики соматического статуса пациентов используются различные методы реконструкции костей, которые, за исключением дистракционного остеогенеза и протезирования, базируются на применении остеопластических материалов. При этом, если степень развития современных хирургических технологий очень высока и теоретически позволяет добиться успешных результатов в большинстве клинических ситуаций, то лимитирующим фактором, ограничивающим практическую эффективность их применения (результат лечения), являются именно остеопластические материалы[4].

«Золотым стандартом» костнозамещающих ма териалов является аутогенная костная ткань, приме нимая практически в любой клинической ситуации. Так, для восполнения костных дефектов малого и среднего размеров эффективно использование сво бодных костных фрагментов (в перемолотом виде, в виде блоков и т.д.), для пластики больших (протя женных и (или) объемных) – костных аутотрансплан татов на «сосудистой ножке»[3, 5]. В ряде случаев непосредственно в ходе выполнения оперативного вмешательства удается получить некоторое коли чество аутогенной костной ткани, которая может быть использована (в том числе при смешивании с другими материалами) в костнопластическом эта пе той же операции для восполнения малых костных дефектов. Однако в большинстве случаев требуется расширение или выполнение дополнительного опе рационного доступа для получения нужного объема костной ткани, что сопряжено с увеличением про должительности оперативного вмешательства, нане сением дополнительной травмы, увеличением риска осложнений и т.д.[6, 7].

В связи с вышеуказанными предпосылками, па раллельно развитию хирургических технологий ак тивно разрабатываются новые остеопластические материалы, обладающие биологической активно стью, за счет которой способны по эффективности в замещении костных дефектов составить «конкурен цию» аутогенной костной ткани.

Данное исследование было нацелено на соз дание и оценку биологического действия ген активированного костного графта (ГАКГ) – остео пластического материала, содержащего в качестве активного компонента плазмидную ДНК с геном, кодирующим сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF-A165).

Материал и методы

Дизайн исследования

Исследование включало два последовательных этапа: 1) in vitro, нацеленный на создание прототи па ГАКГ и оценку его специфической активности на культурах клеток; 2) in vivo, направленный на опре деление биологического действия разработанного ГАКГ в модели замещения костных дефектов крити ческих размеров.

Исследования in vitro

Создание ГАКГ. Матриксы-носители для ген ных конструкций выбирали из ряда групп ординар ных остеопластических материалов, разрешенных для клинического применения и не обладающих биологической активностью: аллогенные демине рализованные костные матриксы, синтетические β-трикальцийфосфаты, композитные материалы на основе коллагена и гидроксиапатита, ксеногенные костные матриксы и ряд других. Обработку материа лов и совмещение с генными конструкциями – плаз мидными ДНК с геном vegf-a165 (plVEGF-A165) – выполняли по специальной методике: последо вательная отмывка матриксов 0,5 М (в течение 10 ч) и 10 мМ (4 раза по 10 мин) растворами фос фатного буфера при постоянном перемешивании и температуре 37°С с последующим высушиванием; инкубирование с раствором плазмидных ДНК (кон центрация 1 мкг/мкл) в течение 10 ч при постоянном перемешивании и температуре 37°С, промывание материалов и высушивание. Определение уровня плазмидных ДНК, сорбированных материалами, производили с помощью флуоресцентной фотоме трии после элюирования нуклеиновых кислот 0,5 М раствором фосфатного буфера. Из полученных ГАКГ для последующих исследований отбирали один ва риант, матрикс-носитель которого обладал наиболь шей емкостью для генных конструкций.

Оценка специфической активности. Фрагмен ты полученного ГАКГ массой 10 мг (содержание plVEGF-A165 – 1,7 мкг) были ко-инкубированы с культурами мультипотентных мезенхимальных стро мальных клеток (ММСК), количеством 2×105 кл. Культивирование выполнялось в стандартных усло виях (среда MesenCult (StemCell Technology, США) с добавлением 2 мM L-глутамина (StemCell Technology, США), 100 ед./мл пенициллина и 100 мг/мл стреп томицина (StemCell Technology, США) и 10% добав ки для культивирования клеток MesenCult (StemCell Technology, США) при температуре 37°С и содержа нии СО2 в атмосфере 5% в течение 5 сут. без смены среды. На 1, 3, 5 сут. забирали пробы культуральной среды и с помощью иммуноферментного анализа определяли концентрацию VEGF. В качестве контро ля служили культуры клеток с продукцией только эндогенного VEGF – без ко-инкубирования с какими либо материалами.

