Поиск Кабинет

Роль рецепторов VEGF-A165 в ангиогенезе

Гены & Клетки: Том VIII, №1, 2013 год, стр.: 12-18

 

Авторы

Арутюнян И.В., Кананыхина Е.Ю., Макаров А.В.

ДЛЯ ТОГО ЧТОБЫ СКАЧАТЬ СТАТЬЮ В ФОРМАТЕ PDF ВАМ НЕОБХОДИМО АВТОРИЗОВАТЬСЯ, ЛИБО ЗАРЕГИСТРИРОВАТЬСЯ

Представлен обзор современных литературных данных о различной роли двух рецепторов сосудистого эндоте лиального фактора роста-А165 (VEGF-A165) в регуляции ангиогенеза. VEGFR2 является основным эффекторным рецептором и запускает внутриклеточные каскады, обе спечивающие выживаемость, пролиферацию и мигра цию эндотелиоцитов, привлечение прогениторных клеток, формирование и созревание новых кровеносных сосудов. VEGFR1 же является основным регулятором активности VEGF-A165, предотвращая чрезмерный ангиогенный ответ за счет механизма отрицательной обратной связи. Про анализированы данные о вариабельности количества и со отношения рецепторов VEGFR1 и VEGFR2 на поверхности различных клеточных типов, обеспечивающих тонкую регу ляцию действия лиганда.

Ангиогенез является сложным многоступенча тым процессом, в который одновременно вовлече ны многие типы клеток, отвечающие на действие десятков индукторов и ингибиторов ангиогенеза[1, 2]. Стимуляция ангиогенеза для терапии ише мических состояний или подавление при лече нии новообразований невозможны без понимания механизмов его регулирования. Взаимодействие клеточных технологий и современных методов экс периментальной молекулярной биологии открывает перед исследователями возможность поиска новых мишеней для индукции или ингибирования ангиогенеза.

Одним из наиболее перспективных направлений для про- или анти-ангиогенной терапии является введение в организм сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF) или его ингибиторов в виде рекомбинантных белков, генетических конструкций или генетически модифицированных клеток. В то же время клинические исследования показали, что терапевтический эффект у отдельных пациентов значительно варьирует, что может свидетельство вать об изначальной гетерогенности популяции по некоторым факторам ангиогенеза, тесно связанным с VEGF[3]. Для увеличения эффективности VEGF ориентированной терапии необходимо учитывать эндогенные механизмы регуляции ангиогенеза: на личие положительных или отрицательных обратных связей, конкурентных ингибиторов и т.п. Наиболее очевидным с этой точки зрения является исследование взаимодействий в системе VEGF-VEGFR (рецептор VEGF) в качестве первого рубежа регулирования передачи сигнала VEGF.

Семейство белков VEGF

VEGF является ключевым фактором ангиогенеза как в пренатальном, так и в постнатальном периоде[4]. Впервые фактор, избирательно стимулирующий пролиферацию эндотелиоцитов, был выделен в ла боратории J. Folkman в 1971 г.[5]. За прошедшие 40 лет ведущая роль белков семейства VEGF в фи зиологическом и патологическом ангиогенезе была подтверждена многочисленными исследованиями. VEGF синтезируют многие типы клеток: скелетные миобласты, эндотелиальные клетки, циркулирую щие в периферической крови Т-клетки[6] и даже адипоциты[7]. В условиях гипоксии транскрип ционный фактор HIF-1 (hypoxia-inducible factor-1) обес-печивает 30-кратное увеличение синтеза VEGF в течение нескольких минут[8]. При этом возрастает не только концентрация VEGF в кровото ке, но и увеличивается стабильность мРНК и время полужизни самого белка[9, 10].

Семейство VEGF состоит из нескольких подгрупп и включает в себя как минимум 9 изоформ VEGF-А, 4 изоформы PlGF (placental growth factor), 2 изо формы VEGF-В и другие белки. Множество вариантов одного белка обеспечивается за счет альтернативного сплайсинга в С-концевой области (гепарин-связываю щем домене), обеспечивающей связь белка с поверх ностью клетки (рис. 1).

