Поиск Кабинет

Реалии и перспективы применения генной терапии в сердечнососудистой хирургии

Гены & Клетки: Том VII, №2, 2012 год, стр.: 58-62

 

Авторы

Мжаванадзе Н.Д., Бозо И.Я., Калинин Р.Е., Деев Р.В.

ДЛЯ ТОГО ЧТОБЫ СКАЧАТЬ СТАТЬЮ В ФОРМАТЕ PDF ВАМ НЕОБХОДИМО АВТОРИЗОВАТЬСЯ, ЛИБО ЗАРЕГИСТРИРОВАТЬСЯ

Актуальность патологии сердечно-сосудистой системы, разработки эффективных методов лечения пациентов с ишемической болезнью сердца, хронической ишемией нижних конечностей несомненна. Учитывая ограничения в выполнимости и эффективности стандартных методов лечения (хирургических и консервативных), разрабатываются принципиально новые подходы. Генная терапия – один из наиболее перспективных. В данном обзоре рассмотрены результаты экспериментальных и клинических исследований, позволяющие оценить текущий статус и перспективы применения генной терапии в медицине в целом и в сердечно-сосудистой хирургии, в частности.

Социальная значимость сердечно-сосудистых заболеваний, таких как ишемическая болезнь сердца (ИБС), цереброваскулярная болезнь (ЦВБ), хроническая ишемия нижних конечностей (ХИНК), врожденные и приобретенные пороки сердца, бесспорна. По данным ВОЗ, патология сердечно-сосудистой системы является основной причиной смерти во всем мире (31% от общей смертности населения). По частоте летальных исходов превалируют ИБС (42%) и инсульты (36%) [1]. В России и странах СНГ распространенность сердечно-сосудистых заболеваний среди мужского населения составляет 42–108, среди женского – 34–63 на 1000 человек [2].

Несмотря на постоянное совершенствование хирургических и консервативных методов лечения, оптимизацию стандартов оказания медицинской помощи, частота недостаточно успешных результатов лечения все еще остается довольно высокой. В этой связи, разрабатываются принципиально новые терапевтические подходы, призванные если не заменить стандартные методы, то повысить их эффективность при использовании в рамках комплексного лечения. Одним из наиболее новых, перспективных и уже вошедших (с 2011 г.) в клиническую практику является геннотерапевтический подход.

Революционные открытия в области генетики, произошедшие во второй половине XX века, от установления структуры ДНК Д. Уотсоном, Ф. Криком и М. Уилкинсом до расшифровки генома человека, заложили прочный фундамент для развития современной междисциплинарной области медицины – «генной терапии». Британский Консультативный комитет по генной терапии в 2004 г. дал следующее определение этому направлению биомедицинских технологий: «Намеренное введение нуклеиновых кислот в соматические клетки с целью лечения, профилактики или диагностики заболеваний». Такая обобщенная формулировка позволяет объединить одним термином ряд различных в идейном плане направлений, характеризующихся специфической методологией, механизмами действия и показаниями к применению. Так, разработка методов лечения пациентов с моногенными наследственными заболеваниями, требующих пожизненной экспрессии терапевтического гена, связана, прежде всего, с коррекцией ядерного генома с использованием ретровирусных векторов [3]. В то же время, для устранения приобретенной патологии, в том числе ИБС и ХИНК, показана временная экспрессия трансгена без его включения в ядерный геном, что достигается, главным образом, применением аденовирусных или невирусных систем доставки [4].

В качестве терапевтических молекул в рамках генной терапии могут быть использованы различные по составу и строению нуклеиновые кислоты как в «чистом» виде, так и в комплексах с вспомогательными молекулами/ структурами (например, липосомы), использование которых нацелено на защиту генетических конструкций, повышение эффективности трансфекции [5]. Клетки-мишени, в которые поступили нуклеиновые кислоты с терапевтическими генами, становятся своего рода «биореакторами» белков, продуцируемых пролонгированно и определяющих лечебный эффект.

С момента первого клинического исследования по трансферу генов, проведенному в 1989 г. [6] было одобрено уже более 1500 протоколов по всему миру. Из них 8,4% составляют клинические исследования геннотерапевтических препаратов, показанных для лечения пациентов с сердечно-сосудистыми заболеваниями, главным образом ИБС и ХИНК (третье место по количеству после исследований в рамках онкологии (64,7%) и лечения моногенных наследственных заболеваний (8,5%)) [7].

