Поиск Кабинет

Случай применения генных конструкций с vegf и вмр2 в ветеринарии при восстановлении передней крестообразной связки у собаки крупной породы

Гены & Клетки: Том IX, №2, 2014 год, стр: 93-95

 

Авторы

Закирова Е.Ю., Васин Н.Н., Журавлева М.Н., Ризванов А.А.

ДЛЯ ТОГО ЧТОБЫ СКАЧАТЬ СТАТЬЮ В ФОРМАТЕ PDF ВАМ НЕОБХОДИМО АВТОРИЗОВАТЬСЯ, ЛИБО ЗАРЕГИСТРИРОВАТЬСЯ

Представлено ветеринарное наблюдение успешного лечения разрыва передней крестообразной связки коленного сустава у собаки породы лабрадор с использованием генной терапии. Было выполнено введение геннотерапевтического средства на основе плазмидной ДНК-конструкции pBud-clVEGF-clBMP2, экспрессирующей одновременно два рекомбинантных терапевтических белка собаки – VEGF164 и BMP2. Эффект лечения оценивали при помощи клинико-анамнестических показателей и рентгенологического обследования.

Введение

Среди травм опорно-двигательного аппарата домашних животных разрыв передней крестообразной связки стоит на третьем месте (6,1%) после переломов костей и вывихов суставов. Это часто встречаемая патология среди собак, особенно крупных пород, причиной которой является прямое повреждение и дегенеративное изменение тканей коленного сустава [1]. Хирургическое лечение успешно в 85% случаев. Однако, в последующем, несмотря на лечение, у животных часто развиваются дегенеративные изменения в суставе. Полностью восстановить функции сустава после разрыва удается лишь в 50% случаев [2], при этом восстановительный период занимает не менее полугода. В это время хозяину собаки необходимо строго следить, чтобы не произошло повторное травмирование конечности, и, конечно, нельзя допускать резких движений собаки, чрезвычайных физических нагрузок.

На сегодняшний день актуальным является вопрос восстановления передней крестообразной связки с возможностью ранней функциональной нагрузки в послеоперационном периоде с целью профилактики дегенеративных изменений поврежденного сустава. Для достижения наилучшего анатомо-функционального результата эффекта нами была разработана и применена генно-терапевтическая конструкция на основе плазмидной ДНК pBud-clVEGF-clBMP2, экспрессирующей одновременно два важных рекомбинантных терапевтических белка – VEGF 164 и BMP2. В качестве вектора использовалась pBudCE4.1, позволяющая одновременно и независимо экспрессировать 2 разных трансгена под контролем промоторов CMV и EF1α [3, 4]. Встроенные гены ответственны за синтез белков, видоспецифичных для собаки. Целью проведенного лечения была оценка технической выполнимости, безопасности и возможной эффективности pBud-clVEGF-clBMP2 в условиях ветеринарной клиники.

Материал и методы

Субъектом исследования послужила 6-летняя служебная собака породы лабрадор с разрывом передней крестообразной связки коленного сустава правой задней конечности травматического генеза. Объектом исследования была плазмидная ДНК pBud-clVEGF-clBMP2, предоставленная ООО «ВетГен». Препарат вводили непосредственно в область разрыва связки в ходе открытого оперативного вмешательства. Было введено 500 мг плазмидной ДНК в 0,5 мл 0,9% раствора натрия хлорида. Диагностика разрыва передней крестообразной связки осуществлялась клинико-анамнестически. Для исключения дополнительных повреждений костей коленного сустава было проведено рентгенологическое исследование в двух ортогональных проек- циях – передне-задней и боковой.

Лечение осуществлялось оперативным путем в одной из ветеринарных клиник г. Казани. Содержание животного и обращение с ним соответствовало гуманным принципам, а также правилам, принятым в К(П)ФУ, рекомендациям местного этического комитета и национальным законам. На проведение операции и введение плазмидного ДНК было получено согласие кинолога.

В условиях ветеринарной операционной с учетом правил асептики под общим наркозом было проведено интраартикулярное оперативное вмешательство, заключающееся в подшивании передней крестообразной связки к месту ее крепления. При этом осуществляли чрескостную фиксацию поврежденной связки к эпифизу бедренной кости в месте отрыва с помощью полигликолидной плетеной нити с атрав- матическими иглами (Татхимфармпрепараты). Затем в связку, на расстоянии 0,5 см от места раз- рыва было введено 500 мг препарата плазмидной ДНК в объеме 0,5 мл физрастовра.

После операции конечность была иммобилизирована гипсовой лангетой сроком на 1 мес., назначено антимикробное и противовоспалительнлое лечение, хондропротекторы (Хондроитин), ограничение физических нагрузок сроком на 1 мес.

Результаты

Кожная рана после операции зажила первичным натяжением, швы были сняты через 7 дней. Через месяц лангета демонтирована. При осмотре болезненности коленного сустава, а также значительной мышечной атрофии не выявлено. Симптом «переднего выдвижного ящика» отсутствовал. Рентгенологическое исследование показало анатомически правильное расположение суставных поверхностей относительно друг друга.

Слабая опирающаяся хромота сохранялась 5 дней, после чего животное уверенно встало на лапу. Было рекомендовано расширение двигательного режима, плавание. Следовательно, через 1,5 мес. после проведенной операции по восстановлению передней крестообразной связки наблюдали полное клиническое восстановление функции коленного сустава, отсутствие хромоты и болезненности при пальпации. Повторные осмотры через 3, 6 и 12 мес. не выявили отсроченных осложнений со стороны прооперированного сустава.

