Поиск Кабинет

РНКаза с противоопухолевым действием (биназа) вызывает изменение клеточной проницаемости

Гены & Клетки: Том VII, №3, 2012 год, стр.: 72-76

 

Авторы

Кабрера-Фуентес Э.А., Зеленихин П.В., Колпаков А.И., Ильинская О.Н.

ДЛЯ ТОГО ЧТОБЫ СКАЧАТЬ СТАТЬЮ В ФОРМАТЕ PDF ВАМ НЕОБХОДИМО АВТОРИЗОВАТЬСЯ, ЛИБО ЗАРЕГИСТРИРОВАТЬСЯ

Ряд РНКаз, среди которых есть и микробные ферменты, обладает протовоопухолевым действием, механизм которого не ясен. В настоящей работе исследован начальный этап взаимодействия РНКаз с эукариотическими клетками, связанный с изменением их проницаемости для ионов и макромолекул.

На клеточных культурах карциномы легких А549, эмбриональной почки человека НЕK и дрожжах Candida с использованием анализа поглощения изотопа 45Са2+ либо флуоресцентного красителя Fura-2/АМ изучено влияние цитотоксичной РНКазы Bacillus intermedius (биназы) на накопление внутриклеточного кальция. Изменение проницаемости клеток А549, обработанных биназой, проанализировано по проникновению меченого трипановым синим альбумина через клеточный монослой. Выживаемость клеток А549 оценена по активности митохондриальных дегидрогеназ, восстанавливающих производные тетразолия, стабильность мембран эритроцитов оценена по выходу гемоглобина при осмотическом шоке.

Установлено, что биназа увеличивает проницаемость клеток высших и низших эукариот для ионов кальция. Клетки А549 под действием биназы также усиливают проницаемость для макромолекул. Обработка биназой защищает эритроциты от осмотического шока.

Следующее за увеличением проницаемости протекторное либо цитотоксическое действие биназы реализуется в зависимости от типа клеток, где ключевую роль играет экспрессия КСa каналов и определенных онкогенов, в частности, онкогенов семейства ras. Полученные данные подтверждают принципиальную важность увеличения клеточной проницаемости как первичного этапа в механизме проявления биологических эффектов биназы.

Биологические функции рибонуклеаз (РНКаз), связанные с регуляцией экспрессии генов, роста и развития клеток, защитой от патогенов и индукцией апоптоза, привлекают пристальное внимание исследователей. РНКазы семенников быка (BS-РНКаза), овоцитов лягушки Rana pipiens (онконаза), бактерий Streptomyces aureofaciens (РНКаза Sa3), Bacillus intermedius (биназа) рассматривают как перспективные агенты альтернативной химиотерапии злокачественных новообразований [1–5]. Целенаправленный поиск терапевтически значимых ферментов среди РНКаз млекопитающих не всегда тактически оправдан в связи с эволюционно сформировавшейся системой защиты клетки млекопитающих от излишней активности собственных РНКаз, опосредованной действием специфического цитозольного их ингибитора [3]. В связи с этим, особый интерес вызывают РНКазы, филогенетически далекие от своих аналогов у млекопитающих, такие как РНКазы амфибий, грибов и микроорганизмов, нечувствительные к действию ингибитора РНКаз млекопитающих [5]. Нами ранее показано, что селективность действия РНКаз по отношению к опухолевым клеткам определяется молекулярными характеристиками фермента, прежде всего катионностью [6, 7], а также экспрессионным профилем неопластической клетки, где маркерной для проявления избирательной цитотоксичности является экспрессия онкогенов ras, kit и AML-ETO [6, 8–10]. Вероятно, продукты гидролиза клеточной РНК могут принимать участие в процессе РНК-интерференции [11, 12], подавляя экспрессию маркерных онкогенов. Однако механизмы цитотоксического действия РНКаз до конца не ясны. Особенно мало сведений о первом этапе взаимодействия экзогенных РНКаз с опухолевой клеткой. Для BS-РНКазы зафиксированы адсорбция и последующая интернализация фермента как нормальными, так и малигнизированными клетками щитовидной железы и фибробластами [13]. Для РНКазы-3 (катионный белок эозинофилов, ECP) установлено, что агрегация фермента на клеточной мембране индуцирует апоптоз без проникновения фермента внутрь клеток миелогенного лейкоза HL-60 и аденокарциномы HeLa [14]. Методом иммунофлуоресценции нами выявлено цитотоксическое действие биназы без ее интернализации пневмоцитами опухолевой линии MLE-12 [15]. В связи с вышеизложенным целью настоящей работы стало выявление функциональных изменений клеточной поверхности, а именно проницаемости клеток для ионов и макромолекул под действием биназы.