Генная терапия для обеспечения микроциркуляции и коллатерального кровотока: «терапевтический ангиогенез»

«Терапевтический ангиогенез» – это комплекс методов, обеспечивающих образование новых сосудов гемомикроциркуляторного русла. Процесс ангиогенеза включает активацию эндотелиальных клеток, экспрессию ими протеаз, деградацию внеклеточного матрикса, пролиферацию и миграцию этих клеток, образование ими первичных высокопроницаемых сосудистых структур, последующую стабилизацию и «функциональное ремоделирование» этих структур за счет привлечения перицитов и гладкомышечных клеток и организацию их в сложную трехмерную сосудистую сеть [8]. Описанные этапы являются ключевыми точками приложения терапевтических вмешательств в рамках лечебных подходов. Таким образом, терапевтический ангиогенез, который иногда называют биологическим шунтированием, представляет собой новую тактику улучшения перфузии ишемизированных тканей с помощью усиления естественных, но недостаточных процессов неоваскуляризации.

Потребность в терапевтическом ангиогенезе стоит особенно остро при дистальной форме ХИНК, ишемической болезни сердца, инфаркте миокарда, при которых хирургические методы лечения либо невыполнимы, либо недостаточно эффективны, сопряжены с высокой частотой противопоказаний и осложнений. Учитывая распространенность заболеваний и их социальную значимость, активно разрабатываются консервативные подходы, способные если не заменить, то существенно повысить эффективность комбинированного лечения при использовании вместе с хирургическими методами.

С полной уверенностью можно утверждать, что именно в части терапевтического ангиогенеза методы генной терапии показали наибольшую эффективность. Для разработки геннотерапевтических препаратов используются гены наиболее известных факторов, в различной степени участвующих в ангиогенезе: сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF), фактор роста фибробластов (FGF), гепатоцитарный фактор роста (HGF); фактор, полученный из стромальных клеток (SDF), ангиопоэтин (ANG), индуцированный гипоксией фактор-1α (HIF-1α). Учитывая общность механизма действия, большинство разрабатываемых геннотерапевтических препаратов исследуются при лечении пациентов как с ХИНК, так и с ишемическими поражениями миокарда.

Лечение пациентов с ИБС

ИБС и ее осложнения продолжают лидировать среди причин смерти, несмотря на значительный прогресс в контроле факторов риска и лечении, включая широкое распространение хирургических и эндоваскулярных методов реваскуляризации [2]. В этой связи, целый ряд геннотерапевтических препаратов, успешно прошедших этап экспериментальной апробации, находятся на разных стадиях клинических исследований.

Одними из наиболее очевидных, известных и эффективных кандидатов для использования в терапевтическом ангиогенезе являются гены различных изоформ VEGF. Однако, результаты клинических исследований пока не оправдывают ожиданий в полной мере.

Так, M. Hedman с соавт. (2009) опубликовали результаты 8-летних наблюдений в рамках сравнительного плацебо-контролируемого клинического исследования безопасности препаратов на основе аденовирусного вектора и ДНК-плазмид с геном VEGF165 (в липосомах) в лечении пациентов с ИБС, планирующихся для хирургического лечения (n = 103). Всем пациентам в ходе коронарной ангиопластики или стентирования выполнялись интрамиокардиальные инъекции препаратов. В результате, статистически значимых различий в 8-летней выживаемости пациентов (82% суммарно), а также в развитии неблагоприятных явлений обнаружено не было [9].

Та же исследовательская группа в настоящее время в Финляндии выполняет I/IIа фазу клинических испытаний препарата на основе аденовирусного вектора с VEGF-D для лечения пациентов со стенокардией напряжения II-III ФК (инициировано в октябре 2009 г., окончание – декабрь 2013) [10].

Другую группу терапевтических генов составляют последовательности, кодирующие разные изоформы FGF. Так, в настоящее время в России запланировано проведение III фазы клинических испытаний геннотерапевтического препарата «Generx», российское название «Кардионово» (Cardium Therapeutics Ink.) на 6 базах, запланировано участие 130 пациентов [11]. Однако, введение препарата на основе аденовирусных векторов с геном FGF-4 весьма сложное – интракоронарное, с использованием специальной системы. В предыдущих клинических исследованиях было показано, что препарат оказывает терапевтический эффект, проявляющийся в снижении количества и продолжительности приступов стенокардии (зарегистрированных с помощью электрокардиографии), только у женщин. В случае мужчин эффект был даже ниже, чем в группе плацебо [12].

