Поиск Кабинет

Системный подход к обеспечению качества мезенхимальных стволовых клеток костного мозга для клинического применения

Гены & Клетки: Том VI, №2, 2011 год, стр.: 51-54

 

Авторы

Шахпазян Н.К., Кобзева И.В., Астрелина Т.А., Яковлева М.В., Осипова Е.Ю., Скоробогатова Е.В.

ДЛЯ ТОГО ЧТОБЫ СКАЧАТЬ СТАТЬЮ В ФОРМАТЕ PDF ВАМ НЕОБХОДИМО АВТОРИЗОВАТЬСЯ, ЛИБО ЗАРЕГИСТРИРОВАТЬСЯ

Мезенхимальные стволовые клетки (МСК) костного мозга (КМ) не только обеспечивают микроокружение для гемопоэтических стволовых клеток (ГСК), но способны к дифференцировке в остеогенном, адипогенном, хондрогенном и других направлениях. Известна роль МСК КМ в снижении выраженности и тяжести реакции «трансплантат против хозяина» (РТПХ). Целью исследования была оценка качества и биологической безопасности заготовленных МСК для клинического применения. Была проведена экспансия МСК 94 образцов КМ за период с 2007 г. по декабрь 2010 г. в ГУЗ «БСК ДЗМ» по медицинским технологиям, зарегистрированным в Роздравнадзоре. Полученные МСК КМ выдавались в нативном виде или подвергались криохранению в жидком азоте. Качество полученных МСК КМ оценивали с помощью бактериологического и вирусологического контроля; определяли жизнеспособность клеток с трипановым синим и окраской 7AAD; подтверждали иммунофенотип, характерный для клеток мезенхимального происхождения: CD73+; CD90+; CD105+; CD45–; CD34–; CD14–; CD133–; CD19–; HLA DR–. Биологическую безопасность МСК КМ оценивали методом кариотипирования метафазных хромосом и исследованием интерфазных хромосом X, Y, 6, 8, 11 методом FISH. Разработаны документы, регламентирующие этапы работы культивирования МСК КМ. Был заготовлен 71 образец МСК КМ (157 доз) и использован при трансплантации ГСК 23 пациентам (70 доз МСК) с целью приживления ГСК, профилактики или контроля РТПХ. В большинстве случаев котрансплантаця МСК проводилась в дозе 2 млн кл/кг. Острых реакций на введение МСК не было. Таким образом, оценка качества и безопасности МСК КМ, заготовленных в ГУЗ «БСК ДЗМ» для клинического применения, включала в себя строгое ведение документации по GMP стандартам, контроль количества клеток для достижения оптимальной дозы, бактериологический и вирусологический контроль, подтверждение мезенхимального происхождения МСК и оценку биологической безопасности.

Термин «стволовая клетка» введен в научный обиход в начале прошлого века русским гистологом А.А. Максимовым [1], сформулировавшим идею о наличии клеток, обладающих высокой пролиферативной активностью и способностью дифференцироваться в более «зрелые» клетки, которые составляют сотни клеточных типов, выделяемых у млекопитающих. Известен ряд стволовых клеток с раз ными направлениями дифференцировки, выявленных в различ ных тканях.

Во второй половине XX в. А.Я. Фриденштейном с соавт. (1970) [2] впервые было доказано существование в костном мозге стволовых клеток стромы, образующих в культуре колонии фибробластоподобных клеток. Учитывая их способность дифференцироваться в рамках мезенхимальной линии в различных направлениях, они получили название мезенхимальных стволовых клеток (МСК).

Одним из основных источников МСК, предназначенных для клинического применения, служит костный мозг – аутогенный или аллогенный (донорский). МСК обладают способностью положительно влиять на репарационные характеристики различных тканей за счет высокого уровня пролиферативного потенциала и способности к дифференцировке в зрелые мезенхимальные клетки (остеогенная, хондрогенная, адипогенная, мышечная, периваскулярная и др. дифференцировка), обеспечивать микроокружение гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) [3].