Члены семейства VEGF имеют разную степень аффинности к группе рецепторов, в которую входят рецепторы VEGFR1 (а также его растворимая форма sVEGFR1), VEGFR2, VEGFR3 и корецепторы NRP1 и NRP2 (нейропилины 1 и 2)[11] (рис. 2).

Наибольшее значение для ангиогенеза имеет группа факторов VEGF-A, иначе называемая VPF (vascular permeability factor), а точнее – изоформа VEGF-А165. Данный белок (Mr около 46 kDa) имеет умеренное сродство к гепарину, поэтому около 50% его связано с поверхностью клетки и 50% способ но диффундировать[12]. Это отличает VEGF-165 от других изоформ: VEGF-121 является полностью се кретируемым белком, а VEGF-183/189/206 прочно связаны с клеточной мембраной и имеют низкую био логическую активность[11]. При этом соотношение VEGF-165 к VEGF-121 в клетке при физиологических условиях составляет 92 к 8%[10].

VEGF-А способен связываться с рецептора ми VEGFR1 и VEGFR2, при этом только изоформа VEGF-A165 имеет сродство к нейропилину NRP1, который значительно усиливает сигнал при стабилизации комплекса NRP1-VEGF-VEGFR2[13, 14].

Рецептор VEGFR1

Наиболее прочно VEGF-А-165 связывается с ре цептором VEGFR1 (иначе называемым Flt-1): аф финность к нему, по крайней мере, в 10 раз больше, чем ко второму рецептору – VEGFR2. Было показано, что нокаутные по гену flt-1 мыши гибнут на 9 сут. внутриутробного развития, но не от отсутствия васку логенеза, а от дезорганизации и чрезмерного роста сосудов[15]. Это позволило выдвинуть предположе ние о том, что в раннем эмбриогенезе VEGFR1 регули рует ангиогенез, связывая излишек VEGF[13]. В экспериментах по исследованию функциональ ной активности VEGFR1 в постнатальном периоде было продемонстрировано, что избирательная акти вация только этого рецептора не приводит к проли ферации первичной культуры эндотелиальных кле ток[16]. Выключение этого рецептора не влияет на VEGF-A-индуцированную пролиферацию клеток ли нии HUVEC (эндотелиальные клетки пупочной вены человека), но подавляет реорганизацию актинового цитоскелета, снижая тем самым способность клеток к миграции[17]. В эндотелиальных клетках и макро фагах активация VEGFR1 запускает внутриклеточ ный каскад реакций с участием р38 МАР (mitogenactivated protein)-киназ, итогом которого является не только перестройка цитоскелета, но и запуск син теза матриксных металлопротеиназ (ММР), в частности – ММР-9[18].

MMP-9 (другие названия: желатиназа B, колла геназа IV типа) относится к группе Zn-зависимых эн допептидаз, способных к деградации коллагеновых и эластиновых волокон внеклеточного матрикса. Экс порт везикул с неактивной формой ММР-9 идет с помощью кинезин-зависимого транспорта по системе стабилизированных микротрубочек, т.е. реорганиза ция цитоскелета в активированных клетках затрагива ет не только актиновый компонент[19]. Вне клетки 92 kDa предшественник ММР-9 расщепляется про теазами (в частности плазмином) до образования 85 kDa активной формы, способной к разрушению базальной мембраны сосудов[20] и плотных контак тов между эндотелиоцитами[21]. Локальное рас творение базальной мембраны обеспечивает воз можность миграции макрофагов, эндотелиоцитов и их предшественников в ткани[22].

Еще одним свойством ММР-9 является ее спо собность высвобождать связанные с внеклеточным матриксом изоформы VEGF за счет внутримоле кулярного протеолиза, в процессе которого рецеп тор-связывающий домен отделяется от С-концевого участка, заякоривающего молекулу в матриксе (гепарин-связывающего домена). В результате полу чаются фрагменты VEGF-113, еще более короткие, чем полностью секретируемый VEGF-121, и способ ные связываться с VEGFR2. Таким образом, ММР 9 вовлекает в ангиогенез изоформы фактора VEGF, прежде выключенные из данного процесса из-за их биологической недоступности[23]. Однако появ ление свободных рецептор-связывающих участков VEGF не стимулирует ангиогенез, как это могло бы показаться на первый взгляд. Такие фрагменты мо лекул являются конкурентными ингибиторами VEGF 165, т.к. связываются со свободными рецепторами VEGFR2, но не «узнаются» корецептором NRP-1, что значительно уменьшает киназную активность основного рецептора[24, 25].

