Поиск Кабинет

Секретируемый транскрипционный фактор HOXB4 стимулирует дифференцировку эндотелия из ЭСК человека

Гены & Клетки: Том II, №1, 2007 год, стр.: 56-59

 

Авторы

Лагарькова М.А., Муфазалов И.А., Волчков П.Ю., Киселев С.Л.

ДЛЯ ТОГО ЧТОБЫ СКАЧАТЬ СТАТЬЮ В ФОРМАТЕ PDF ВАМ НЕОБХОДИМО АВТОРИЗОВАТЬСЯ, ЛИБО ЗАРЕГИСТРИРОВАТЬСЯ

Цепью данного исследования бьло выяснить, влияет ли секретируемый транскрипционный фактор HOXB4 на дифференцировку ЭСК человека в эндотелий. HOXB4 - мультифункциональный транскрипционный фактор, способный индуцировать или подавлять апоптоз, стимулировать или репрессировать пролиферацию и дифференци-ровку клеток. Известна важная роль HOXB4 в регуляции гемопоэза. Для выяснения влияния HOXB4 на дифференцировку в эндотелий было проведено кокультивирование ЭСК человека со стромальными клетками линии OP9 и клетками линии OP9hoxb4, секретирующими транскрипционный фактор HOXB4-TAT. Провеценный иммуногис-тохимический анализ не выявил различие экспрессии клетками эндотелиальных маркеров в зависимости от используемого фидера, но маркеры зрелого эндотелия (CD105) и сосудоподобные структуры, растущие на фидере из OP9hoxB4, проявлялись быстрее, чем на фидере OP9. Таким образом, наши данные позволяют утверждать, что секретируемый HOXB4-TATоказывает влияние на контролируе-муюдифференцировкуэмбрионапьньхствоповьхкпетокчеповека по эндотелиальному пути.

Введение

К настоящему времени получен целый ряд доказательств общего происхождения гематопоэтических и эндотелиальных клеток в процессе развития. Клетки-предшественники, потенциально способные образовывать гематопоэтические и эндотелиальные клетки, были идентифицированы in vitro на модели ЭСК мыши [1-3] и позже in vivo при изучении гас-труляции мышиного эмбриона [4]. При дифференцировке ЭСК мыши было также показано, что клоногенные гема-топоэтические предщественники могут происходить из VE-cadherin+CD45- клеток эндотелиального типа [5]. Нами ведутся работы по прямой дифференцировке ЭСК человека в клетки эндотелия и разрабатываются методы селекции дифференцированных клеток. Используя коллаген IV и коллаген I в качестве матрикса, специальную среду и VEGF и bFGF в качестве ростовых факторов, нам удалось получить клеточные популяции, в которых эндотелиальные клетки составляют более 5С% (статья готовится к печати]. Известно, что на гематопоэтическую дифференцировку ЭСК значительное влияние оказывает кокультивирование с мьшины-ми стромальными клетками, а также гиперэкспрессия транскрипционного фактора HOXB4 [6-8]. Учитывая общее происхождение гематопоэтических и эндотелиальных клеток, не исключено, что оба фактора могут существенным образом стимулировать процессы дифференцировки.

HOXB4 принадлежит к высококонсервативному семейству гомеобоксных транскрипционных факторов HOX, играющих важнейшую роль в морфогенезе многоклеточных организмов. HOX семейство характеризуется наличием высококонсервативного ДНК-связывающего домена; кластерным расположением генов в хромосомах; особым порядком внутри группы, отражающим пространственно-временную характеристику экспрессии в эмбриогенезе. HOXB4 - мультифункциональный транскрипционный фактор, способный индуцировать и подавлять апоптоз, стимулировать и репрессировать пролиферацию и дифференцировку клеток. В эмбриогенезе HOXB4 участвует в развитии эпидермиса, нервной и скелетной систем [6]. Особая роль принадлежит HOXB4 в регуляции гематопоэза млекопитающих. Эктопическая экспрессия HOXB4 в стволовых клетках крови мыши приводит к более чем 1ССС-кратному увеличению числа поликлональных гематопоэтических предшественников, преимущественно лимфоидного и миелоидного ряда, без признаков трансформации клеток [7].

Экспрессия HoxB4 в человеческом костном мозге и в пуповинной крови усиливает репопуляционную способность гематопоэтических стволовых клеток, не усиливает их дифференцировку и не индуцирует лейкемию [9]. Нокаут HoxB4 приводит к уменьшению клеток в гематопоэтических органах и уменьшению количества гематопоэтических предшественников у мышей [1С]. Однако, используя лентивирусную экспрессию HoxB4 в гематопоэтических клетках, полученных из человеческих ЭСК, не удалось увеличить время жизни таких клеток при подсадке иммунодефицитным мышам [11]. В линии ЭСК человека, стабильно экспрессирующей HOXB4, клетки можно поддерживать в недифференцированном состоянии, а при дифференцировке с образованием эмбриоидных телец наблюдается преимущественная диф-ференцировка в гематопоэтические клетки [12]. Недавно был показан дозо-зависимый эффект действия HOXB4 на пролиферацию гематопоэтических клеток [13].