В последнее время наиболее активно МСК используются в лечении гематологических, иммунологических, наследственных заболеваний и др. в качестве котрансплантата ГСК. Спектр заболеваний, при которых применяется МСК в качестве котрансплантаната, широк и включает в себя аплазию костного мозга, лейкозы, генетические заболевания, например, синдром Вискотта – Олдрича, Чедиака – Хигаси, гемофагоцитарный лимфогистиоцитоз, мукополисахаридоз первого типа и др. Применение МСК преследует две основные цели – облегчить приживление ГСК и предупредить развитие острой и хронической реакции «трансплантат против хозяина» (РТПХ) [4].

МСК в качестве котрансплантата формируют микроокружение для трансплантированных ГСК костного мозга или пуповинной крови. Микроокружение костного мозга представляет собой сложную трехмерную структуру, где ГСК пролиферируют, «созревают», мигрируют в синусоидальное пространство и выходят в циркуляцию регулируемым образом. Сами МСК и происходящие из них клетки стромы в микроокружении костного мозга обеспечивают подходящую среду для самообновления, пролиферации и дифференцировки ГСК. Микроокружение гемопоэтических клеток не только контролирует транспорт и хоуминг ГСК, но также обеспечивает межклеточные контакты и секретирует цитокины, которые поддерживают устойчивое состояние гемопоэза.

Вторым важнейшим клиническим применением МСК костного мозга является профилактика и коррекция острой и хронической РТПХ, возникающей при аллогенной трансплантации ГСК [5–7]. При РТПХ развивается комплекс иммунологических реакций, который приводит к утяжелению состояния здоровья пациента вплоть до летального исхода.

Известно, что аллогенные МСК не обладают иммуностимулирующими свойствами in vitro: они не индуцируют пролиферацию лимфоцитов и не являются мишенями для действия NK-клеток. Кроме того, in vitro исследования показали иммуносупрессивные свойства МСК в отношении цитотоксических Т-лимфоцитов, что делает их весьма привлекательным объектом с точки зрения иммунокоррегирующей терапии аутоиммунных реакций и реакций отторжения трансплантата [8–11].

Проведенные исследования продемонстрировали, что применение МСК обеспечивает поддержку полного приживления ГСК, а медиана выживаемости пациентов с трансплантированными МСК намного выше, чем в контрольной группе – без использования МСК [5, 6]. Хотя еще не получены неоспоримые доказательства того, что именно трансплантация МСК приводит к позитивной иммуномодуляции in vivo. Однако можно сделать вывод, что котрансплантация МСК может быть практически безопасной при надлежащем контроле качества полученных клеток.

Иммуномодулирующее свойство МСК связывают с действием цитокинов и непосредственным влиянием на иммунокомпетентные клетки, они являются «клетками-дипломатами», регулирующими межклеточные взаимоотношения [7]. Такое свойство МСК служит основой для еще одной сферы их клинического применения – терапии аутоиммунных заболеваний (болезнь Крона, неспецифический язвенный колит, демиелинизирующие заболевания и др.).

Следует отметить, что спектр клинического применения МСК расширяется: имеются сообщения об использовании трансплантаций МСК с регенеративной целью в травматологии и ортопедии, существуют обнадеживающие экспериментальные данные, показывающие противоопухолевый эффект МСК, в том числе на солидные опухоли [12] и т.д.

Целью настоящего исследования явилась оценка качества и биологической безопасности заготовленных МСК костного мозга для клинического применения.

Материал и методы

В 2003 г. по распоряжению Правительства Москвы был создан государственный банк – Государственное учреждение здравоохранения города Москвы «Банк стволовых клеток департамента здравоохранения г. Москвы» (ГУЗ «БСК ДЗМ»). На все виды деятельности ГУЗ «БСК ДЗМ» имеет лицензию на осуществление высокотехнологичной медицинской помощи, 15 зарегистрированных в Росздравнадзоре медицинских технологий. ГУЗ «БСК ДЗМ» оснащено современным оборудованием для выделения и криохранения стволовых клеток, соответствующего мировым стандартам безопасности и качества, имеет диагностические лаборатории.