ММР-9 способна к протеолитической активности не только в отношении VEGF, но и ряда других моле кул, в том числе плазминогена. Одним из продуктов его расщепления является ангиостатин, ингибирую щий пролиферацию эндотелиоцитов и формирова ние ими тубулярных структур in vitro[26] и in vivo[27].

Таким образом, существует как минимум два механизма отрицательной обратной связи за счет VEGFR1-опосредованного высвобождения ММР-9 конкурентных изоформ VEGF и ангиостатина. В то же время существуют отдельные данные о наличии по ложительной обратной связи между ММР-9 и уров нем VEGF. Так, при добавлении экзогенной ММР-9 в культуре пигментного эпителия сетчатки человека дозозависимо увеличивается уровень транскрипции и трансляции VEGF-165[28]. Предполагаемая схема VEGFR1-сигнального пути представлена на рис. 3.

Рецептор VEGFR2

VEGFR2 (другие названия: Flk-1 или, в клетках че ловека, KDR) является основным медиатором анги огенных, митогенных и антиапоптотических свойств VEGF-А. Нокаутные по гену flk-1 мыши гибнут на 8 сут. внутриутробного развития из-за отсутствия формирования кровеносных сосудов и чрезвычайно низкого гемопоэза[29]. Антитела против VEGFR2 полностью ингибируют VEGF-индуцированную пролиферацию клеточной культуры HUVEC[17].

Киназная активность VEGFR2 значительно выше, чем у VEGFR1, при этом механизмы активации мно гих белков остаются до конца невыясненными. Боль шая часть данных о внутриклеточных каскадах была получена методом ингибирования отдельных белков с помощью высокоспецифичных антител на культу рах эндотелиальных клеток in vitro или нокаутных мышах in vivo.

Было продемонстрировано, что связывание VEGF-A-165 с VЕGFR2 активирует фосфолипа за С-зависимый путь фосфорилирования ERK1/2 (extracellular-signal-regulated kinases 1/2), которые в свою очередь действуют через циклин D1 и запуска ют синтез ДНК в эндотелиоцитах (G1/S переход фаз клеточного цикла)[17].

Как и в случае VEGFR1-опосредованного сигнала активация VEGFR2 приводит к запуску р38 МАР киназ, что обеспечивает реорганизацию актиново го цитоскелета, однако в этот процесс вовлечен и PI3K (phosphatidylinositide 3-kinases) путь активации. Одновременно происходит фосфорилирование FAK (focal аdhesion kinase) и паксиллина, а также сборка винкулина в области фокальных бляшек. Все вместе приводит к появлению фокальных бляшек в области новообразованных филоподий, что обеспечивает клеточную подвижность[17].

PI3K-зависимым является и фосфорилирова ние Akt (протеинкиназы В), запускающей синтез антиапоптотического белка Bcl-2, что обеспечи вает выживание эндотелиоцитов в условиях гипоксии[30].

Другой функцией киназы Akt является участие в активации эндотелиальной NO-синтазы (eNOs), име ющей главенствующее значение среди других пред ставителей семейства NO-синтаз в процессе анги огенеза[31]. eNOs конститутивно экспрессируется в эндотелиоцитах, однако находится в неактивной форме и связана с поверхностной мембраной белком кавеолином-1. Данный белок играет важную роль в формировании кавеол – вогнутых участков мембра ны, особенно хорошо выраженных на поверхности эндотелиоцитов. Экспериментальные исследования показали, что кавеолин имеет достаточно большое значение в процессе ангиогенеза. Дефицитные по кавеолину мыши продемонстрировали значительно худшие результаты при восстановлении кровоснаб жения ишемизированных конечностей по сравнению с контрольными животными, при этом часть конеч ностей была потеряна. Первичная культура эндоте лиоцитов, выделенных из стенки аорты дефектных по кавеолину мышей, при стимуляции VEGF показала сниженные продукцию NO и формирование тубулярных структур in vitro[32].