Материал и методы

Фермент. В работе использована биназа, гуанилспецифичная РНКаза Bacillus intermedius 7Р дикого типа (EC 3.1.27.3, молекулярная масса 12.3 кДа, 109 аминокислотных остатков, pI = 9.5) [16]. Каталитическая активность биназы охарактеризована ранее по отношению к синтетическим субстратам [17] и высокополимерной дрожжевой РНК [18]. Современный метод выделения и очистки биназы основан на ее изоляции как гомогенного белка из культуральной жидкости рекомбинантного штамма Escherichia coli BL21, несущей плазмиду pGEMGX1/ent/Bi [16]. Высокая степень очистки биназы подтверждена электрофоретически (рис. 1).

Клетки. Клетки аденокарциномы легких (А549) и эмбриональной почки человека (НЕК293) из коллекции клеточных культур США (АССС, CCL-185 и CRL-1573, соответственно) поддерживали при 37°С на стандартной среде DMEM (Invitrogen, США) с добавлением пенициллина/стрептомицина (по 100ед.) и 10% телячьей сыворотки в атмосфере 5% СО2. Клетки засевали с плотностью 5–10 тыс./мл, выращивали до образования монослоя и заменяли среду на аналогичную, содержащую концентрации биназы до 300 мкг/мл. После роста в течение 24–72 ч проводили анализ цитотоксичности фермента и содержания внутриклеточного кальция. Для оценки динамики накопления кальция использовали модельные эукариотические клетки дрожжей Candida tropicalis, выращенные на среде Сабуро до плотности 107 кл/мл.

Выживаемость клеток. Цитотоксичность биназы определяли с использованием теста, основанного на ингибировании пролиферации клеток, измеренной по активности митохондриальных дегидрогеназ, восстанавливающих производные тетразолия [8].Клетки инкубировали с реагентом WST-1 (Roche Diagnostics, Mannheim, Германия) в течение часа и измеряли поглощение культуральной жидкости обработанных и необработанных биназой клеток при 450 нм на планшетном ридере MRX ELISA (SLT Labinstruments, Crailsheim, Германия).

Гемолитический тест. Для анализа влияния биназы на стабильность клеточных мембран использовали эритроциты, полученные из дефибринированной крови барана. Суспензию отмытых бараньих эритроцитов в изотоническом растворе (на 1 л воды: 100 мл солевого буфера TBS, 500 мл 1М MgCl2, 150 мл 1М CaСl2, 1 г желатины, рН 7,4) лизировали 10-кратным разбавлением дистиллятом и сопоставляли стабильность эритроцитов, предварительно обработанных биназой в течение 20 мин, с таковой без обработки. Выход гемоглобина фиксировали спектрофотоме- трически при 412 нм.

