Поиск Кабинет

С-kit и десмин-позитивные клетки в регенерации островков поджелудочной железы при экспериментальном диабете у крыс

Гены & Клетки: Том VIII, №3, 2013 год, стр: 113-115

 

Авторы

Калигин М.С., Плюшкина А.С., Титова А.А., Титова М.А., Гумерова А.А., Киясов А.П.

ДЛЯ ТОГО ЧТОБЫ СКАЧАТЬ СТАТЬЮ В ФОРМАТЕ PDF ВАМ НЕОБХОДИМО АВТОРИЗОВАТЬСЯ, ЛИБО ЗАРЕГИСТРИРОВАТЬСЯ

В настоящее время получены данные о том, что C-kit и десмин-позитивные звездчатые клетки поджелудочной железы задействованы в регенерации её эндокринной ча сти. Однако до сих пор очень мало что известно об участии и возможных путях дифференцировки этих клеток в ходе восстановления поджелудочной железы. Поэтому целью исследования стало изучение данных клеточных популяций в динамике при экспериментальном аллоксановом диабете у крыс. Работа была проведена на 33 белых беспородных крысах самцах с экспериментальным диабетом, у которых определяли уровень глюкозы, инсулина и глюкагона в сыво ротке крови, а также изучали эскпрессию десмина (маркёр звездчатых клеток), α-гладкомышечного актина (α-SMA, маркёр миофибробластов), С-kit (маркёр коммитирова ных клеток-предшественниц эндокриноцитов), глюкагона и инсулина (маркёры дифференцированных α- и β-клеток островков Лангерганса) в ткани поджелудочной железы. Уже через сутки экспериментальной гипергликемии нами была обнаружена экспрессия десмина в клетках островков поджелудочной железы, максимальное число позитив ных клеток отмечено на третьи сутки. Также через сутки в островках появлялись и C-kit позитивные клетки, которые синтезировали глюкагон и инсулин. Поскольку звездчатые клетки поджелудочной железы способны вырабатывать разнообразные факторы роста и компоненты межклеточно го матрикса, мы предполагаем, что они являются важным фактором микроокружения для дифференцировки C-kit позитивных прогениторных клеток в β-инсулоциты через стадию глюкагон-продуцирующих клеток.

Проблема поиска новых подходов к лечению са харного диабета I типа остаётся актуальной задачей современной медицины. Пациенты до сих пор нуж даются в ежедневных инъекциях экзогенного инсу лина, причём полностью контролировать уровень глюкозы в крови довольно сложно. Поэтому нередко при сахарном диабете развиваются осложнения, ко торые приводят молодое работоспособное населе ние к ранней инвалидности[1]. Перспективной аль тернативой существующим методам заместительной терапии сахарного диабета может стать трансплан тация клеток-предшественниц эндокриноцитов под желудочной железы (ПЖ). Их применение поможет устранить причину возникновения сахарного диабета I типа – дефицит β-клеток островков Лангерганса, что позволит пациентам отказаться от введения экзогенного инсулина.

Главной проблемой в разработке таких методов лечения является то, что до сих пор не идентифици рованы стволовые клетки эндокриноцитов. Предпола гают, что эти клетки могут находиться среди клеток эпителия протоков ПЖ или среди ацинарных клеток. Не исключено, что стволовые клетки эндокриноцитов локализуются внутри самих островков[2].

Одним их подходов для идентификации может быть выявление этих клеток по специфическим маркёрам, в частности по C-kit или CD117, которые экспрессируются многими типами стволовых и про гениторных клеток. Это трансмембранный рецептор, поэтому с его помощью можно не только идентифицировать клетки-предшественницы, но и выделять их. Ранее нами была показана важная роль C-kit+ клеток ПЖ человека в пренатальном развитии островков Лангерганса[3].

Еще одной популяцией клеток, которые претен дуют на роль предшественниц β-клеток, являются звёздчатые клетки ПЖ, которые по своему фено типу и свойствам очень близки к звёздчатым клет кам печени. Клетки обеих популяций накапливают витамин А, секретируют широкий спектр факторов роста и синтезируют макромолекулы межклеточного вещества, в связи в чем именно активностью этих клеток многие авторы объясняют развитие фибро за печени и ПЖ[4]. Одним из основных маркеров звёздчатых клеток является белок промежуточных филаментов десмин. Имеются данные о том, что эти клетки могут быть источником развития эндокрино цитов ПЖ[5, 6]. Однако до сих пор нет сведений об участии клеток данной популяции в регенерации ПЖ и, в частности, об их роли в восстановлении эн докриноцитов при различных видах повреждения, в том числе при сахарном диабете I типа. Поэтому це лью нашего исследования стало изучение популяций клеток, экспрессирующих C-kit и десмин, в процессе регенерации ПЖ при экспериментальном диабете I типа.