Основным документом, регламентирующим деятельность банков пуповинной крови, является приказ МЗ РФ № 325 от 25 июля 2003 года «О развитии клеточных технологий в Российской Федерации». Образцы костного мозга собирались в отделении трансплантации костного мозга ФГУ ФНКЦ ДГОИ Росздрава и доставлялись в ГУЗ «БСК ДЗМ». За период с 2007 г. по декабрь 2010 г. в ГУЗ «БСК ДЗМ» проводилось культивирование (экспансия) согласно зарегистрированным медицинским технологиям аутогенных, аллогенных и гаплоидентичных МСК 94 образцов костного мозга [13, 14].

Выдача образцов МСК для котрансплантации осуществлялась после получения запроса из трансплантационного отделения, выписки из истории болезни пациента, содержащей показания к применению МСК за подписью лечащего врача и руководителя учреждения, а также ряда документов, регламентирующих транспортировку и обоснование применения МСК у данного пациента. Единая форма запроса на выдачу МСК была разработана и принята к использованию в ГУЗ «БСК ДЗМ». Котрансплантация образцов МСК, выданных ГУЗ «БСК ДЗМ», проводилась в отделении трансплантации костного мозга ФГУ ФНКЦ ДГОИ Росздрава.

Известно, что терапевтический эффект образца МСК зависит от дозы, которая определяется количеством клеток на единицу массы тела пациента. Поэтому целью процесса культивирования МСК «ex vivo», осуществляемого в ГУЗ «БСК ДЗМ», было добиться необходимого количества клеток для достижения оптимальной дозы МСК для пациента. Таким образом, на один образец было несколько доз.

При планировании клинического применения МСК доза подбиралась с учетом количества МСК на 1кг массы тела пациента. Культивирование МСК было регламентировано соответствующими документами, подготовленными в ГУЗ «БСК ДЗМ». Досье с информацией по каждому образцу, начиная от начала выделения и культивирования МСК до закладки на криохранение или выдачи дозы МСК в нативном виде, хранятся в ГУЗ «БСК ДЗМ», для чего разработаны и используются соответствующие формы документов и базы данных.

К образцу МСК, выданному для трансплантации прилагаются:

– информация об общем числе МСК в образце;

– данные, свидетельствующие о качестве и безопасности материала (результаты бактериального анализа, анализа метафазных хромосом (кариотипирование) и анализа частоты анеуплоидии);

– информация о любых отклонениях, возникших при сборе, обработке, хранении дозы МСК;

– протокол изъятия дозы МСК из криохранения в связи с передачей в трансплантационный центр, где содержится следующая информация: номер и штрих-код образца ПК, название трасплантационного центра, дата закладки и дата изъятия образца из криохранилища, личность курьера.

Транспортировка замороженного образца жестко регламентирована и осуществлялась в максимально сжатые сроки в течение 24–36 ч при температуре не выше -135°С с соблюдением норм пересылки контейнеров, содержащих жидкий азот. Транспортировка нативного образца осуществлялась в течение 2 ч непосредственно после выделения.

При условии использования образца МСК для клинических целей в ГУЗ «БСК ДЗМ» трансплантационным центром предоставлялась информация о клинических особенностях процедуры (наличие нежелательных проявлений, связанных с инфузией МСК, если они были), данные о приживлении трансплантата, показателях химеризма. Полученные данные хранятся как на бумажных носителях, так и заносятся в электронную базу. Данные актуализируются по мере поступления новой информации.

