Поиск Кабинет

Регуляция развития постнатальных стволовых клеток костного мозга ксеногенными иммунными глобулинами направленного действия

Гены & Клетки: Том VI, №4, 2011 год, стр.: 34-38

 

Авторы

Селиванов Е.А., Ругаль В.И.

ДЛЯ ТОГО ЧТОБЫ СКАЧАТЬ СТАТЬЮ В ФОРМАТЕ PDF ВАМ НЕОБХОДИМО АВТОРИЗОВАТЬСЯ, ЛИБО ЗАРЕГИСТРИРОВАТЬСЯ

Показана возможность стимуляции развития стволовых кроветворных клеток ксеногенными иммунными глобулинами, направленно действующими на CD34+ стволовые клетки. Эффективность подтверждена в экспериментальных исследованиях на животных с цитостатистической гемоиммунодепрессией и при культивировании in vitro CD34+ стволовых кроветворных клеток человека. Животные, получавшие специфические иммунные глобулины восстанавливали гемопоэз и иммунитет к 30 сут. наблюдения, в контрольной группе регенерация гемолимфопоэза происходила по истечении 60 сут. In vitro более, чем на 30% увеличивалась колониеобразующая способность стволовых кроветворных клеток при добавлении в среду антител к CD34+ стволовым клеткам. Наши предварительные данные свидетельствуют о способности ксеногенных антител к мультипотентным мезенхимальным стромальным клеткам стимулировать их дифференцировку в остеобласты и эндотелиоциты – ключевые клеточные элементы, формирующие нишу стволовых кроветворных клеток.

Клинические и экспериментальные данные исследований с использованием метода клеточной терапии постнатальными стволовыми клетками костного мозга гематологических [1, 2], сердечнососудистых [3–5], онкологических [6, 7], неврологических [8] заболеваний, а также травм и других патологических состояний [9, 10] свидетельствуют, в значительном числе случаев, о достижении положительного результата. Одновременно при этой же методике регистрируется большое количество отрицательных результатов, как при использовании аллогенных стволовых клеток, причем при отсутствии признаков иммунологического отторжения, так и при введении аутогенных стволовых клеток. В таких ситуациях основной причиной неудач клеточной трансплантации является недостаток или полное отсутствие факторов, регулирующих функциональное состояние стволовых клеток, в связи с чем становится невозможным выход клетки из состояния покоя и запуск генетически детерминированного пролиферативного и дифференцировочного потенциала. Одним из возможных путей устранения таких состояний является введение субстанций, регулирующих развитие стволовых кроветворных клеток костного мозга. Разработка таких препаратов весьма актуальна, учитывая то, какими быстрыми темпами нарастает использование клеточных технологий в терапии обширного спектра заболеваний. В Российском НИИ гематологии и трансфузиологии разработано и экспериментально апробировано средство для активации процессов пролиферации и дифференцировки CD34+ стволовых кроветворных клеток [11]. Указанное средство является ксеногенными иммунными глобулинами, направленно действующими на весь комплекс детерминант на поверхности и внутри гемопоэтических стволовых клеток, что приводит к их активации. На основании данных экспериментальных исследований на животных и изучения препарата в условиях культивирования CD34+ стволовых кроветворных клеток человека in vitro нами получены факты, свидетельствующие о способности антител к стволовым кроветворным клеткам стимулировать их пролиферацию и дифференцировку.

Несмотря на то, что материал культуральных исследований носит предварительный характер, его опубликование целесообразно. Исследования будут продолжены с целью получения данных необходимых для статистического анализа и оценки специфичности.