Материал и методы

Исследование проведено на 33 белых беспород ных крысах самцах, которые были разделены на три группы. Животным 1 группы внутрибрюшинно вводи ли аллоксан (Sigma-Aldrich) в 1 мл 0,02 М ацетат ного буфера рН = 4,0 в дозе 180 мг/кг, животным 2 группы вводили ацетатный буфер (контроль дей ствия растворителя). Животным 3 группы ничего не вводили (норма). Через 1, 2, 3, 5, 7, 14, 21, 28 сут. у животных забирали кровь для биохимического ис следования, выводили из эксперимента и забирали ПЖ для морфологического анализа. Парафиновые срезы ПЖ окрашивали иммуногистохимически с коммерческими антителами к десмину (1:30, D33, DAKO), α-SMA (1:50, клон 1А4), С-kit (1:200; клон Т595, Novocastra, Великобритания), инсулину (1:40; клон 2D11-Н5, Novocastra, Великобритания) и глю кагону (1:50; кроличьи поликлональные антитела, Novocastra, Великобритания). Уровень глюкозы определяли в сыворотке крови глюкозооксидазным методом[7]. Полученные данные подвергали ста тистической обработке с помощью статистического графического пакета Microsoft Excel 2010.

Результаты

Через сутки после введения аллоксана в крови крыс наблюдали повышение уровня глюкозы, что свидетельствовало о развитии гипергликемии. На этом сроке в единичных клетках островков ПЖ крыс мы выявили экспрессию C-kit, и она сохранялась в этих клетках на всех исследованных сроках (рис. 1А). У контрольных животных экспрессию C-kit в клетках ПЖ мы не наблюдали. При проведении се рий двойного окрашивания на инсулин, глюкагон и C-kit мы обнаружили, C-kit+-клетки, которые проду цировали и инсулин, и глюкагон (рис. 1Б-Г).

В норме в ПЖ крысы были выявлены единич ные десмин+-звездчатые клетки вокруг ацинусов, а также десмин+-гладкомышечные клетки сосудов. В островках не наблюдали клеток, в цитоплазме которых присутствовал бы десмин. Через сутки по сле введения аллоксана количество десмин+-клеток вокруг ацинусов увеличилось. Еще через сутки та ких клеток становилось ещё больше, а через 3 сут. после введения аллоксана число десмин+-клеток достигло максимума и начинало уменьшаться по сле 5 сут. эксперимента (рис. 2В, Г). В островках десмин+-клетки были выявлены через сутки после введения аллоксана, максимальное их число, так же, как и вокруг ацинусов, отмечено через 3 сут., а после 5 сут. их количество снижалось (рис. 2). При этом на всех сроках эксперимента паттерн окраши вания на α-SMA не отличался от нормы, экспрессия наблюдалось только в мышечной оболочке сосудов (рис. 2Д), что свидетельствует о том, что увели чение количества десмин+-клеток на фоне ЭД не сопровождается их трансдифференцировкой в мио фибробласты и, следовательно, повышением риска развития фиброза ПЖ.

Обсуждение

Результаты исследования свидетельствуют о том, что десмин+ и C-kit+-клетки появляются в островках ПЖ при экспериментальном диабете, вызванном ал локсаном, следовательно, каким-то образом могут участвовать в регенерации островков. Однако ха рактер этого участия, по-видимому, различен. Если количество C-kit+-клеток увеличивается и они на чинают экспрессировать сначала глюкагон, а затем инсулин, что подтверждает возможность их диффе ренцировки в β-клетки островков Лангерганса, то десмин+-клетки, главным образом, увеличивались количественно без последующей продукции гормо нов. Учитывая их способность к секреции факто ров роста и компонентов межклеточного вещества, можно предположить, что они обеспечивают необ ходимое микроокружение для дифференцировки С-kit+-клеток островков в эндокриноциты. При этом нельзя исключать того, что звёздчатые клетки непо средственно сами могут восстанавливать популяцию β-клеток, однако по какому пути идёт их дифференцировка не ясно. Рассматривая полученные данные в комплексе, можно предположить, что при повреждении β-клеток гипергликемия запускает активацию звёздчатых клеток, которые начинают синтезировать факторы роста и цитокины. Синтезированные факторы роста взаимодействуют с рецепторами прогениторных клеток, и, в частности, с рецептором фактора стволовых клеток C-kit[9]. Это взаимодействие приводит к дифференцировке C-kit+ в β-клетки через стадию глюкагон-продуцирующих клеток.

Полученные результаты изучения изменений популяций звёздчатых клеток ПЖ и C-kit+-клеток при экспериментальном диабете позволяют также предположить, что одновременная транспланта ция клеток обеих популяций может быть более эффективной для восстановления островков ПЖ, чем изолированная трансплантация только C-kit+ клеток. Однако проверка этой гипотезы требует про должения исследований в направлении разработки методов клеточной терапии сахарного диабета I типа.

Подняться вверх сайта