Объяснением этому является факт солокализации рецептора VEGFR2 и eNOs на поверхности мембраны внутри кавеол, без которой VEGF-индуцированная активация eNOs является неполноценной[32].

Кавеолин связывает оба этих белка с мембраной и поддерживает их в неактивном состоянии, однако при воздействии VEGF данный комплекс достаточно быстро диссоциирует. Удаление VEGFR2 из кавеол за счет сглаживания мембраны приводит к ингиби рованию VEGF-индуцированных активации ERK1/2 и миграции эндотелиоцитов, что позволило сделать вывод о значимости кавеолин-зависимой солокализации VEGFR2 и eNO-синтазы[33].

Переход eNOs из связанной формы в активную, способную продуцировать NO (за счет перевода L-аргинина в L-цитруллин), является довольно слож ным процессом, инициируемым VEGF (рис. 4). VEGF связывается с VEGFR2 и запускает фосфолипаза С-зависимый сигнальный путь, который приводит к высвобождению ионов кальция из эндоплазматиче ского ретикулума и последующей активацией Са2+ связывающего белка кальмодулина. Кальмодулин связывается с eNO-синтазой и открепляет ее от кавеолина, перенося неактивный белок в цитоплаз му, где к комплексу присоединяется молекулярный шаперон Hsp90. Киназа Akt фосфорилирует eNOs, переводя ее в активное состояние[34, 35].

Выключение гена nos3 приводит к повреждению сосудистой системы: у дефицитных по eNOs мышей наблюдали гипертензию, усиленную пролиферацию гладкомышечных клеток в ответ на повреждение сосуда, повышение агрегации тромбоцитов и лейко цитов. Эти исследования показали, что eNOs и про дукт ее активности NO (оксид азота) играют важную роль в запуске пролиферации эндотелиоцитов, их миграции и проницаемости сосудов[36, 34]. Дефи цит eNO-синтазы приводит также к значительному уменьшению общего числа предшественников эндо телиоцитов в костном мозге, периферической крови и селезенке[37]. При моделировании ишемии на eNOs-/- мышах было значительно снижено перерас пределение кровотока по предсуществующим кол латералям, а ангиогенный эффект вводимых цитокинов VEGF и SDF-1 нивелирован[38].

В 1998 г. Нобелевская премия по медицине была присуждена исследователям R. Furchgott, L. Ignarro и F. Murad за открытие роли оксида азота как сиг нальной молекулы в регуляции сердечно-сосудистой системы, в частности за открытие активации им гуанилатциклазы. Этот результат позволил понять механизмы гипотензивного, спазмолитического, а также противотромбозного действия различных нитрозо- и нитросоединений, в частности нитро глицерина, способных продуцировать в организме животных и человека оксид азота[39].

Оксид азота является одновременно транзиент ной аутокринной и паракринной сигнальной молеку лой благодаря наличию растворимой и связанной с мембраной форм рецепторов NO, обладающих гуа нилатциклазной активностью. Гуанилатциклаза кон вертирует GTP в cGMP, запускающий PKG (protein kinase G)-зависимый каскад реакций, включающий ERK-сигнальный путь пролиферации эндотелиоци тов. PKG также обеспечивает ингибирование киназы легких цепей миозина в мышечных клетках стенки сосудов, что приводит к снижению сшивок моле кул миозина, расслаблению гладкомышечных кле ток и вазодилатации[40, 41]. Последнее свойство объясняет действие оксида азота в качестве EDRF (endothelium-derived relaxing factor), того самого «неуловимого» короткоживущего фактора, вызывающего расслабление сосудов и открытого еще в 1980 году в лаборатории R. Furchgott[42].

Помимо расслабления гладкомышечных клеток оксид азота ингибирует пролиферацию гладкомы шечных клеток, агрегацию тромбоцитов и адгезию лейкоцитов к эндотелию[40].

Таким образом, VEGFR2-рецептор запускает сложный каскад внутриклеточных реакций, обеспе чивающих миграцию и пролиферацию эндотелиоци тов, их устойчивость к апоптотическим факторам, а также проницаемость стенки сосудов (рис. 5).

