Поиск Кабинет

Регенерация мышечной ткани и активация миосателлитоцитов при аутотрансплантации стволовых клеток периферической крови пациентам с хроническими облитерирующими заболеваниями артерий нижних конечностей

Гены & Клетки: Том V, №4, 2010 год, стр.: 79-84

 

Авторы

Мавликеев М.О., Андреева Д.И., Газизов И.М., Гумерова АА, Йылмаз Т.С., Калигин М.С., Кундакчян Г.Г., Максимов А.В., Певнев Г.О., Плотников М.В., Табанакова А.В., Трондин А.А., Киясов А.П.

ДЛЯ ТОГО ЧТОБЫ СКАЧАТЬ СТАТЬЮ В ФОРМАТЕ PDF ВАМ НЕОБХОДИМО АВТОРИЗОВАТЬСЯ, ЛИБО ЗАРЕГИСТРИРОВАТЬСЯ

Целью нашего исследования было изучение эффективности терапии хронических облитерирующих заболеваний артерий нижних конечностей (ХОЗАНК) аутологичными стволовыми клетками периферической крови (СКПЮ и выявление лежащих в её основе морфофункциональных механизмов.

30 пациентам с ХОЗАНК была произведена внутримышечная аутотрансплантация СКПК. Производили морфометрический анализ парафиновых срезов биоптатов икроножной мышцы, полученных до начала клеточной терапии и через 3 мес. после трансплантации СКПК, окрашенных иммуногистохимически с антителами к маркерам эндотелия (CD31, CD34, фактор фон Виллебранда), и ми ore ни ну — маркеру активированных клеток-сателлитов. Определяли лодыжечноплечевой индекс (ЛПИ), выполняли стандартный тредмил-тест, тетраполярную реографию, дигитальную субтракцион-ную аортоартериографию.

Трансплантация СКПК приводит к увеличению плотности капиллярной сети на 25% (р < 0,001). Через 3 мес. после трансплантации мы наблюдали клетки-сателлиты с признаками поздних стадий дифференцировки, слияние миоса-теллитов с образованием мышечных трубочек и новых мышечных волокон.

Показатели ЛПИ увеличились на 12% (0,59±0,04 исходно и 0,ВВ±0,04 на сроке 3 мес., р=0,001). Увеличение дистанции безболевой ходьбы составило 26,5% восстановления ЛПИ при выполнении тредмил-теста на Аутотрансплантация СКПК ведет к улучшению васкуляри-зации ишемизированной конечности путем неоангиогенеза, а также активации миосателлитов и формированию новых мышечных волокон, что способствует восстановлению функции ишемизированной конечности.

Хронические облитерирующие заболевания артерий нижних конечностей (ХОЗАНК) являются одной из наиболее частых причин снижения качества жизни и инвалидизации трудоспособного населения. Проявления данной группы заболеваний выражаются в прогрессирующем уменьшении просвета артериальных сосудов, что приводит к ишемии мышечной ткани[1 ]. Общая распространенность заболеваний периферических артерий в России варьирует от 3 до 10% общей численности населения[2], во всем мире ХОЗАНК поражены 12^14% популяции, причем заболеваемость возрастает до 20% после 75 лет[3, 4]. Несмотря на прогресс ангиохирургии, существует группа пациентов, для которых возможности хирургических и эндоваскулярных методов коррекции магистрального кровотока ограничены из-за невозможности адекватной реконструкции дистального сосудистого русла. Этим определяется сохраняющийся интерес к непрямым методам реваскуляризации[5].

С 90-х годов прошлого века возможностям терапевтического неоангиогенеза посвящено большое количество работ. Для этой цели применяются факторы роста эндотелия сосудов (VEGF) и фибробластов (FGF), ангиогенин (Ang), генно-инженерные конструкции[6, 7]. Практически одновременно в литературе появились публикации об использовании стволовых клеток (СК) для стимуляции неоангиогенеза[8].

В настоящее время существуют экспериментальные работы, в которых показано достоверное увеличение плотности капиллярной сети и развитие кол-латералей в скелетной мышце после введения СК, полученных из различных источников, при её ишемии[9, 10, 11, 12]. К сожалению, клинических исследований, посвященных этой проблеме, мало, и большинство из них носит характер пилотных исследований[13, 14]. Данные работы не располагают достаточной статистической базой и ограничиваются оценкой клинических показателей[13, 15]. Таким образом, морфофункциональные основы терапевтического эффекта трансплантации СК при ХОЗАНК остаются неизученными, а ее эффективность не доказана на клиническом уровне из-за отсутствия статистически значимой выборки.

