Поиск Кабинет

Роль аутогенных мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток в тканеинженерных конструкциях на основе натуральных кораллов и синтетических биоматериалов при замещении костных дефектов у животных

Гены & Клетки: Том IV, №4, 2009 год, стр.: 56-64

 

Авторы

Сергеева Н.С., Франк Г.А., Свиридова И.К., Кирсанова В.А., Ахмедова С.А., Антохин А.И.

ДЛЯ ТОГО ЧТОБЫ СКАЧАТЬ СТАТЬЮ В ФОРМАТЕ PDF ВАМ НЕОБХОДИМО АВТОРИЗОВАТЬСЯ, ЛИБО ЗАРЕГИСТРИРОВАТЬСЯ

Цель исследования — анализ механизмов остеогенеза при замещении костных дефектов у лабораторных животных искусственными и натуральными биоматериалами самостоятельно и в составе тканеинженерных конструкций (ТИК) с аутогенными мультипотентными мезенхимальными стромальными клетками (ММСЮ.

В работе использовали гранулированные (у крыс) и цельные (у баранов) синтетические биоматериалы: пористую биокерамику на основе карбонатгидроксиапатита (КГА), биокомпозит — высокопористый матрикс из среднемолекулярного хитозана, армированный гранулами КГА, и натуральный коралл (НК) сем. Асгорога. Создавали дефекты: ограниченный — остеотомия голени крысы и критический — сегментарная резекция бедренной кости барана. Для получения ТИК аутогенные ММСК животных (II—IV пассаж) переносили на образцы материалов и культивировали в течение 7—10 (крысы) и 14— 21 (бараны) сут. Оперативные вмешательства проводили под общей анестезией. В стандартные сроки животных выводили из эксперимента, область дефекта с окружающими тканями фиксировали и декальцинировали. Гистологические срезы окрашивали гематоксилином и эозином и проводили световую микроскопию.

Закрытие костного дефекта у животных при имплантации перечисленных материалов происходит путем периостального остеогенеза и завершается в сроки 6—12 мес. Компактная костная ткань у крыс образуется уже через 9 нед. после операции. У барана через В мес. вещество НК замещается компактной костной тканью с формированием органотипических структур (остеонов). Использование ТИК с аутоММСК значительно ускоряет процессы репаративной регенерации за счет активации, помимо периостального, — энхондрального механизма остеогенеза.

Использование ТИК с аутогенными ММСК на основе искусственных керамических, композиционных и натуральных материалов в гранулированной форме или в виде цельных имплантатов существенно сокращает сроки замещения костных дефектов за счет того, что дополнительно к периостальному включается энхондральный остеогенез, что приводит к образованию костной ткани de novo по всему объему дефекта и в итоге — органотипическому замещению дефекта.

Для замещения дефектов костной ткани (возникающих при травмах и, в частности, при реконструктивно-пластических операциях в онкологии) традиционно используют: а) керамические материалы (близкие по составу к минеральной составляющей костной ткани), основным недостатком которых является низкая скорость биорезорбции; б) специально обработанные трупные кости, что не исключает, во-первых, переноса реципиенту невыявленных инфекционных агентов, а, во-вторых, отторжения; в) сплавы на основе титана, которые ограниченно биосовместимы и не консолидируются с костной тканью реципиента; г) аутоимплантаты («золотой стандарт»), что сопряжено с дополнительным оперативным вмешательством и невозможно при крупных дефектах [1-6].

Одним из направлений для совершенствования технологий замещения костных дефектов (в т. ч. больше критических) является создание тканеинженерных конструкций (ТИК) на основе «подходящих» материалов и мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК). «Подходящими» в данном контексте мы считаем материалы, близкие по составу к минеральной и/или органической составляющей внеклеточного матрикса костной ткани, биосовместимые, пористые (для обеспечения потоков питательных веществ и заселения клетками), с развитой поверхностью (для активной экспансии клетками), обладающие остеоиндуктивными и (или) ос-теокондуктивными свойствами. В идеале такие функционально-ориентированные материалы и ТИК (с аутогенными ММСК) на их основе должны обеспечивать не только поддержание и выполнение объема костного дефекта, но и органотипическое восстановление костной ткани [7—11 ].