Результаты и обсуждение

За период с 2007 по декабрь 2010 г. в ГУЗ «БСК ДЗМ» поступили для экспансии 94 образца костного мозга. При культивировании МСК костного мозга было отбраковано 3 образца (3,2%) по бактериальной контаминации; 3 образца (3,2%) по техническим причинам; 17 образцов (18,1%) из-за отсутствия роста в культуре. Таким образом, в ГУЗ «БСК ДЗМ» был заготовлен 71 образец МСК (157 доз) костного мозга.

Полученные образцы МСК были использованы для клинического применения 23 пациентам (70 доз) при котрансплантации с ГСК. Гендерный состав группы был следующий: 13 мальчиков и 10 девочек – медиана возраста составила 7 лет (от 1 года до 18 лет). Все образцы прошли бактериологический и вирусологический контроль. При выявлении положительных результатов образцы были отбракованы.

Иммунофенотипирование МСК проводилось до культивирования и перед выдачей или закладкой на криохранение. Иммунофенотипирование было проведено у 41 образца МСК. По данным иммунофенотипирования, выданные для клинического применения дозы МСК имели характеристики, свойственные клеткам мезенхимального происхождения: CD73+; CD90+; CD105+; CD45–; CD34–; CD14–; CD133–; CD19–; HLA DR–.

Жизнеспособность полученных МСК исследовалась окрашиванием трипановым синим (жизнеспособность клеток составляла не менее 95%) и окраской 7AAD.

40 образцов МСК прошли кариологический контроль на 4–5 пассаже и 9–10 пассаже с целью обнаружения потенциально опасных для пациентов генетических отклонений в трансплантируемом материале путем анализа частоты анеуплоидии. Анализ частоты анеуплоидии проводился методом кариотипирования метафазных хромосом и исследования интерфазных хромосом X, Y, 6, 8, 11 FISH методом. В двух культурах МСК были обнаружены клоны анеуплоидных клеток. В одной культуре – с трисомией по хромосоме 8, в другом случае в культуре МСК, выделенной из костного мозга здоровой женщины, был выявлен клон клеток, несущих одну половую Х хромосому. На четвертом пассаже обнаружили 12%, а к десятому пассажу количество анеуплоидных клеток увеличилось до 91%.

Таким образом, аномальные клоны были обнаружены на ранних пассажах и сохранялись до поздних этапов культивирования. Источниками клонов могли быть аномальные клетки костного мозга здоровых доноров, для которых не был запущен механизм апоптоза in vivo, или же аберрантные клетки, возникшие in vitro в процессе выделения из костного мозга и на ранних этапах культивирования МСК.

Котрансплантация была проведена 23 пациентам при следующих заболеваниях: острый лимфобластный лейкоз – 4 (17%); острый бифенотипический лейкоз – 1 (4%); ювенильный миело-моноцитарный лейкоз – 1 (4%); синдром Фанкони – 4 (17%), апластическая анемия – 3 (13%); адренолейкодистрофия – 1 (4%); синдром Вискотта – Олдрича – 1 (4%); тяжелый комбинированный иммуннодефицит – 1 (4%); лимфогистиоцитоз – 2 (9%); хронический миелолейкоз – 1 (4%); миелодиспластический синдром – 3 (13%); остеопетроз – 1 (4%).

Показаниями для котрансплантации МСК являлись: трансплантация ГСК (создание условий для приживления ГСК, профилактика РТПХ) – 11 (48%); хроническая РТПХ – 2 (9%); острая РТПХ – 9 (39%); гипофункция трансплантированных ГСК – 1 (4%).