Важным аспектом механизма регенерации тканей при ХОЗАНК является регенеративный ответ собственно мышечных волокон, который на сегодня практически не изучен. Основная роль в регенерации мышечной ткани принадлежит миосателлитоцитам[16]. Одним из важнейших маркеров активированных миосателли-тоцитов является миогенин. Он является поздним маркером миогенной дифференцировки, сопровождающим выход миобластов из клеточного цикла и их терминальную дифференцировку[17]. Анализ экспрессии миогенина дает возможность оценить темп регенерации мышечных волокон, что в совокупности с данными изучения влияния трансплантации СК на плотность капиллярной сети и результатами функциональных тестов позволяет провести достоверную оценку эффективности клеточной терапии ХОЗАНК.

Таким образом, целью нашего исследования стало изучение эффективности терапии ХОЗАНК аутологичными стволовыми клетками периферической крови (СКПК) и выявление лежащих в её основе морфофункциональных механизмов неоангиогенеза и мышечной регенерации.

Материал и методы

Для изучения морфологических основ терапевтического неоангиогенеза и мышечной регенерации нами был проведен клинический эксперимент по трансплантации аутологичных СКПК 30 пациентам с ХОЗАНК.

Клиническая часть эксперимента выполнена на базе отделения сосудистой хирургии Республиканской клинической больницы Министерства здравоохранения Республики Татарстан. В исследование были включены 30 пациентов (облитерирующий атеросклероз — 27 пациентов, облитерирующий тромбангиит — 3 пациента, средний возраст 51,2+1,5) с хронической ишемией нижних конечностей ПЬ степени (по Fontaine), у которых выполнение шунтирующих операций или ангиопластики было невозможно или их результат был сомнителен из-за окклюзии дистального артериального русла.

У всех пациентов было получено информированное согласие на эксперимент. Протокол эксперимента одобрен Республиканским Комитетом по этическим вопросам (Протокол №10 от 23.11.05 г.).

В течение пяти дней пациентам производили подкожные инъекции рекомбинантного препарата грану-лоцитарного колониестимулирующего фактора, затем проводили процедуру лейкафереза на аппарате MCS + (Haemonetics, USA); получали конечный продукт — лейкоцитарную массу, обогащенную клетками-пред-шественницами гемопоэза, в котором проводили подсчет общего числа лейкоцитов и CD34+ клеток (CD34 — наиболее известный и надежный маркер гемопоэти-ческих СК) методом проточной цитометрии. Средний объем введенного аутотрансплантата составилров — 6,73+2,2x10°, из них С034+клеток — 2,94+2,31 2x107. Жизнеспособных клеток в трансплантате было 99,9%.

Операцию по забору биопсии производили под эпидуральной анестезией. Через кожный разрез на уровне середины голени производили забор икронож-пункционную инфильтрацию передней и задней группы мышц голени выделенным концентратом клеток в равноудаленных точках равными дозами по 1,5 млпсию забирали под местной инфильтрационной анестезией через 12 нед. после аутотрансплантации.

Для объективизации изменения степени ишемии до и после введения СК определяли лодыжечно-плечевой индекс (ЛПИ), выполняли стандартный тредмил-тест[17], тетраполярную реографию, дигитальную субтракционную аортоартериографию[18].

Биоптаты после фиксации в 10% нейтральном формалине заливали в парафин, полученные парафиновые срезы (толщина 4—6 мт) для визуализации капилляров подвергали иммуногистохимическому окрашиванию с коммерческими моноклональными антителами к маркерам эндотелия — CD31 (клон 1А10, Novocastra, UK, разведение 1:10), CD34 (клон QBEnd/10, Novocastra, UK, разведение 1:75), vWF (клон F8/86, DAKO, Denmark, разведение 1:25), маркеру миосателлитов — миогенину (клон F5D, DAKO, Denmark, разведение 1:50). В работе использована система визуализации Novolink (Novocastra, UK). Ядра клеток докрашивали гематоксилином.

После визуализации капилляров на срезах биопсий выбирали по 3 случайных поля зрения. Подсчитывали число капилляров в каждом поле по ранее описанной методике[19]. Срезы, окрашенные с антителами к миогенину, подвергали микроскопированию, оценивали количество и локализацию миогенин-по-зитивных клеток, морфологию миогенин-позитивных клеток и клеток их микроокружения, сопоставляли результаты окрашивания на миогенин с данными окрашивания на эндотелиальные маркеры.

Обработку данных производили с помощью статистического графического пакета Statistica 8. Определяли коэффициент корреляции Пирсона, достоверность проверяли с помощью t-критерия Стьюдента. Полученные данные представляли в виде «среднее значение ± стандартное отклонение».