Целью данного исследования было выяснить, влияет ли секретируемый транскрипционный фактор HOXB4 на диф-ференцировку ЭСК человека в эндотелий.

Предпосылкой к исследованию послужил ряд опубликованных данных о стимулирующем влиянии HoxB4 на дифференцировку гематопоэтических клеток, а также наблюдения проф. А.Я. Медвинского о стимулирующей роли HOXB4 при эндотелиальной дифференцировке CD45-FLK1 + клеток из AGM [aorta-gonad-mesonephros] эмбрионов мыши [неопубликованные данные].

Для изучения роли HOXB4 в дифференцировке ЭСК человека мы сравнили дифференцировку ЭСК человека при культивировании на двух разных фидерах. Первый фидер представлял собой линию стромальных фибробластов мыши OP9. В научной литературе имеются многочисленные сведения об увеличении количества и скорости дифференци-ровки клеток крови при кокультивировании с этой линией стволовых клеток крови, клеток, обладающих свойствами гемангиобласта и эмбриональных стволовых клеток мыши и человека [8, 14, 15] OP-9 также поддерживает пролиферацию и дифференцировку эндотелиальных FLk1 + предшественников, происходящих из ЭСК мыши [16].

Вторым фидером служили клетки OP9-HoxB4. Это линия клеток на основе линии OP9, стабильно экспрессирующая секретируемый HoxB4 с TAT [transduction domain of HIV transactivating protein] для транслокации в ядро.

Материал и методы

В работе использовались клеточные линии эмбриональных стволовых клеток человека ESM02 и ESM03 [17] с 25 по 41 пассаж, культивирование происходило в следующих условиях: Knockout DMEM [Invitrogen], 20% фетальная бычья сыворотка (Invitrogen, ES qualified], 2 мМ L-глутамин [Invitrogen], 0.1 мМ p-меркаптоэтанол [Sigma], 1 % смесь аминокислот [Invitrogen], рекомбинантный bFGF [4 нг/ml] [Chemicon], пенициллин/ стрептомицин [50 ЕД/мл; 50 мкг/мл] [Invitrogen] при 37° С и 5% на фидерном слое МЭФ, инактивированных митоми-цином С в желатинизированных 35 мм культуральных чашках Петри [Corning и Greiner]. Клеточные линии OP9, OP9hохB4 [получены в RIKEN Center for Developmental Biology, Япония] и первичные инактивированные мышиные эмбриональные фибробласты [МЭФ] культивировались в среде a-MEM, 20% фетальная бычья сыворотка, пенициллин/стрептомицин [50 ЕД/мл; 50 мкг/мл], 2 мМ L-глутамин [Invitrogen].

Для индукции эндотелиальной дифференцировки колонии недифференцированных ЭСК снимали механической диссек-цией [как описано выше] и переносили на чашки Петри, покрытые коллагеном IV типа [Sigma] в среду, содержащую DMEM/F12 [HyClone], 15% фетальной бычей сыворотки [HyClone, characterized], 1 % смесь аминокислот [Invitrogen], пенициллин/стрептомицин [50 ЕД/мл; 50 мкг/мл] [Invitrogen], рекомбинантный bFGF [4 нг/мл], SCF [20 нг/мл] -VEGF от 10 до 25 нг/мл [Chemicon].

Для иммуногистохимического анализа эмбриональных стволовых клеток и эмбриоидных телец использовались следующие антитела: первичные [anti-human CD31, anti-human vWF, anti-human CD105 [BD]] и вторичные [goat anti-mouse Alexa Fluor 488 или 546 Ig [Molecular Probes]].

Результаты и их обсуждение

При использовании OP9hoxB4 и OP9 для индукции эндотелиальной дифференцировки клетки высевали в плотности около 50% монослоя в одинаковые 6-луночные планшеты. После прикрепления OP9hoxB4 и OP9 на них высевали колонии ЭСК человека, предварительно освобожденные с помощью коллагеназы от фидера МЭФ. Культивирование проводилось в течение 5-10 дней в среде для дифференцировки эндотелия с меньшим [5 нг/мл] содержанием всех ростовых факторов. Состояние клеток и степень их дифференцировки оценивались через 7 дней по следующим параметрам: количество клеток в колонии; морфология клеток в колонии; диаметр колонии; количество эндотелиальных клеток и степень их дифференцировки.