Ранее нами были представлены результаты исследования спектра искусственных биокерамических материалов и скелета натуральных кораллов (НК) сем. Асгорога и ТИК на их основе (с аутогенными ММСК) для замещения костных дефектов (в т. ч. больше критических) у мелких (крысы) и крупных (бараны) лабораторных животных [12—15]. В этих работах было показано, что использованные керамические материалы (гидро-ксиапатит — ГА, карбонатгидроксиапатит — КГА, их комбинации в разных соотношениях, а также БЮ2-ГА) обладают недостаточной скоростью биорезорбции, в результате чего через год их остатки в месте дефекта оказываются замурованными в костную ткань, что, безусловно, снижает ее прочностные свойства. В то же время скорость биорезорбции НК сем. Асгорога (при использовании как в гранулированном виде у крыс, так и в виде цельного имплантата у барана) соответствовала скорости неоостеогенеза. При использовании ТИК на основе всех этих материалов (с аутогенными ММСК) остеогенез (как по рентгенограммам, так и по гистологическим препаратам) происходил как минимум в 2 раза быстрее, чем при заполнении дефектов «чистыми» материалами [14, 15]. Однако, какие процессы обеспечивали это ускорение, оставалось неясным.

Целью настоящего исследования являлся анализ различий в механизмах остеогенеза при замещении костных дефектов у лабораторных животных искусственными и натуральными материалами самостоятельно и в составе ТИК с аутогенными ММСК.

Материал и методы

Для заполнения костных дефектов у животных использовали биоматериалы, разработанные в ИМЕТ им. А.А. Байкова РАН: карбонатгидроксиапатитовую (КГА) биокерамику с содержанием карбонат-групп 5,9 масс.%, биокомпозит — высокопористый матрикс на основе среднемолекулярного хитозана, армированный гранулами КГА, а также материал природного происхождения — НК сем. Асгорога.

Эксперименты по замещению костных дефектов у животных были выполнены на крысах (модель — остеотомия голени с использованием всех вышеперечисленных материалов в гранулированном виде) и на баранах (модель — сегментарная резекция бедренной кости барана, материал — цельный имплантат из НК).

КГА порошки были синтезированы методом осаждения из водных растворов [16]. Для получения гранулированных пористых матриксов в ИМЕТ РАН была разработана оригинальная технология [17—19]. Образцы КГА биокерамики были представлены в виде пористых гранул величиной 3004300 мкм (размер пор — 10—50 мкм) с удельной поверхностью 0,3243,58 м2/г. Перед началом экспериментов образцы биоматериалов стерилизовали в сухожаровом шкафу (160°С, 2 ч). Для синтеза пористых композиционных материалов использовали среднемолекулярный кислоторастворимый хитозан (50^ 190 кДа) и нанопорошки КГА. В ИМЕТ РАН была разработана методика для получения из этих составляющих армированных пеноструктур с пористостью до 90% [20, 21]. Перед экспериментами образцы биокомпозитов измельчали на фрагменты размером до 5,0 мм3 и далее стерилизовали у-облучением в дозе 25кГр.

Для операций на крысах очищенные от мелких органических остатков ветви НК подвергали механическому измельчению на планетарной шаровой мельнице РМ 200, задав размер частиц 3004300 мкм. Для оперативных вмешательств на баранах из цельного НК изготавливали индивидуальные имплантаты по разработанной (см. ниже) методике. Далее НК тщательно промывали, высушивали в сухожаровом шкафу (температура 50430°С, ММСК крыс выделяли из костного мозга лопаток и подвздошных костей половозрелых животных, ММСК для каждого барана выделяли из биоптатов костного мозга, полученных при трипанобиопсии крыла подвздошной кости. Далее получали первичную культуру ММСК и осуществляли перепассирование ее в пассажах (до IV) для увеличения клеточной массы.

Для получения ТИК, имплантируемых крысам, культуру ММСК II-IV пассажей переносили на опытные образцы материалов в плотности 200 тыс. кл./см2 и далее культивировали на протяжении 7^10 сут. Для получения ТИК для барана использовали культуру аутогенных ММСК в той же посевной плотности. НК имплантат с суспензией ММСК помещали на 4 часа в роллерную установку (4 об./мин., 37°С) для равномерной иммобилизации клеток по поверхности матрикса. Дальнейшее культивирование производили стационарно, на протяжении 14—21 сут. К концу префабрикации происходила активная экспансия культурой ММСК барана пористых ЗО-матриксов (рис. 1).

Все оперативные вмешательства на животных осуществляли под общей анестезией. Так, крысам (половозрелые самки линии Wistar) для проведения остеотомии голени проводили предварительную седацию 0,25% раствором дроперидола (0,5 мл внутрибрюшинно), затем вводили 5% раствор кетамина (0,25 мл внутримышечно). Далее, в положении животного на спине, по внутренней медиальной поверхности голени, отступя от коленного сустава приблизительно на 8 мм, производили кожный разрез протяженностью 2—2,5 см. Кожу отсепаровывали, производили мобилизацию мышц голени отведением их в сторону и обнажали большеберцовую кость. Кость очищали от надкостницы. Затем на границе верхней и средней трети кости посредством бора формировали плоскостной «окончатый» дефект длиной 6^8 мм, шириной 1,5—2 мм и глубиной 2,5^3 мм с проникновением в костномозговой канал. В область дефекта закладывали стерильные биоматериалы в соответствии с протоколом исследования — «чистые» или в составе ТИК (насыщенные культурой ММСК).