Обсуждение

Традиционно в лечении травм и заболеваний опорно-двигательного аппарата используются иммобилизация гипсовыми и (или) полимерными повязками, хирургическое лечение (остеосинтез, сшивание поврежденных связок и сухожилий). Для улучшения качества лечения и ускорения реабилитации применяют нестероидные противовоспалительные средства, местное введение глюкокортикостероидов, физиотерапию (лазеротерапия, магнитотерапия, массаж) [5]. До середины 1990-х гг. рынок ветеринарных препаратов в России был практически не развит, сейчас же зарегистрировано свыше 2000 наименований ветеринарных лекарственных препаратов (и около 14 000 лекарственных препаратов для лечения заболеваний человека) [6]. Однако применение существующих терапевтических и физиотерапевтических методик зачастую оказывается малоэффективным и редко приводит к долгосрочному положительному эффекту [7].

К новым передовым подходам в лечении заболеваний опорно-двигательного аппарата можно отнести использование рекомбинантных белков, клеточную, генную терапию.

Генная терапия – совокупность биотехнологических и медицинских методов, направленных на внесение изменений в генетический аппарат соматических клеток в целях лечения заболеваний или придания клеткам новых функций [8]. На данный момент в мире зарегистрировано 4 геннотерапевтических препарата для лечения заболеваний человека: Gendicine, Oncorine, Glybera и отечественный препарат Неоваскулген. Вышеперечисленные препараты зарекомендовали себя как безопасные, эффективные и уникальные в своем роде геннотерапевтические конструкции для лечения онкологических (Gendicine, Oncorine), ишемических (Неоваскулген) и метаболитических (Glybera) заболеваний. В то же время, несмотря на огромное количество доклинических исследований на животных препаратов для лечения заболеваний человека, не зарегистрировано ни одного препарата на основе генной терапии непосредственно для целей ветеринарной медицины. Однако именно этот подход может обеспечить не только временное устранение симптомов заболевания, но и оказать глубокое влияние на патогенез процесса, улучшить результаты традиционных методов лечения и значительно снизить расходы на длительное восстановление животных после перенесенных травм и вследствие хронических заболеваний опорно-двигательного аппарата, особенно в сфере профессионального спорта.

Важно отметить, что применительно к генной терапии для достижения максимального результата при минимальных побочных эффектах необходимо использование строго видоспецифичных препаратов. Это связано с отсутствием абсолютной гомологии в строении белков животных и человека, что не позволяет использовать ранее апробированные и успешно применяющиеся для лечения человека препараты в области ветеринарной медицины ввиду потенциальных иммунологических осложнений и более низкой биологической активностью [9].

В процессе заживления раны активированные тромбоциты высвобождают ряд цитокинов, включая сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF. vascular endothelial growth factor), являющийся хемоаттрактантом для лейкоцитов (они мигрируют в очаг в процессе естественного воспаления) и эндотелиальных клеток, которые в области травмы служат материалом для формирования новых капилляров. Также VEGF повышает проницаемость сосудистой стенки в месте травмы, что усиливает формирование грануляционной ткани. VEGF способствует пролиферации и миграции эндотелиоцитов, стимулируя ангиогенез, а также привлекает предшественники эндотелиоцитов из костного мозга, стимулирует деятельность перицитов и стабилизирует формирующиеся сосуды [10].

Костные морфогенетические белки (англ. bone morphogenetic protein, BMP) – это уникальная группа белков из надсемейства трансформирующего фактора роста бета. BMP были открыты в 1965 г. M. Urist. Эти белки играют большую роль в процессах индукции костеобразования, поддержания кости и ее регенерации. На данный момент открыто уже 20 изоформ белков BMP, из которых BMP2-BMP7 относятся к семейству TGFβ. Функции различных белков BMP несколько различаются, но в целом они влияют на формирование костной и хрящевой ткани [11].

В зависимости от их концентрации, BMP могут действовать как хемоаттрактанты, привлекая различные виды клеток; митогенные или дифференцировочные агенты, вызывающие дифференцировку мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток в хондрогенном и остеогенном направлениях [12]. Хорошо известно положительное влияние воздействия BMP2 на процесс восстановления кости и хряща при их повреждении [12]. Однако их воздействие на связки изучено недостаточно, а полученные данные противоречивы. Так, имеются сообщения о том, что экзогенное введение BMP2 приводит к остеогенной дифференцировке в культуре клеток передней продольной связки позвоночника. BMP2 обнаруживается в передней продольной связке позвоночника у лиц с патологической её оссификацией, которая может приводить к анкилозу позвонков [11].

Показан положительный эффект BMP2 при восстановительных операциях на крестообразной связке. Переднюю крестообразную связку кроликов заменяли сухожильным аутотрансплантатом, предварительно подвергнутым in vitro генетической модификации аденовирусом, несущим ген BMP2. Через 4 недели после операции выявили обширные зоны вновь сформированного костно-хрящевого матрикса в области прикрепления трансплантата к поверхности кости. Также показано существенное увеличение прочности на разрыв по сравнению с контрольной группой (аутотрансплантация нативного сухожилия). В контрольной группе грануляционная ткань в области перехода кости в сухожилие претерпевала реорганизацию в грубоволокнистую соединительную ткань [13]. Аналогичным образом был показан положительный эффект воздействия мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга, трансдуцированных лентивирусом, несущим ген BMP2, на процесс заживления сухожильно-костного соединения аутотрансплантата в модели повреждения передней крестообразной связки у кроликов [14].

Таким образом, нами получено положительное наблюдение применение в ветеринарном случае прототипа генно-терапевтического препарата на основе плазмидной ДНК pBud-clVEGF-clBMP2, кодирующей видоспецифичные белки.

Не смотря на единичность наблюдения, следует предположить, что pBud-clVEGF-clBMP2 не оказывает негативного воздействия при введении ее в связки, а также, нельзя исключить положительного эффекта на процессы регенерации.

Подняться вверх сайта