Уровень экспрессии рецепторов VEGFR1 и VEGFR2 на поверхности клеток

Рецептор VEGFR1 экспрессируется на поверхно сти эндотелиальных клеток кровеносных сосудов, гемопоэтических стволовых клеток[43] и клеток моноцитарно-макрофагального ряда[44].

Рецептор VEGFR2 экспрессируется не только эн дотелиоцитами, но и эндотелиальными прогениторными клетками. Низкий уровень экспрессии VEGFR2 обнаружен и в нейрональных клетках, остеобластах, клетках поджелудочной железы и мегакариоцитах, однако биологическое значение присутствия этого белка на неэндотелиальных клетках остается невыясненным[13].

Недавно были получены данные о различном уровне экспрессии рецепторов VEGFR1 и VEGFR2 в зависимости от клеточного типа и присутствия VEGF-A165[45, 46] (табл.).

На поверхности неэндотелиальных клеток количе ство VEGFR1 более чем в 50 раз превышает VEGFR2. Учитывая 10-кратное превышение аффинности фак тора VEGF к своему первому рецептору, становится очевидно, что VEGF в таких клетках практически не способен запустить VEGFR2-опосредованный каскад реакций.

В эндотелиальных клеточных культурах HUVEC, MEC (эндотелий сосудов микроциркуляторного рус ла), LEC (эндотелий лимфатических сосудов) коли чество VEGFR2 в несколько раз превышает VEGFR1, однако при повышении концентрации VEGF-A165 с 2пкМ до 1 нМ происходит дозозависимое изменение соотношений данных рецепторов[45].

На мышиной модели ишемии задних конечностей было показано, что на поверхности эндотелиальных клеток, выделенных ex vivo из скелетных мышц, увеличивается число рецепторов VEGFR1 и умень шается число VEGFR2. При этом изменения уровня экспрессии рецепторов происходят и в контрольной (неповрежденной) конечности, что говорит о наличии системного ответа[47].

Уровень экспрессии двух рецепторов на поверх ности эндотелиоцитов может варьировать и при фи зиологических условиях внутри одного вида. У двух линий мышей (BALB/c и C57BL/6), отличающихся по степени устойчивости к ишемии, разница в уровне экспрессии составляет около 20%[46]. Эти данные позволили авторам исследования выдвинуть пред положение о вариабельности количества и соотно шения рецепторов VEGFR1 и VEGFR2 внутри чело веческой популяции, объясняющей индивидуальные различия в способности к восстановлению ишемизированной ткани[47].

Заключение

Тонкая регуляция действия основного проангио генного фактора роста VEGF-A165 как в пренаталь ном, так и в постнатальном периоде начинается еще на уровне связывания белка с рецепторами VEGFR1 и VEGFR2. VEGFR2 запускает внутриклеточные каскады, обеспечивающие выживаемость, пролиферацию и миграцию эндотелиоцитов, привлечение прогениторных клеток, формирование и созревание новых кровеносных сосудов. VEGFR1 же является основным регулятором активности VEGF-A165, предотвращая чрезмерный ангиогенный ответ за счет следующих механизмов:

1) изменение соотношения рецепторов VEGFR1/ VEGFR2 на поверхности клеток в присутствии VEGF-A165;

2) конкурентное связывание VEGF-A165 (аффин ность фактора роста к VEGFR1 в 10 раз больше, чем к VEGFR2);

3) высвобождение конкурентных изоформ VEGF-A113, которые связываются с VEGFR2, но не узнаются корецептором NRP-1, отвечающим за ста бильность комплекса «лиганд-рецептор»; 4) активация ангиостатина, ингибирующего эф фект VEGF-A165.

Более того, с помощью математического моде лирования было показано, что от 10 до 50% всех активных рецепторов могут составлять гетеродиме ры VEGFR1/VEGFR2, что может обеспечивать еще более точный контроль трансдукции сигнала VEGF[48].

Таким образом, система взаимодействий VEGF-A165 с рецепторами VEGFR1 и VEGFR2 явля ется одной из ключевых в ангиогенезе. Сдвиг рав новесия в сторону одного из компонентов системы «лиганд-рецепторы» может существенно повысить эффективность про- или анти-ангиогенной терапии.

Подняться вверх сайта