Таким образом, всего было проведено котрансплантаций 70 доз МСК 23 пациентам. Во всех случаях пациентам были котрансплантированы МСК, выращенные из аллогенного донорского костного мозга, причем в 5 случаях (7,1%) применения МСК использовались клетки, полученные от родственных доноров (родители, сибсы). 12 пациентам (52%) котрансплантация проведена однократно, 4 пациентам (17%) – двукратно, 2 пациентам (9%) – трехкратно, 2 больным (9%) МСК котрансплантировались 4 раза, 1 пациенту (4%) – 6 раз; 1 пациенту (4%) – 8 раз и 2 пациентам (9%) – 11 раз. В 62 случаях (88,6%) котрансплантаця МСК проводилось в дозе 2 млн кл/кг, в 5 случаях (7,1%) МСК трансплантированы в дозе 1млн кл/кг, в 1 случае (1,4%) 0,8 млн кл/кг и в 1 случае (1,4%) 5,6 млн кл/кг.

На введение МСК не было отмечено острых реакций (острые реакции, развившиеся в течение трансфузии, или в течение 1–2 ч после нее – фебрильные, в т.ч. инфекционные, токсические, аллергические, острое поражение легких).

Определение донорского химеризма проводили для оценки приживления МСК костного мозга у пациентов на разных сроках наблюдения (от +26 дня до +302 дня) после аллогенной трансплантации ГСК у 18 пациентов. Использовали следующие праймеры: D3S4545, FXYTETRO, D7S1843, VWA, VNTR1+VNTR2, 17DUP4+17DUP5, D3S1358. Было выявлено, что у 16 больных (89%) при трансплантации ГСК отмечался 98% реципиентский химеризм МСК костного мозга вне зависимости от основного диагноза, режима кондиционирования, источника используемого трансплантата, объема трансплантата, качественного его состава (содержание нуклеарных и CD34+ клеток), времени, прошедшего после проведения трансплантации, и тяжести клинического состояния. У 2 детей (11%) с диагнозом ОМЛ отмечался временный донорский химеризм МСК костного мозга. У 1 ребенка донорский химеризм на 52-й день составлял 27 % и резко снизился к 58 дню до 6%. У другого ребенка на 33-й день химеризм МСК составлял 24% и более плавно снизился к 81-му дню на 17%.

Следует отметить, что в литературе описаны способы получения МСК из костного мозга без культивирования, на основе метода селекции по маркерам CD105; CD271 и STRO-1 [15–18]. По данным авторов метод обладает рядом преимуществ, таких как быстрота получения МСК, снижение риска микробной контаминации, контаминации ксеногенными белками (сыворотка животных и заменители), высокая «чистота» популяции по данным иммунофенотипирования.

Исходя из опыта ГУЗ «БСК ДЗМ» следует отметить, что выделение МСК из костного мозга методом культивирования обладает рядом преимуществ, которые позволяют ему сохранять свои позиции главного источника МСК для клинического применения. Одно из самых существенных преимуществ состоит в том, что метод культивирования позволяет получить необходимую дозу клеток для достижения максимального терапевтического эффекта, что осуществлялось в лаборатории культуральных исследований ГУЗ «БСК ДЗМ». Второй существенный положительный момент, использованый в ГУЗ «БСК ДЗМ», заключается в возможности культивирования клеток до 10-го пассажа и исследования клеток на предмет биологической безопасности на генетические отклонения, которые в противном случае могут проявиться in vivo. Что касается микробной контаминации и иммунофенотипической «чистоты» популяции, то при надлежащем контроле качества выдаваемых образцов МСК, проводимом в ГУЗ «БСК ДЗМ», можно добиться получения бактериологически и вирусологически безопасного и качественного материала МСК.

Таким образом, МСК обладают рядом уникальных особенностей, которые обуславливают их применение в клинике: способность поддерживать гемопоэз, облегчая приживление ГСК; иммуномодулирющее действие, в том числе в отношении РТПХ; способность дифференцироваться в различные типы мезенхимальных клеток и, наконец, отсутствие экспрессии антигенов MHC II класса позволяет широко внедрить аллогенные трансплантации МСК. Развитие современных методов контроля качества выдаваемых образцов МСК позволяет исключить использование некачественного и биологически опасного материала для улучшения непосредственного эффекта клинического применения.

Подняться вверх сайта