Результаты

Отмечено улучшение состояния пациентов по данным инструментальных исследований. Показатели ЛПИ увеличились на 12% (0,59+0,04 исходно и 0,66+0,04 на сроке 12 нед., р = 0,001). Увеличение дистанции безболевой ходьбы составило 26,5% Соответственно, время восстановления ЛПИ при выполнении тредмил-теста через 3 мес. после транс Показатели тетраполярной реографии не имели достоверных различий. Исходный реографический показателя на стопе также не отразили адекватной

На контрольных артериограммах отмечено появление коллатеральных сосудов, отсутствующих на первичных снимках, однако оценить степень их развития не позволяет отсутствие достоверных статистических критериев.

Иммуногистохимическое окрашивание срезов биоптатов на эндотелиальные маркеры (CD31, CD34, vWF) позволило выявить как капиллярную сеть, так и крупные сосуды. В ранних исследованиях показано, что иммуногистохимическое окрашивание с антителами к CD34 позволяет наиболее полно визуализировать капиллярную сеть[20], что может быть связано с тем, что CD34 — маркер прогениторных клеток, в том числе клеток-предшественниц эндотелия[21 ], и, следовательно, позволяет выявить капилляры на более ранней стадии развития. Поэтому анализ данных о плотности капиллярной сети производили по результатам окрашивания с антителами к CD34.

Результаты иммуногистохимического окрашивания биоптатов с антителами к CD34 показали увеличение плотности капиллярной сети на сроке 3 месяца на 25,0% (соотношение «число капилляров/число.

В биоптатах мышечной ткани, полученных до введения стволовых клеток и окрашенных с антителами к миогенину, мы наблюдали единичные миогенин-позитивные клетки с локализацией, характерной для миосателлитоцитов (под сарколеммой мышечных волокон) (рис. 5). Через 3 мес. после проведенной терапии мы обнаружили увеличение числа миогенин-позитивных клеток. Кроме того, мы наблюдали появление клеток с миогенин-позитивными ядрами (рис. 6), слияние миосателлитоцитов с образованием многоядерных мышечных трубочек (рис. 7), формирование юных мышечных волокон с малым диаметром, центрально расположенным ядром, а иногда и слабо позитивное окрашивание на миогенин (рис. 8, 9).

Обсуждение

Первое сообщение о клиническом исследовании терапии ХОЗАНК с применением СК, было выполнено Е. Tateishi-Yuyama, Н. Matsubara, Т. Murohara с соавт. в 2002 г.[14]. В настоящее время имеется целый ряд клинических работ, свидетельствующих о положительном эффекте применения СК при ишемии конечностей[4, 22].

Во всех публикациях сообщается о достоверном улучшении показателей, предположительно, за счет неоангиогенеза[13, 14]. Так, в пилотном исследовании Е. Tateishi-Yuyama с соавт. (2002)[14] было отмечено увеличение ЛПИ в среднем на 20% через 4 нед. и на 31% (р<0,0001) через 24 недели после внутримышечного введения мононуклеаров костного мозга, времени безболевой ходьбы в среднем с 1,3 мин до 3,6 и 3,7 мин соответственно (р<0,0001). Сходные результаты получены в исследовании Y. Higashi с соавт. (2004)[13].

Мы также зарегистрировали увеличение ЛПИ на 12% через 3 мес. (р=0,001), дистанция безболевой ходьбы по результатам тредмил-теста увеличилась на 26,5% (р<0,001).

Каковы патогенетические основы терапевтического эффекта трансплантации СК? На сегодняшний день опубликованы экспериментальные работы, в которых показано наличие неоангиогенеза после введения СК, и оно доказывается морфологически с помощью им-муногистохимического и иммунофлюоресцентного анализа плотности капиллярной сети, выявления роста сосудов по данным артериограмм[9, 10, 12, 23]. Нами впервые были выполнены иммуногистохимичес-кие исследования биопсийного материала в условиях клинического эксперимента по аутотрансплантациискпк.

В результате исследования было установлено увеличение плотности капиллярной сети скелетной мышцы на 25,0% через 3 месяца после внутримышечного введения СК (р<0,001). Ранее рост соотношения количества капилляров и мышечных волокон был показан в вышеупомянутой работе Е. Tateishi-Yuyama с соавт. (2002)[14], на аутопсиях мышечной ткани опосредовано стимулирующее влияние СК на нео-ангиогенез в пораженных конечностях, остаются неизвестными.