Материал и методы

Субстанция, регулирующая развитие стволовых кроветворных клеток, получена на основе ксеногенных иммуноглобулинов, выделенных из крови кроликов, иммунизированных CD34+ стволовыми клетками человека [11]. Препарат изучен в эксперименте на модели цитостатической гемо-иммунодепрессии. Эксперименты, выполнены на 70 крысах-самцах линии Вистар массой 160–200 г. Животных содержали при свободном доступе к воде и пище. Опытную и контрольную группы составили по 35 животных в каждой. В обеих группах гемо-иммунодепрессия вызывалась пятикратным, с интервалами в 24 ч, внутрибрюшинным введением циклофосфана в дозе 10 мг/кг, рубомицина 2 мм/кг, и преднизолона 2 мг/кг в 3 мл физиологического раствора. На следующие сутки после окончания введений гемоиммуннодепрессивных препаратов животным опытной группы внутрибрюшинно, трехкратно, также с интервалом в 24 ч, вводился препарат в дозе 0,1 мг/кг, в том же объеме физиологического раствора. Животным контрольной группы в те же сроки внутрибрюшинно, трехкратно вводился физиологический раствор. В статье приведены данные с использованием физиологического раствора, поскольку они не отличались от показателей животных, получавших иммуноглобулины не иммунизированных животных. Действие препарата оценивалось по показателям крови на 1, 7, 15, 24, 30 и 60-е сут. после завершения эксперимента. Пролиферативная активность CD34+ стволовых клеток изучена in vitro с использованием культуральной системы «агаровый квадрат». Цифровой материал обрабатывался методами непараметрической статистики с определением критерия «U» по Вилкоксон – Манн – Уитни.

Результаты и обсуждение

В экспериментальных исследованиях на животных эффективность влияния анти-CD34 иммуноглобулина на регенерацию костного мозга крыс с миелодепрессией, вызванной цитостатическими препаратами, анализировали по динамике восстановления показателей периферической крови. Результаты исследований представлены в таблице 1.

Введение цитостатических препаратов приводило к снижению показателей крови и иммунитета к моменту начала терапии в 3–6 раз, по сравнению с исходным уровнем. При этом животные обеих групп были способны восстанавливать их до нормальных величин. Однако процессы регенерации костного мозга с восстановлением показателей периферической крови протекали по-разному. Трехкратные внутрибрюшинные инъекции антиCD34+ иммуноглобулина способствовали ускорению этих процессов примерно в 2 раза, о чем свидетельствовало восстановление показателей крови животных опытной группы к 30-м сут., в то время как эти показатели у животных контрольной группы приходили к нормальным значениям только на 45–60-е сут.

Специфическая активность антител к CD34+ стволовым клеткам подтверждена в исследованиях in vitro. В таблице 2 представлены данные о колониеобразующей способности клеток-предшественниц костного мозга при их культивировании in vitro. Клетки-предшественницы гемопоэза больных острым лимфобластным лейкозом (наблюдение А), апластической анемией (наблюдение Б) и донора крови (наблюдение В) инкубировали в течение 14 дней в культуральной системе, с добавлением в кондиционную среду ксеногенных иммуноглобулинов. В контрольные образцы, в тех же дозах – иммуноглобулины неиммунных кроликов. Полученные результаты свидетельствуют о том, что антиCD34 иммуноглобулины в указанных концентрациях оказывают стимулирующее действие на пролиферативную активность стволовых кроветворных клеток костного мозга, увеличивая более чем на 30%, по сравнению с контролем, число выросших клеточных агрегатов. Такие же количества иммуноглобулинов неиммунных кроликов не влияли на рост стволовых гемопоэтических клеток. Предварительные данные свидетельствуют, что преинкубация с клетками человека приводит к угнетению активности субстанции.

Таким образом, представленные экспериментальные данные in vivo и in vitro свидетельствуют о возможности использования гликопротеинов направленного действия в качестве субстанции, регулирующей функциональные свойства стволовых клеток.