Число клеток в колонии оценивалось следующим образом: по 20 колоний с каждого из фидеров снимали механически наконечником от пипетки, промывали дважды PBS и инкубировали 1 5 минут в нагретом до 37°С 0,05% трипсине, после чего инактивировали последний добавлением FBS Клетки центрифугировали, разбавляли в 500 мкл среды DMEM и подсчитывали в камере Горяева.

К сожалению, нам не удалось получить статистически достоверных данных о том, есть ли разница в общем количестве клеток в колониях, растущих на OP9hoxB4 и OP9. Это можно объяснить и объективными, и субъективными факторами: клетки в колонии после 7 дней дифференцировки находятся в разных ее стадиях, популяция гетерогенна и имеет разную чувствительность к трипсину. В то время как одни группы клеток еще не успевают распасться на одиночные, другие «перетрипсиниваются» и слипаются в конгломераты. Подсчет, таким образом, затруднен, и мы решили, что он не может считаться достоверным. Другой способ подсчета - окрашивание фиксированных колоний DAPI также не дал обнадеживающих результатов, потому что колонии -структура многослойная, и ядра часто заслоняют друг друга, делая подсчет практически невозможным.

Тем не менее, на фидерах OP9hoxB4 и OP9 колонии имели явные различия в морфологии и размере (рис. 1). Поскольку колонии вырастали достаточно большие, хорошо видные невооруженным глазом, для определения размера применялась как микроскопия (соотнесение увеличения объектива с размером объекта в светлом поле), так и простое измерение линейкой (фиксированную в метаноле чашку с колониями переворачивали, отмечали тонким фломастером границы колонии и измеряли диаметр). Измерения показали, что кокультивирование ЭСК с OP9 и OP9hoxB4 ведет к существенному увеличению размера колоний уже после трех дней кокультивирования (рис. 2). Морфология дифференцированных ЭСК на двух фидерах также отличалась: в колониях, которые росли на OP9hoxB4, было больше структур, подобных сосудистой сети (указаны стрелками на рис. 1, б) и больше клеток, имеющих более высокий статус дифференцировки (меньшее соотношение ядро/цитоплазма, больший размер и др. характеристики).

Для того чтобы определить, как повлияло культивирование на разных фидерах на дифференцировку эндотелия из ЭСК, был проведен иммуногистохимический анализ колоний на 8-10-й день культивирования. Проведенный иммуногисто-химический анализ выявил различие в экспрессии клетками эндотелиальных маркеров в зависимости от используемого фидера. Уровень экспрессии CD31 и vWF и сложность сетчатых структур были выше в клетках, растущих на фидере из OP9hoxB4, чем на OP9. Более того, на 9-й день кокультивирования поздний эндотелиальный маркер CD105 обнаруживался только в клетках, подвергавшихся влиянию HOXB4 (рис. 3).

Под действием HOXB4 наблюдалась активная миграция сосудистоподобных структур за границу колонии, что подтверждается иммуногистохимическим анализом (рис. 4) Подобной миграции в колониях, растущих на OP9, на том же сроке дифференцировки (10 дней) мы не наблюдали.

Таким образом, наши данные позволяют утверждать, что секретируемый фидерными клетками транскрипционный фактор HOXB4, слитый с ТАТ белком, оказывает влияние на скорость и степень дифференцировки ЭСК человека по эндотелиальному пути. Механизмы подобного стимулирующего действия, а также увеличивает ли HOXB4 число эндотелиальных предшественников при дифференцировке ЭСК человека, остается пока неизвестным. Следует также отметить, что в данной работе мы сконцентрировали усилия на изучении эндотелиальной дифференцировки ЭСК человека и использовали среды, которые не способствуют дифферен-цировке ЭСК по пути гематопоэза. Например, в средах отсутствовали интерлейкин-3 и GM-CSF, обязательные для гематопоэтических дифференцировок. Вопрос о том, влияет ли HOXB4 на увеличение популяции гемангиобластов в дифференцирующихся ЭСК и/или на сдвиг дифференци-ровки гемангиобласта в сторону кроветворных или эндотелиальных предшественников, остается открытым.

Мы не можем исключить возможности не прямого, а опосредованного воздействия HOXB4 на дифференциров-ку ЭСК человека в эндотелий. Существует вероятность, что HOXB4 оказывает влияние на саму линию OP9, а она, в свою очередь, секретирует в среду факторы, стимулирующие диф-ференцировку ЭСК. Создание контрольной линии OP9, трансфицированной плазмидой, содержащей HOXB4 без TAT элемента, который бы не секретировался во внешнюю среду, позволит в будущем прояснить этот вопрос.

Подняться вверх сайта