Уровень внутриклеточного кальция. Содержание Са2+ анализировали радиометрически, с использованием изотопа 45Са2+, либо флуоресцентного красителя Fura-2/АМ (Calbiochem-Novabiochem, США) с последующей обработкой данных, визуализированных на инвертированном микроскопе Leica DM IRB с системой VisiChrome imaging (Visitron, Германия), в программе Metaflouor imading software. В первом случае к суспензии дрожжей (108 кл/мл), обработанных биназой в течение 5 мин, добавляли 45Са2+, инкубировали 10 мин и фильтровали (Synpor, диаметр 0,2–0,4 мкм) под давлением. Фильтры дважды промывали средой с LaCl3 (1,5 мМ), высушивали и помещали в сцинтилляционную жидкость ЖС-8. Радиоактивность определяли на счетчике Delta-300 (США), количество поглощенного кальция выражали в нмоль/108 кл. Второй вариант метода включал обработку клеток 5 мкм Fura-2/АМ в растворе (в мМ: 140 NaCl, 3 KCl, 2 MgCl2, 2CaCl2, 10 glucose, 10 HEPES; pH 7,4) в течение 30 мин, отмывку раствором и инкубацию (37°С, 10 мин) перед микроскопией [11].

Проницаемость клеток для макромолекул. Проницаемость эпителиальных клеток А549 исследовали в камере, разделенной на два компартмента проницаемым мембранным фильтром [19]. Клетки А549 были предварительно выращены на данном фильтре до монослоя и перенесены в камеру, оба компартмента которой содержали среду DMEM. После 20 мин инкубации для установления начального равновесия в условно внутренний «полостной» компартмент, содержащий монослой, был добавлен меченый трипановым синим альбумин (60 мкМ). За его концентрацией во внешнем, «внеполостном» компартменте следили по поглощению при 480 нм (Specord 10, Carl Zeiss, Германия). Поток альбумина через поверхность монослоя выражали в моль/(с×см2), проницаемость представляли как коэффициент (в см/c), рассчитанный с учетом разницы концентраций альбумина в двух компартментах [19]. Для оценки влияния биназы на проницаемость клеток А549 последние выращивали с биназой в диапазоне концентраций 1–100 мкг/мл в течение 24 ч, а затем переносили в камеру.

Статистическая обработка результатов, полученных из трехкратных повторностей каждого эксперимента, проводилась стандартными методами в программе Microsoft Excel 2007 с использованием t-критерия Стьюдента (при уровне статистической значимости р < 0,05).

Результаты

Выживаемость клеток А549 под действием биназы. Анализ цитотоксичности биназы показал, что фермент снижает выживаемость клеток карциномы легких А549 пропорционально увеличению его концентрации. За 24 ч роста с биназой угнетение роста клеток не превышало 30%, однако за 48 ч. такое снижение выживаемость достигало 60% при максимальной из использованных концентраций биназы (300 мкг/мл) (рис. 2). Установленный факт усиления цитотоксического действия фермента при замене среды культивирования на новую, не содержащую биназу, после 24 ч роста в ее присутствии свидетельствует о том, что необратимые изменения клеток, приводящие в дальнейшем к их гибели, фермент наносит в первые часы своего воздействия на клетки.

Гемолиз эритроцитов, обработанных биназой. Характер влияния биназы на стабильность мембраны эритроцитов был исследован нами в классическом тесте на гемолиз эритроцитов барана. Поскольку высокие концентрации биназы цитотоксичны, для обработки последних была выбрана концентрация 1мкг/мл. При непосредственном ее воздействии на эритроциты гемолиза не наблюдали (рис. 3). Более того, оказалось, что микроконцентрации фермента стабилизируют мембраны эритроцитов, и выход гемоглобина из обработанных биназой клеток в 2 раза меньше, чем из необработанных. Аналогично была испытана РНКаза-1 человека (коммерческий препарат Invitrogen Life Technologies, США), которая обладала сходным эффектом, однако меньшей величины: снижение интенсивности гемолиза у обработанных РНКазой-1 эритроцитов не превышало 25%.

Уровень внутриклеточного Са2+ при действии биназы на клетки НЕК и клетки дрожжей. Установлено, что повышение уровня кальция в клетках НЕК происходит в части клеток популяции, причем только спустя 36 ч воздействия биназы. На более ранних этапах так же, как и в необработанных биназой клетках, обнаруживали лишь единичные клетки с повышенной концентрацией кальция (рис. 4). В дрожжевых клетках, напротив, зафиксировано кратковременное повышение содержания Са2+, которое после 40 мин воздействия биназы возвращается к исходному уровню (рис. 5).