Всего было сформировано 6 групп животных по 18 голов в каждой: 1-я, 2-я и 3-я опытные группы — для исследования остеозамещающих потенций КГА-биоке-рамики, биокомпозита (хитозан, армированный гранулами КГА) и НК, соответственно; 4-я, 5-я, и 6-я опытные группы — для оценки остеозамещающих свойств этих же биоматериалов в составе ТИК.

В сроки 3, 6, 9, 12 нед., 6^12 мес. по 3 животных каждой группы выводили из эксперимента. Область дефекта с окружающими тканями выпиливали, фиксировали в 10% формалине и далее подвергали декальцинации в 0,ЗМ растворе ЗДТА по общепринятой методике [22]. Гистологические срезы окрашивали гематоксилином и эозином и проводили световую микроскопию.

У баранов перед оперативным вмешательством по рентгенограммам производили замер бедренной кости для изготовления индивидуального имплантата из НК, соответствующего планируемому дефекту. Кроме того, оценивали и величину пластин, необходимых для накостного остеосинтеза (LCP, Synthes), с целью фиксации имплантата между опилами кости.

Коралловый имплантат представлял собой цилиндр с выступами для фиксации в костномозговом канале (рис. 2). Для молодого половозрелого барана (10— 12 мес.) подготовленный имплантат в среднем имел следующие размеры: высота цилиндра 2,0 см радиус — 0,88 см, высота выступов 1,4 см, а радиус — 0,68 см. После проведения этапа сегментарной резекции бедренной кости, подготовленные имплантаты фиксировали выступами в костномозговом канале в зоне дефекта и при помощи пластины для накостного остеосинтеза закрепляли между костными фрагментами (рис. 3).

Всем баранам осуществляли рентгенологический контроль в динамике: сразу после завершения операции и через 1, 4 и 6 мес. Все оперативные вмешательства и динамическое рентгенологическое обследование баранов осуществляли под общей анестезией (премедика-ция: супрастин — 2,0 мл, преднизолон — 2,0 мл, церу-кал — 1,0 мл, сульфокамфокаин — 2,0 мл; анестезия: кетамин — 20,0 мл 5% раствора и 180,0 мл физиологического раствора). В данной серии экспериментов было сформировано две группы животных (по 2 барана в каждой): контроль — закрытие сегментарного дефекта НК имплантатом без клеток, опыт — использование ТИК (аутогенные ММСК барана, префабрикованные на НК имплантате). В фиксированный срок осуществляли забой животного, производили распил бедренной кости на фрагменты, фиксацию материала и декальцинацию с последующим гистологическим исследованием.

Все манипуляции с животными были выполнены со строгим соблюдением «Правил проведения работ с использованием экспериментальных животных» (Приложение к приказу Минздрава СССР № 755 «О мерах по дальнейшему совершенствованию организационных форм работы с использованием лабораторных животных», 12 августа 1977 г.).

Результаты

Репаративная регенерация костной ткани (например, при переломах) происходит за счет внутреннего слоя надкостницы, содержащего ММСК (периостальный остеогенез). Надкостница при этом гипертрофируется, а часть ММСК начинает дифференцироваться в направлении остеобластов, которые формируют вокруг себя межклеточное вещество костной ткани, постепенно «замуровываясь» в нем. Этот процесс на гистологическом уровне сравнительно хорошо изучен и описан во многих учебниках. Его механизмы и особенности описаны в недавно вышедшей монографии Ю.И. Денисова-Никольского и соавт. [23].

Сходные с описанными процессы мы наблюдали на разных сроках после заполнения окончатых (у крыс) и сегментарных (у баранов) дефектов разнообразными по составу и происхождению (КГА, хитозан, армированный КГА, НК сем. Асгорога) материалами. Через 3 нед. после травмы (рис. 4) наблюдается гипертрофия надкостницы, новообразованные костные трабекулы, берущие начало от нее, «языками» вдаются в зону дефекта, а по краям формирующихся костномозговых лакун становятся видны цепочки остеобластов, образующие вокруг себя межклеточное костное вещество. Описанные выше процессы со временем нарастают, что отчетливо видно в месте дефекта (заполненного хитозаном, армированным КГА) через 6 нед. после операции (рис. 5): гипертрофия надкостницы, цепочки остеобластов, внеклеточный костный матрикс с замурованными в него остеоцитами. Кроме того, очевидна тенденция образования балок губчатого вещества кости.