Исследования in vivo

Исследования выполнены на кроликах породы Шиншилла (n = 10), массой 2,0–2,5 кг, обоего пола с соблюдением международных правил гуман ного обращения с животными. Изготовление ГАКГ. Для создания ГАКГ, подлежа щих исследованию in vivo, использовали двухкассет ные плазмидную ДНК, содержащую под одним про мотором помимо vegf-а165, еще и ген, кодирующий зеленый флуоресцирующий белок (GFP), что было обусловлено необходимостью детекции экспрессии плазмид in vivo. Двухкассетные плазмиды были предоставлены Казанским федеральным универси тетом.

Имплантация в костные дефекты. В качестве мо дели критического костного дефекта использовался стандартный протокол – краниальные дефекты (диа метром 10 мм) теменных костей. После премеди кации (атропин 0,04 мг/кг, цефазолин 25 мг/кг) и антисептической обработки операционного поля под инфильтрационным обезболиванием (раствор Уль тракаина 1,7 мл) и седацией (2,5% раствор тио пентала натрия внутримышечно 2 мл) производился линейный разрез (2–2,5 см) мягких тканей в про екции сагиттального шва от бугра затылочной кости кпереди. Поверхность теменных костей обнажалась распатором. Каждому животному с помощью боров обратный конус, 1,0 мм) выполнялись двусторон ние симметричные дефекты теменных костей без повреждения твердой мозговой оболочки. В дефект правой теменной кости вносили ГАКГ (эксперимен тальная группа, № 1), а в дефект левой – соответ ствующий носитель без плазмидной ДНК (контроль ная группа, № 2) (рис. 1). В группе № 3 дефекты оставляли без имплантации каких-либо материалов. Операционная рана ушивалась послойно узловыми швами (Vicryl 5/0, 4/0), сведение краев рассеченной надкостницы обеспечивало фиксацию материалов в пределах костных дефектов.

Методы оценки результатов. Результаты опре деляли через 15 и 30 сут. с использованием двух групп методов. С целью оценки эффективности ма териалов в замещении костных дефектов опреде ляли характеристики регенерата с помощью муль тиспиральной компьютерной томографии (МСКТ) и гистологического исследования, а также долю новообразованной костной ткани в общем объеме дефекта гистоморфометрическим анализом. При изготовлении препаратов срезы во всех случа ях производили во фронтальной плоскости через центр ранее выполненного дефекта. Для установле ния механизма действия генных конструкций ГАКГ использовали иммуногистохимический анализ с антителами к GFP (обнаружение экспрессии двухкассетных плазмидных ДНК клетками регенерата) и α-гладкомышечному актину (α-SMA, детекция гладкомышечных клеток сосудов).

Результаты

Разработанный ГАКГ

С помощью флуоресцентной спектрофотометрии нами были установлены средние концентрации плаз мидной ДНК, сорбируемые различными остеопла стическими материалами. Из широкой линейки раз личных материалов для создания ГАКГ был выбран композитный материал на основе коллагена и гидро кисапатита, обладающий наибольшей ёмкостью для нуклеиновых кислот (табл. 1).

Продукция VEGF культурой ММСК

С помощью иммуноферментного анализа была установлена статистически значимо большее со держание VEGF в культуральной среде ММСК при их ко-инкубировании с ГАКГ, по сравнению с культурой клеток без каких-либо материалов. Максимальный уровень VEGF наблюдался на пятые сутки и состав лял, в случае ГАКГ, 4720±244,8 пг/мг.