Ряд разработок связаны с исследованием эффективности геннотерапевтических препаратов на основе гена HGF. В частности, в Корее проводится клиническое исследование безопасности (фаза I) препарата на основе ДНК-плазмид с геном HGF (ViroMed Co., Ltd.; VM Biopharma), вводимого интрамиокардиально при выполнении шунтирующих операций на коронарных сосудах пациентам с ИБС (инициировано в январе 2007, дата окончания – август 2014) [13]. При этом, в ноябре 2012 компании-разработчики планируют начать I/II фазу клинических испытаний того же препарата в США [14].

Помимо ДНК-плазмид, кодирующих один терапевтический ген, разрабатываются препараты на основе нуклеиновых кислот, включающих сразу несколько генов. Предполагается, что экспрессируемые факторы будут потенцировать действие друг друга, тем самым значимо усилив эффект терапевтического ангиогенеза. Одной из наиболее распространенных комбинаций является VEGF-A165/bFGF. В частности, в Польше в мая 2009 г. завершились клинические исследования безопасности и эффективности (фаза II) препарата на основе плазмиды с указанными генами. Препарат вводился интрамиокардиально пациентам со стенокардией напряжения III-IV ФК. при выполнении оперативного лечения [15]. В ходе исследования было установлено, что перфузия миокарда, измеренная в покое и при нагрузке, не отличалась от таковой в контрольной группе. Однако улучшилась переносимость физической нагрузки (предельной, рабочей) [16].

Таким образом, разработка геннотерапевтических препаратов, показанных для лечения пациентов с ИБС, выполняется во всем мире довольно активно. Анализируя опубликованные результаты клинических исследований, можно сделать вывод о безопасности препаратов как на основе невирусных, так и вирусных векторов. Что интересно, несмотря на многократно более высокую эффективность трансфекции при использовании вирусных геннотерапевтических конструкций в сравнительных исследованиях и при сопоставлении результатов разных исследований выраженной разницы в клинической эффективности лечения пациентов с ИБС не наблюдается. Однако для более обоснованных выводов, конечно, необходимы данные полноценного мета-анализа, которые пока отсутствуют.

Лечение пациентов с хронической ишемией нижних конечностей

Хроническая ишемия нижних конечностей (ХИНК), несмотря на развитость методов хирургического лечения, высокотехнологичной медицинской помощи, остается актуальной проблемой в практике сердечнососудистой хирургии. Общая распространенность заболеваний периферических артерий варьирует в пределах 3–10%, достигая 15-20% среди больных старше 70 лет [17]. Академик РАМН А.В. Покровский отмечает недостаточный арсенал средств в лечении больных с данной патологией в наши дни и необходимость разработки новых способов лечения хронической ишемии: «Возможно положительный результат кроется в генных технологиях» [18].

Успешные результаты экспериментальных исследований в рамках генной терапии создали необходимое подспорье для клинических исследований, хотя и не детализировали все аспекты механизмов действия геннотерапевтических препаратов. Однако эффективность подхода и его «инструментов» налицо.

Так, в 2011 г. государственную регистрацию на территории РФ получил разработанный российскими учеными геннотерапевтический препарат на основе ДНК-плазмид с геном VEGF («Неоваскулген») для лечения ХИНК, включая критическую. В соответствии с «Inter-Society Consensus for the Management of Peripheral Arterial Disease (TASC II)» и «Российскими национальными рекомендациями по ведению пациентов с сосудистой артериальной патологией» для подтверждения эффективности данного препарата использовались методы диагностики самого высокого I класса (контрастная ангиография). Процент «успеха» терапии составил 93,6%. У наблюдаемых пациентов были установлены: регресс клинических признаков ишемии, уменьшение болевого синдрома при длительной ходьбе, исчезновение клинических признаков ишемии и болей в покое.

В контрольной группе в ходе всего исследования отмечалась негативная динамика каждого показателя [19]. В России исследованиями в области терапевтического ангиогенеза с применением ДНКплазмид с VEGF занимаются и другие научные группы [20, 21].