Современные теории описывают три возможных пути участия стволовых клеток в регенерации тканей: прямая дифференцировка в клетки регенерирующей ткани, слияние с клетками-резидентами данной ткани и стимуляция их регенерации путем паракринной секреции ростовых и трофических факторов[24]. На основании экспрессии антигенов донора в тканях реципиента на моделях хронической ишемии скелетных мышц показана способность стволовых клеток к дифференцировке в эндотелий и гладкомышечные клетки[9, 10]. Однако другие авторы считают возможной лишь секрецию ростовых факторов и цито-кинов трансплантированными стволовыми клетками человека, которые группируются вокруг сосудов без дифференцировки в ангиогенном направлении[23]. Изучение вопроса о механизме влияния трансплантированных СК на процессы неоангиогенеза у человека in vivo затрудняет отсутствие методов безопасного мечения клеток, которые позволили бы визуализировать трансплантированные аутологичные клетки в тканях человека.

Интересно, однако, что при трансплантации CD34+ клеток пуповинной крови человека в ишемизированные конечности мышей[12] помимо неоангиогенеза было отмечено также увеличение числа регенерирующих мышечных волокон и сделано предположение о миогенной дифференцировке введенных клеток. Для проверки данного предположения нами впервые им-муногистохимическими методами было проведено изучение популяции миосателлитоцитов в биопсийном материале больных ХОЗАНК после трансплантации им аутологичных СК.

Миосателлитоциты идентифицированы и описаны в 1961 г. Alexander Маиго[25]. Одним из важнейших их маркеров является миогенин (myogenin, MYOG, Myf4) — ген и одноименный белок (продукт экспрессии гена), который является фактором транскрипции, индуцирующим выход миосателлитоцитов из клеточного цикла посредством активации ингибиторов онкогенеза р21 и р53. В стадии пролиферации миосателлитоцитов миогенин обнаруживается в цитоплазме, однако на стадии начала слияния клеток наблюдается его присутствие в ядре[26]. Период обнаружения миогенина в ядре совпадает с моментом терминальной дифференцировки миосателлитоцитов и синтезом белков контрактильного аппарата мышечного волокна (тяжелые цепи миозина, десмин) и дальнейшим образованием мышечных трубочек и юных мышечных волокон[27]. Мыши, дефицитные по миогенину, умирают при рождении из-за нарушения дифференцировки миобластов и практически полного отсутствия мышечных волокон, что доказывает решающую роль данного фактора в миогенезе[28].

В нашем исследовании мы показали увеличение в результате трансплантации количества клеток с миогенин-позитивной цитоплазмой, что может быть связано с активацией процесса регенерации в мышечной ткани на фоне улучшения кровоснабжения в результате роста капиллярной сети, секреции факторов роста эндотелия, которые могут приводить к пролиферации и активации миосателлитоцитов[29].

Факт усиленной регенерации мышечной ткани подтверждает обнаружение миосателлитоцитов с ми-огенин-позитивным ядром, что является признаком поздней стадии их дифференцировки[26]. Как показано в нашем исследовании, данные клетки в дальнейшем сливаются с образованием многоядерных мышечных трубочек и формируют юные мышечные волокона с характерной для них морфологией[30].

Таким образом, мы подтвердили гипотезу об активации пролиферации и дифференцировки миоса-теллитов на фоне увеличения плотности капиллярной сети. Данные факты могут служить основой для нового направления в лечении заболеваний мышц — терапии, направленной на коррекцию микроокружения миосателлитоцитов. При этом возможна как прямая дифференцировка введенных СК в миосателлиты и зрелые мышечные волокна, так и стимуляция регенерации мышечных волокон реципиента под влиянием ростовых факторов, секретируемых СК.

Заключение

Аутотрансплантация СКПК приводит к улучшению васкуляризации ишемизированной конечности путем стимуляции развития микроциркуляторного русла, вероятно, за счет прямой дифференцировки СКПК в эндотелиоциты, слияния этих клеток с эндотелиоци-тами, а также стимуляции роста капилляров секре-тируемыми паракринными факторами.

Увеличение плотности капиллярной сети приводит к активации пролиферации и дифференцировки миосателлитоцитов, их слиянию с образованием мышечных трубочек и юных мышечных волокон. Можно предположить, что введенные СК могут дифференцироваться в миосателлитоциты, нельзя исключить также их слияния со зрелыми поврежденными мышечными волокнами реципиента или паракринного стимулирующего влияния.

В совокупности неоангиогенез и происходящая на его фоне регенерация мышечных волокон с участием активированных миосателлитоцитов приводят к улучшению клинических показателей.

Подняться вверх сайта