Биологическое действие ГАКГ в костном дефекте Через 15 сут., по данным МСКТ, в эксперимен тальной и контрольной группах 1 существенной раз ницы между регенератами правой (имплантация ГАКГ) и левой (имплантация носителя без плаз мидной ДНК) теменных костей не было выявле но: определялись четкие контуры дефектов, плот ность регенерата соответствовала «мягким тканям» с включением частиц с повышенной рентгенконтраст ностью (по всей видимости, гранул гидроксиапатита носителя). Однако контуры дефекта в контрольной группе 2 (без имплантации каких либо материалов) были ровными, тогда как после имплантации ГАКГ – «изрезанными», менее четкими. Через 30 сут. при имплантации ГАКГ наблюдались более выраженные признаки остеогенеза – неровные, нечеткие контуры дефектов за счет повышенной плотности перифери ческих зон регенерата (2-3 мм), в то время как в контроле границы дефектов сохранялись четкими и ровными, их диаметр не сокращался (рис. 2). Результаты МСКТ были подтверждены гистоло гическим и гистоморфометрическим исследовани ями. Через 15 сут. во всех группах большая часть дефектов была заполнена реактивно изменен ной рыхлой волокнистой соединительной тканью (рис. 3).

Однако в случае имплантации ГАКГ определял ся более выраженный репаративный остеогенез со стороны костных опилов, по сравнению с контролем. При этом, гранулы ГАКГ, расположенные даже в центральной части дефекта, были окружены узким ободком новообразованной ретикуло-фиброзной костной ткани (рис. 3Б). При использовании носителя без плазмидной ДНК остеоиндуктивного действия не наблюдалось – все гранулы введенного материала были окружены только реактивно измененной рыхлой волокнистой соединительной тканью без признаков остеогенеза (рис. 3Г). В группе № 3, без имплантации каких-либо материалов, периферический остеогенез был минимален, а реактивно измененная рыхлая волокнистая соединительная ткань, заполнявшая дефект, истончена, что характерно для естественного хода репаративного процесса в случае костных дефектов «критического размера» (рис. 3Д). При иммуногистохимической реакции с антителами к GFP в регенератах экспериментальной группы на сроке 15 сут. были выявлены клетки, экспрессирующие данный белок (рис. 4), а также выявлено значимо большее количество сосудов, чем в контроле (рис. 5).

Через 30 сут. в группе с имплантацией ГАКГ наблюдался еще более выраженный регенерат из ретикуло-фиброзной костной ткани, исходящей как из костных опилов, так и из гранул материала. При имплантации носителя без плазмидной ДНК опре делялся лишь периферический костный регенерат умеренного объема, а фрагменты введенного ма териала были все также окружены реактивно из мененной рыхлой волокнистой соединительной тканью без признаков репаративного остеогенеза (рис. 6).

В группе № 3 – гистологическая картина остава лась практически без изменений, объем костного ре генерата с периферии увеличивался незначительно. Результаты гистологического исследования были подтверждены количественно гистоморфометрией: при использовании ГАКГ доля костного регенерата в общей площади ранее выполненного дефекта со ставила через 15 сут. 19±3%, а через 30 – 28±7%, в то время как в контроле – 14±2% и 17±3%, соответственно.

Обсуждение

Все остеопластические материалы, как уже при меняющиеся в клинической практике, так и находя щиеся на стадии разработки, могут быть разделены на две основные категории: «ординарные» и «опти мизированные» («активированные»). Первая вклю чает относительно простые материалы, механизм действия которых обусловлен лишь остеокондукци ей (выполнение роли своеобразной «матрицы» для формирующегося регенерата, направляющей его рост) и привнесением в область костного дефекта структурных компонентов межклеточного матрикса, которые высвобождаются при биодеградации мате риала и теоретически могут быть включены в состав костного регенерата. В результате предел эффек тивности «ординарных» материалов ограничивается оптимизацией естественного хода репаративного остеогенеза, что достаточно для замещения неболь ших костных дефектов, характеризующихся высоким уровнем активности нативных остеоиндуцирующих факторов[8]. Вторая категория представлена более сложными остеопластическими материалами, со стоящими из матрикса-носителя и активного компо нента, определяющего ключевой механизм действия «оптимизированного» остеопластического материа ла, а именно: остеоиндукцию и (или) остеогенность. В этой связи, они призваны не столько поддержать естественный ход репаративного остеогенеза, сколько индуцировать и обеспечить его высокую ак тивность, что теоретически делает их применимыми в замещении не только малых, но и протяженных, объемных костных дефектов, характеризующихся «остеогенной недостаточностью» – низкой активно стью естественных остеоиндуцирующих факторов: клеток и продуцируемых ими регуляторных белков [9]. В настоящее время в качестве активных ком понентов «оптимизированных» остеопластических материалов используются белки (факторы роста), различные типы клеток и геннотерапевтических кон струкций, что позволяет разделить разработки на три технологических направления – постгеномное, клеточное и генное[10].