На стадии клинических исследований находятся геннотерапевтические препараты как на основе ДНК-плазмид с VEGF, так и включающие нуклеиновые кислоты с генами других факторов. В частности, в декабре 2011 г. в США завершилась первая фаза клинических испытаний препарата на основе ДНК-плазмид с VEGF-A, показанного для лечения ХИНК, доказавших безопасность препарата [22], что согласуется с результатами целого ряда аналогичных клинических исследований, проведенных за последние 15 лет [23].

Другим терапевтическим геном, включаемым в состав плазмид фармкомпозиций, является FGF.

В частности, в ряде клинических исследований была доказана безопасность препаратов с ДНКплазмидами с FGF-1 при их внутримышечном введении в ишемизированную область при ХИНК, в том числе критической [24, 25]. К настоящему времени завершилась III фаза клинических испытания геннотерапевтического препарата с FGF-1, проведенных компанией Sanofi-Aventis в 32 странах (в том силе Россия, США, Великобритания, Германия, Франция и др.) при лечении пациентов с критической ХИНК с язвами кожи. При статистическом анализе результатов на сроке наблюдения в 1 год не было выявлено статистически значимых различий между целевой и контрольной группами в плане выживаемости пациентов и частоты ампутаций [26].

Другие научные группы исследуют эффективность геннотерапевтических препаратов с геном HGF. В частности, в США, Корее [27] и Китае [28] проходит II фаза клинических исследований фармкомпозиции на основе ДНК-плазмид с геном HGF (ViroMed Inc.).

При этом, завершилась III фаза клинических исследований аналогичного по составу препарата Collategene (AnGes Inc.), введение которого было выполнено 27 пациентам с критической ишемией 6нижних конечностей. Через 12 нед. у 70% из пациентов указанной группы наблюдалось статистически значимое снижение болей в покое, уменьшение размеров язвенных поражений кожи, увеличение лодыжечно-плечевого индекса и улучшение качества жизни [29]

В качестве целевого гена ряд разработчиков исследуют нуклеотидную последовательность, кодирующую SDF. Механизм действия SDF состоит в привлечении клеточных источников (прежде всего, эндотелиальных прогениторных клеток) из костного мозга, кровотока, «периферических тканей» в целевую область по градиенту концентрации. В настоящее время в США и Индии проходит II фазу клинических испытаний препарат JVC-100 (Juventas Therapeutics, Inc.), показанный для лечения ХИНК [30].

В клиническом исследовании M.A. Creager с соавт. (2011) применение гена HIF-1α в составе аденовирусного вектора для лечения пациентов с ХИНК оказалось неэффективным. На сроках 3, 6, 12 мес. не было выявлено статистически значимых различий в показателях качества жизни, дистанции безболевой ходьбы и лодыжечно-плечевого индекса между целевой и контрольной группами [31].

Таким образом, для терапевтического ангиогенеза, показанного при ИБС и ХИНК, наиболее эффективны препараты с геном VEGF, что подтверждено результатами многочисленных клинических исследований [32]. Результаты применения геннотерапевтических конструкций с нуклеотидной последовательностью, кодирующей FGF, довольно противоречивы, однако можно утверждать, что в случае лечения пациентов с ИБС эффект более выраженный, чем при ХИНК. Есть основания полагать, что нуклеиновые кислоты, кодирующие другие ангиогенные факторы (HGF, HIF-1α), наименее перспективны для применения в терапии ИБС и ХИНК.

Генная терапия для обеспечения магистрального кровотока: профилактика рестеноза

Высоко актуальной проблемой в практике сердечно-сосудистой хирургии является возникновение стеноза имплантированных стентов сосудов, главным образом, за счет пролиферации гладкомышечных клеток, приводящей к гиперплазии «неоинтимы». Методы профилактики, как находящиеся на стадии разработки, так уже применяющиеся в клинике, крайне разнообразны: от использования металлических стентов [33], имплантатов с лекарственными покрытиями до системного применения различных групп лекарственных препаратов, ингибирующих пролиферацию лейомиоцитов [34]. Однако, как показано в экспериментальных и клинических исследованиях, ни один из методов не обладает достаточной эффективностью.