Как указывалось выше, стволовые клетки костного мозга человека используются в современной медицине при лечении многих заболеваний и патологических состояний. Эффект от трансплантации стволовых клеток дозозависим. Так, при трансплантации стволовых кроветворных клеток пуповинной крови минимальная эффективная доза для реципиента с массой тела не менее 10 кг составляет 5×108 клеток, а для реципиента с массой тела более 50 кг, она составляет 25×108 клеток и более [12]. Дозозависимость указанной процедуры вызывает необходимость получения большого количества стволовых клеток, а в случаях ограничения их количества, диктует необходимость использования искусственных регуляторных факторов, стимулирующих их пролиферативную активность в организме реципиента. В тех случаях, когда трансплантация стволовых клеток осуществляется в условиях нарушения регуляторной функции микроокружения, использование экзогенных регуляторов развития стволовых клеток является единственным способом, позволяющим активировать генетическую программу пролиферации и дифференцирования стволовых клеток. Одним из таких экзогенных регуляторов могут быть изученные нами ксеногенные поликлональные иммуноглобулины класса IgG с молекулярной массой 150 кД, содержащие 65–85% иммуноглобулина IgG1, 23–30% иммуноглобулина IgG2, 0,00001–8,0% иммуноглобулина IgG3 и 0,00001–4,0% иммуноглобулина IgG4, полученные как гуморальный иммунный ответ на поверхностные и внутриклеточные антигены CD34+ стволовых клеток.

Выработанные как результат гуморального иммунного ответа на весь комплекс антигенов стволовых клеток указанные гликопротеины целенаправленно стимулируют процессы жизнедеятельности стволовых клеток, в первую очередь, активируя синтез ДНК в ядрах стволовых клеток и, как следствие, вступление этих клеток в митотический цикл, что обеспечивает образование дополнительных родоначальных кроветворных клеток.

Учитывая дозозависимый эффект трансплантаций гемопоэтических стволовых клеток, использование иммуноглобулинов направленного действия может способствовать снижению количества вводимых стволовых клеток. Кроме того, использование антител может привести к положительному эффекту в тех случаях, когда в силу ряда причин не имеется необходимого для полноценной трансплантации количества стволовых клеток. В таких условиях, вследствие стимуляции пролиферативных процессов масса стволовых клеток под воздействием иммуноглобулинов будет увеличиваться, достигая объемов, обеспечивающих полноценную регенерацию гемопоэза. Таким образом, использование антиCD34+ антител с одной стороны может способствовать снижению минимальных эффективных доз водимых стволовых клеток, с другой – дает возможность проводить трансплантации в условиях ограниченного количества стволовых клеток.

Однако, по нашему мнению, использование иммуноглобулинов направленного действия приобретает исключительное значение в случаях трансплантации гемопоэтических стволовых клеток при функциональных нарушениях стромальных клеток костного мозга, формирующих нишу стволовых клеток. В таких ситуациях экзогенная стимуляция стволовых клеток является единственным способом запуска их генетической программы дальнейшего развития. При этом если учесть, что эти дефекты возникают у большинства больных с системными заболеваниями крови, а также, принимая во внимание то обстоятельство, что агрессивные методы предтрансплантационной подготовки в онкологии, гематологии и других дисциплинах, приводят к повреждению стромальной ниши, становится очевидной перспективность дальнейшей разработки и использования иммуноглобулинов направленного действия.