Создание ГАКГ

Данное исследование было нацелено на создание и оценку биологического действия ГАКГ, состоящего из носителя и plVEGF-A165. Выбор в качестве ген ных конструкций ГАКГ именно plVEGF-A165 был об условлен тем фактом, что ангиогенез является кри тически значимым остеоиндуцирующим фактором [11], реализующим свое действие как за счет по вышения парциального давления кислорода, приво дящего к активизации пролиферации и дифференци ровки предшественников остеобластов[8, 12], так и за счет привлечения в область костного дефекта дополнительных камбиальных резервов[13]. При этом, для использованных в работе plVEGF-A165 уже была показана выраженная ангиогенная активность в ходе экспериментальных и клинических исследова ний препарата «Неоваскулген» (Институт стволовых клеток человека, Россия), действующим веществом которого являются те же самые plVEGF-A165[14]. Существует несколько основных технологий объе динения генных конструкций и носителей из твердых материалов. Наиболее известными являются: со вмещение компонентов на этапе синтеза носителя, имеющего на одном из этапов процесса изготовления жидкую фазу[15]; помещение генных конструкций в гелевую субстанцию и последующая комбинация по лученного комплекса с носителем[16], сонопорация генных конструкций в гелевый носитель и т.д.[17]. Нами же была использована другая технология, ос нованная на образовании нековалентной химической связи между нуклеиновыми кислотами и гидрокси апатитом, в том или ином варианте входящим в со став большинства остеопластических материалов, выбранных нами для исследования.

Биологическое действие ГАКГ

Остеоиндуцирующее действие ГАКГ определя ется биологически активным компонентом, вхо дящим в его состав, – генными конструкциями. В соответствии с современными данными, механизм действия генных конструкций основан на их посту плении в клетки-мишени, далее в их ядра и экспрес сии целевого гена клетками, в данном конкретном случае гена VEGF-A165 человека. Клетки начинают работать как «биореакторы» терапевтического белка (кодируемого плазмидой), который в свою очередь обеспечивает специфическое действие. Вероят ность встраивания (интеграции) плазмидной ДНК в геном клетки очень низка, ген экспрессируются с эписомы ограниченное время (10–14 сут.), что обе спечивает безопасность технологии. В этой связи, для реализации своего терапевтического действия плазмидная ДНК plVEGF-A165, использованная нами для создания ГАКГ, должна высвобождаться из структуры носителя (в т.ч. при его биодеградации), проникать в клетки-мишени и приводить к повыше нию продукции белка VEGF, который в свою очередь должен активировать специфические биологические эффекты, главным образом, неоангиогенез.

В ходе экспериментов in vivo была выявлена зна чимо большая концентрация VEGF в кондициониро ванной среде ММСК, ко-инкубированных с ГАКГ, по сравнению с контролем. Такой эффект дает основа ния полагать, что клетки экспрессировали не только эндогенный vegf, но и экзогенный, привнесенный ГАКГ, что подтвердило реализацию проникновения плазмидной ДНК in vitro и согласуется с литературными данными[18].