Через 9 нед. после заполнения дефекта материалом с наименьшей (из 3-х представленных) скоростью биорезорбции — КГА (рис. 6А) видны замурованные в костную ткань остатки гранул и сформированные очаги гемопоэза. При использовании для заполнения дефекта материала с большей скоростью резорбции (хитозан, армированный КГА) на месте дефекта сформировалась компактная костная ткань (рис. 6Б). На более поздних сроках — 13 нед., 6 мес., 1 год — описанные процессы постепенно завершаются: остатки гранул КГА на периферии дефекта окружены волокнистой надкостницей, а глубже — компактной костной тканью (рис. 7). В случае использования в качестве остеозамещающего материала скелета НК, через 6 мес. на месте дефекта можно найти как начало формирования остеонов с остатками коралла между ними (рис. 7В), так и очаги незавершенного остеогенеза (рис.7Г).

Таким образом, при заполнении окончатого (у крыс) и сегментарного (у баранов) костных дефектов искусственными керамическими (КГА), композиционными (хитозан-КГА) и натуральными (НК сем. Асгорога) материалами замещение дефекта происходит путем периостального остеогенеза, причем в случае кораллов наблюдается тенденция к формированию органотипических структур (остеонов).

Несколько иная картина наблюдалась при использовании для заполнения дефекта этих же материалов в составе ТИК с аутогенными ММСК. Уже через 3 нед. после операции (рис. 8) на месте дефекта наблюдается активное формирование как губчатой кости с очагами гемопоэза, так и компактной костной ткани. Причем, при использовании ТИК на базе всех 3-х материалов, наряду с областями активного периостального остеогенеза, наблюдается и выраженный энхондральный остеогенез (см. рис. 8). Хондроциты при этом образуют либо изогенные группы, либо пласты, либо колоновидные структуры. Сочетание 2-х типов остеогенеза в пределах одного поля зрения удалось найти в модели замещения сегментарного дефекта бедренной кости у барана монолитной ТИК на основе скелета НК (см. рис. 8Д): участок надкостницы, формирующийся очаг гемопоэза с цепочкой остеобластов по периферии, окруженный ос-теоидом с остеоцитами, пласты хондроцитов с формирующимся вокруг них внеклеточным костным матриксом.

В более поздние сроки (6—14 нед., 1 год) в разных полях зрения при использовании ТИК на основе всех 3 материалов, наряду с участками формирования губчатой кости (в случае КГА — с остатками гранул) и очагами гемопоэза, наблюдаются вкрапления или целые области хрящевой ткани, постепенно замещающейся костной (рис. 9).

Дополнительным аргументом в пользу того, что в случае использования в качестве имплантатов не «чистых» материалов, а ТИК с ММСК на их основе, костеобразование идет по всему объему дефекта (за счет активации энхондрального остеогенеза), а не только со стороны надкостницы (за счет периостального остеогенеза), является остеогенез у барана через 4 мес. после замещения сегментарного дефекта бедренной кости ТИК на основе скелета коралла. При полной декальцинации (рис. 10А) видно, что формирование остеонов идет по всей толще дефекта, а при неполной — видны остатки вещества кораллового имплантата (рис. 10Б), большая часть которого уже, вероятно, использована для минерализации вновь сформированной кости.

В целом, активация в ТИК энхондрального остеогенеза приводит к сравнительно быстрому закрытию костных дефектов (в том числе превышающих критические) зрелой и органотипически сформированной костью: с развитой, хорошо васкуляризированной надкостницей, наличием слоя компактной костной ткани по периферии и губчатой костной ткани в центре с очагами гемопоэза (рис. 11).

Заключение

При заполнении костных дефектов, в том числе превышающих критические, у мелких и крупных лабораторных животных искусственными керамическими (КГА), биокомпозиционными высокопористыми матриксами (хи-тозан, армированный гранулами КГА) или натуральными (скелет кораллов сем. Асгорога), гранулированными или монолитными имплантатами происходит активация периостального остеогенеза, что приводит к постепенному замещению дефекта костной тканью. При использовании тканеинженерных конструкций на основе указанных материалов и аутологичных ММСК (в этих же условиях) скорость замещения дефекта костной тканью существенно возрастает за счет того, что к периостальному остеогенезу добавляется энхондральный — по всему объему дефекта.

Авторский коллектив выражает благодарность проф. С.М. Баринову и сотрудникам его лаборатории (Учреждение ИМЕЕТ РАН) за предоставленные для исследований материалы.

Подняться вверх сайта