Влияние биназы на проницаемость клеток А549 для белков. Выявлено, что рост клеток А549 с биназой в концентрациях до 100 мкг/мл не меняет проницаемость клеток для макромолекул. Обработка клеток биназой (100 мкг/мл) в течение 24 ч индуцирует увеличение проницаемости мембран эпителиальных клеток для альбумина, пик которой наблюдали на 6 час эксперимента. Хотя динамика изменений проницаемости клеток сходна с таковой для необработанных клеток, повышение величины проницаемости обработанных биназой клеток достигает 20% (рис. 6).

Обсуждение

Полученные экспериментальные данные свидетельствуют, что цитотоксическое действие биназы по отношению к опухолевым клеткам А549 проявляется в концентрациях свыше 100 мкг/мл, причем необратимые изменения происходят в первые часы роста клеток с биназой, поскольку смена среды спустя 24 ч на среду без фермента не приводит к восстановлению уровня выживаемости клеток (см. рис. 2). Ранее нами было показано, что клетки НЕК также подвержены цитотоксическому действию биназы [11], в отличие от клеток дрожжей [20]. Различия в чувствительности клеток низших и высших эукариот выявлены и в динамике накопления внутриклеточного Са2+: кратковременная обработка дрожжей биназой увеличивает накопление радиоактивного Са2+ уже после 20 мин. его внесения в инкубационную смесь (см. рис. 5), тогда как в клетках НЕК повышение содержания Са2+ выявлено лишь спустя 36 ч действия фермента (см. рис. 4). Несмотря на различное время действия РНКазы, она вызывает увеличение проницаемости для кальция во всех эукариотических клетках. Более того, биназа за 24 ч обработки клеток А549 индуцирует повышение их проницаемости и для макромолекул (см. рис. 6), что отчасти может объяснить эффект усиления действия доксорубицина другой РНКазой – онконазой – при комплексной терапии мезотелиомы легких [21]. Активация биназой поступления в клетки Са2+ индуцирует работу калиевых Са2+-зависимых каналов, которая противостоит апоптическому действию биназы, как было показано нами ранее для клеток НЕК с искусственно внесенными генами КСa каналов (НЕКhSK4) [11, 22]. Клетки эпителия легких содержат КСa каналы [23], однако их выживаемость при 300 мкг/мл биназы составляет 40% (рис. 1), в отличие от клеток НЕК без этих каналов, выживаемость которых в аналогичных условиях 70% [11]. Вероятно, экспрессия в клетках А549 онкогенов семейства ras, в частности, K-ras [24] и H-ras [25], снижает антиапоптический эффект активации биназой КСa каналов и повышает чувствительность клеток к ее цитотоксическому действию. Эффект усиления поступления в клетку Са2+ биназой, вероятно, играет роль и в ее защите эритроцитов от лизиса (см. рис. 3), поскольку эритроциты также содержат КСa каналы [26], выход ионов К+ через которые увеличивает осмотическую силу раствора. Отметим, что РНКаза-1 человека также обладает протекторным действием, однако его величина вдвое меньше по сравнению с биназой, что связано с вероятностью ингибирования РНКазы-1 цитозольным ингибитором.

Таким образом, биназа увеличивает проницаемость эукариотических клеток для ионов кальция, которая по времени у дрожжей происходит в течение минут, а для клеток НЕК в течение нескольких часов. Клетки карциномы легких человека А549 под действием биназы также усиливают проницаемость для макромолекул. Итоговое протекторное либо цитотоксическое действие биназы реализуется в зависимости от типа клеток, где ключевую роль играет экспрессия КСa каналов и определенных онкогенов, в частности, онкогенов семейства ras.

Подняться вверх сайта