Для определения механизма действия ГАКГ in vivo мы использовали при его создании двухкассет ные плазмидные ДНК, кодирующие, помимо VEGF, еще и GFP. Учитывая отсутствие в геноме эукари отических клеток кролика гена gfp, его экспрессия, установленная на сроке 15 сут. в регенерате в группе № 1, однозначно свидетельствовала о проникнове нии в клетки плазмидной ДНК с целевыми генами. Таким образом, высвобождение plVEGF-A165 из структуры материала-носителя, проникновение в клетки in vivo и экспрессия целевых генов были подтверждены результатами исследования.

Для проверки реализации второй части меха низма действия, связанной с непосредственным эффектом терапевтического белка, кодируемого генными конструкциями, нами был выполнен имму ногистохимический анализ с антителами к α-SMA – белку цитоскелета клеток, формирующих в том чис ле и сосудтистую стенку, начиная с уровня артериол, что позволяет использовать его для идентифика ции таких и более крупных сосудов. В регенерате, образовавшемся в костном дефекте через 15 сут. после имплантации ГАКГ определялось значительно большее количество сосудов, чем в случае введе ния носителя без генных конструкций. Данный факт подтвердил активацию ангиогенеза, по всей видимо сти, обусловленную действием VEGF, кодируемого plVEGF-A165 ГАКГ. При этом, динамика генной ин дукции ангиогенеза согласуется с литературными данными, описывающими пик синтеза мРНК VEGF через 2 сут. после трансфекции клеток плазмидны ми ДНК с геном vegf, а наибольший уровень про дукции терапевтического белка – на 5–7 сут.[19]. Полученные данные о реализации механизма действия активного компонента ГАКГ стали основой для оптимистичных ожиданий в отношении влияния материала на репаративный остеогенез, поскольку ангиогенез является ключевым остеоиндуцирующим фактором[20]. И действительно на сроках 15 и 30 сут. объем костного регенерата при имплантации ГАКГ был статистически значимо большим, чем в контроле. Характерно, что наибольший объем кост ного регенерата наблюдался со стороны латерально го костного опила (часть теменной кости, обращен ная к височной), что, вероятно, обусловлено более интенсивным кровоснабжением данной области, а также малой шириной медиального костного фраг мента (участок шириной 3–4 мм между дефектами теменных костей). Безусловно, столь ранние сроки наблюдения не позволяют в полной мере оценить эффективность исследуемого материала в воспол нении костных дефектов, тем более «критических» размеров, однако являются достаточными для опре деления механизма действия генных конструкций и биологического эффекта изделия в целом.

Помимо указанных характеристик, нами была обнаружена еще одна особенность восстановления костной ткани при имплантации ГАКГ: уже через 15 сут. после имплантации большинство гранул вве денного ГАКГ были окружены регенератом из рети куло-фиброзной костной ткани (более выраженным на сроке 30 сут.). При использовании материала без plVEGF-A165 такого эффекта не наблюдалось. Учи тывая непосредственную связь сформированного костного регенерата с гранулами ГАКГ и удаленность от границ костного дефекта, именно фрагменты ма териала являлись источником репаративного осте огенеза в центральной части дефекта, что служит прямым подтверждением остеоиндуктивного действия, обеспеченного plVEGF-A165.

Заключение

Таким образом, нами разработан первый в Рос сии прототип ГАКГ и на его примере показана вы полнимость концепции локальной генной индукции репаративного процесса. plVEGF-A165 при введении на носителе в область костного дефекта сохранили биологическую активность и реализовали специфи ческий механизм действия, проявившийся в конечном итоге в остеоиндукции.

Необходимо также отметить, что исследования в области создания ген-активированных материалов не отличаются особой новизной – первые работы датируются 90-ми годами XX в.[21]. Однако наи большие достижения в данной области, наиболее успешные результаты, а также интенсификация ис следований отмечается лишь в последние 7–8 лет, что связано с развитием генных технологий в целом и все более активными попытками транслировать результаты разработок в данной области в клиниче скую практику[22–26]. Наше исследование выгодно отличается от всех других в рамках технологической платформы ген-активированных остеопластических материалов за счет использования в качестве ак тивного компонента уже проработанной, зарегистри рованной и разрешенной для клинического приме нения в составе препарата «Неоваскулген» генной конструкции – plVEGF-A165.

Подняться вверх сайта