Геннотерапевтический подход к профилактике рестеноза состоит главным образом, в использовании стентов с покрытиями, содержащими нуклеиновые кислоты. Описаны методы системного введения геннотерапевтических препаратов в раннем послеоперационном периоде после баллонной ангиопластики или стентирования [35]. Большинство же разработок связаны с применением кодирующих ДНК-плазмид с генами NO-синтаз [36, 37]. Выбор терапевтического гена обусловлен биологической ролью NO-синтаз: снижение пролиферативной активности и миграции гладкомышечных клеток в сочетании с повышением таковых в случае эндотелиоцитов, а также наличие вазодилятирующего эффекта [38]. Основные отличия технологических подходов разных авторов связаны с включением вспомогательных веществ для улучшения трансфекции невирусных геннотерапевтических конструкций и их иммобилизации на внутренней поверхности стентов.

В частности, L.A. Brito с соавт. (2010) исследовали эффективность применения комплексов поли-βаминоэстера с ДНК-плазмидами, которые заключали в катионные липосомы. В качестве терапевтического гена использовалась кодирующая eNO-синтазу нуклеотидная последовательность. В ходе лабораторного этапа исследования использование таких систем доставки позволило добиться эффективности трансфекции эндотелиоцитов и гладкомышечных клеток на уровне 20% и 33% соответственно [39]. Комплексы «ДНК-плазмида с геном eNO-синтазы – поли-β-аминоэстер», заключенные в липосомы, иммобилизировались на поверхности стентов с помощью покрытия из желатина B. При имплантации «ген-оптимизированных стентов» в область резецированной подвздошной артерии кроликов через 14 сут. определялись статистически значимо меньшая толщина «неоинтимы», более низкий уровень пролиферации леомиоцитов и активная эндотелизация внутренней поверхности имплантата.

Другой подход состоит в совмещении материала стента с нуклеиновыми кислотами посредством специфических антител к молекулам ДНК [37, 40]. Очевидно, что метод не нацелен на повышение эффективности трансфекции in vivo, уровень которой при использовании таких «геннотерапевтических стентов» не превышает 7% (количество клеток «неоинтимы», экспрессирующих трансген, по отношению к общему количеству клеток «неоинтимы»).

Несмотря на то, что тренд разработок в рамках генной терапии для профилактики рестенозов связан с использованием генов NO-синтаз, ряд авторов придерживаются иного подхода, базирующегося на применении гена сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF), который повышает уровень пролиферации эндотелиальных и гладкомышечных клеток. Теоретическая основа использования ДНКплазмид с VEGF для профилактики рестеноза заключается в усилении эндотелизации, которая превалирует над повышением пролиферации лейомиоцитов. В результате пропорционально увеличению численности эндотелиоцитов повышается уровень NO, тормозящий в свою очередь пролиферацию и миграцию гладкомышечных клеток [41]. Указанный подход лег в основу разработки изделия медицинского назначения «Trinam» (Arc. Therapeutics Inc.), представляющего собой коллагеновый матрикс с аденовирусными геннотерапевтическими конструкциями, кодирующими VEGF-D. Как считают разработчики, «Trinam» показан, прежде всего, для покрытия наружной поверхности зоны анастомоза сосудов при формировании артерио-венозного доступа для гемодиализа. На данный момент приостановлена III фаза клинических исследований, для продолжения которых ведется поиск партнеров [42].

Таким образом, геннотерапевтические методы в рамках пластики крупных сосудов, нацеленные, главным образом, на профилактику рестеноза, разрабатываются довольно активно. Уже сформировался тренд разработок, связанный с созданием стентов, на внутренней поверхности которых иммобилизированы нуклеиновые кислоты с геном, кодирующим eNO- или iNO-синтазу. Однако, более актуализированы исследования в рамках генной терапии, сфокусированные на разработке методов коррекции гемомикроциркуляторного русла.

Заключение

Накопленные за последние 10–15 лет результаты экспериментальных и клинических исследований в рамках генной терапии позволяют с уверенностью утверждать, что, несмотря на сравнительно короткую историю разработок, её продукты (геннотерапевтические препараты, изделия медицинского назначения, технологии) прочно войдут в практику сердечнососудистой хирургии. Начало положено: первый препарат, ставший благодаря своей эффективности и инновационности, довольно известным не только в России, но и за ее пределами, уже разрешен и доступен для применения в клинике [43].

Подняться вверх сайта