Как известно, длительное поддержание функционального состояния гемопоэтических стволовых клеток в фазе покоя и индукция их развития по пути различных линий гемолимфопоэза регулируется внешними сигналами от специфического стромального микроокружения костного мозга, обозначаемого эндостально-васкулярной нишей стволовых клеток [13–15]. Стромальные костномозговые клетки, коммитированные в остеогенном направлении, формируют эндостальную, остеобластную нишу, которая поддерживает ранние долгоживущие стволовые клетки, регулирует их выход из состояния покоя, определяет пролиферативный и дифференцировочный потенциал. Эндостальная ниша находится в тесной взаимосвязи с микрососудами, формирующими васкулярную нишу, которая поддерживает более зрелые стволовые клетки, способные к миграции и дифференцировке. Именно эти стромальные структуры повреждаются при вышеуказанных состояниях и процедурах. Это приводит к снижению или полному отсутствию индуцирующих сигналов ниши для развития стволовых клеток. При этом возможны два варианта развития событий. Первый – повреждения ниши обратимы и для восстановления функции ниши не требуются дополнительные факторы, кроме временных (самовосстановление, регенерация). В таких случаях экзогенная регуляция стволовых клеток поддерживает гемопоэз определенный период, который необходим для восстановления функциональных свойств ниши. Во втором случае – повреждения ниши могут быть значительными и период восстановления продолжительный. В таких ситуациях необходимо корригирующее вмешательство, вплоть до создания новых ниш. В настоящее время для этих целей используется трансплантация мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК). Как известно, последние являются источником развития клеточных элементов костного мозга, формирующих кроветворную нишу. Однако их применение сегодня затруднено, так как окончательно не решен ряд вопросов, регламентирующих их использование, в том числе – методы культивирования, тестирования направленности дифференцировки, безвредности и др., что зачастую делает их трансплантацию невозможной. В связи с этим, встает вопрос о стимуляции развития собственных ММСК реципиентов как альтернатива их пересадке. Одним из способов стимуляции может быть использование антител к ММСК. Нами были получены антитела к ММСК костного мозга и изучено влияние иммунных глобулинов на их развитие. Данные проведенных экспериментальных исследований указывают на возможность регуляции иммунными глобулинами направленного действия функциональных свойств ММСК, в частности, усиление их пролиферативной активности и способность формировать эндостальные остеогенные стромальные клетки и эндотелий микрососудов, то есть, структуры, образующие нишу кроветворных клеток [16,17].

Клеточные технологии в настоящее время интенсивно развиваются. Как считается, при этом активно разрабатываются два направления: 1 – клеточная терапия заболеваний и 2 – активация собственных (эндогенных) стволовых клеток с целью стимуляции восстановительных процессов [18]. На наш взгляд, ксеногенные иммуноглобулины направленного действия могут найти применение в решении обеих указанных проблем. Например, при трансплантации стволовых кроветворных клеток гематологическим больным совместное введение иммуноглобулинов и стволовых клеток позволит запускать пролиферативный и дифференцировочный потенциал вводимых клеток, что особенно важно, так как после супрессивной предтрансплантационной подготовки собственные регуляторные факторы не нарабатываются в достаточном объеме, в частности, в связи с повреждением стромального микроокружения – основного продуцента гуморальных регуляторов кроветворных стволовых клеток. Кроме того, сочетанное введение позволит уменьшить количество вводимых стволовых клеток сравнительно с традиционными объемами, используемыми в подобных ситуациях.

Также возможно самостоятельное введение иммуноглобулинов в случаях миелодепрессии, в основе которой лежит не дефект стволовых клеток, а имеется обусловленная различными причинами недостаточная продукция стимуляторов развития стволовых клеток. В указанных ситуациях введение антител направленного действия приводит к стимуляции процессов пролиферации и дифференцировки собственных, эндогенных стволовых кроветворных клеток.

В заключение следует отметить, что одним из актуальных направлений современной клеточной медицины становится создание препаратов, регулирующих развитие стволовых клеток в условиях повреждения органов и тканей. Особую значимость при этом приобретает разработка средств, способных выводить из покоящегося состояния эндогенные стволовые клетки, которые сохраняются в постнатальном периоде и ответственны за тканевую и органную регенерацию. Указанные препараты могут быть созданы на основе иммуноглобулинов направленного действия. Представленные результаты использования поликлональных антител в качестве регуляторов постнатальных стволовых клеток костного мозга не противоречат этому положению. Становится очевидным, что на основе антител направленного действия возможно создание препаратов, которые будут способны целенаправленно регулировать функциональный потенциал клеток-предшественниц практически всех органов и тканей организма.

Подняться вверх сайта