Поиск Кабинет

Разработка органной культуры мужских гонад для вирусологических исследований

Гены & Клетки: Том V, №4, 2010 год, стр.: 66-71

 

Авторы

Тюленев ЮА., Науменко В.А., Климова Р.Р., Курило Л.Ф., Шилейко Л.В., Сегал А.С., Ковалев ВА, Кущ АА.

ДЛЯ ТОГО ЧТОБЫ СКАЧАТЬ СТАТЬЮ В ФОРМАТЕ PDF ВАМ НЕОБХОДИМО АВТОРИЗОВАТЬСЯ, ЛИБО ЗАРЕГИСТРИРОВАТЬСЯ

Разработка органной культуры мужских гонад является актуальной проблемой биотехнологии, которая оставалась нерешенной до последнего времени. В то же время, создание органной культуры яичка необходимо для решения как фундаментальных проблем сперматогенеза, так и задач практического здравоохранения, связанных с лечением мужского бесплодия. Одно из первых мест в этиологии бесплодия занимают инфекционные заболевания, в том числе герпесвирусные инфекции (ГВИ).

Цель настоящей работы состояла в разработке культуральной системы, позволяющей сохранять жизнеспособность мужских половых клеток in vitro и оценивать влияние вирусов герпеса на сперматогенез. Для разработки условий культивирования мужских гонад проведены опыты с семенниками мышей DBA и с фрагментами яичек человека, полученных из операционного материала от пациентов после орхэктомии. Каждые 4 сут. изучали морфологию извитых семенных канальцев, подсчитывали количество клеток сперматогенеза, определяли индекс сперматогенеза (ИС) и ультраструктуру половых клеток. В культуру вносили вирус простого герпеса (ВПП или цитомегаловирус (ЦМВ) и каждые 2 сут. определяли вирусную нагрузку в культуральной жидкости.

Ультраструктурный анализ показал, что архитектоника органа и морфология половых клеток сохраняются in vitro в течение, по крайней мере, 16 сут. Жизнеспособность органной культуры яичка оказалась значительно выше, чем семенника мыши: снижение ИС в яичке составило 4%, в семеннике мыши — 50%.

Наиболее чувствительными к герпесвирусам оказались сперматоциты и сперматиды, в которых были обнаружены вирусные капсиды. В культуральной жидкости выявлено нарастание вирусной нагрузки, которая увеличивалась в 24 раза при заражении ЦМВ и в 165 раз — при заражении ВПГ.

Разработка органной культуры мужских гонад и получение модели ГВИ мужских гонад in vitro позволяет не только исследовать патогенетические механизмы, лежащие в основе нарушения фертильности у мужчин, но и разработать рекомендации по лечению таких пациентов.

Попытки разработать органотипические культуры семенников млекопитающих предпринимались давно, однако до последнего времени не удавалось создать культуральную систему, которая позволила бы мужским половым клеткам выживать, делиться и осуществлять дифференцировку in vitro[1, 2]. Стимулами для преодоления сложностей, связанных с разработкой органной культуры яичка, являются возможности решать как фундаментальные проблемы гаметогенеза, так и прикладные задачи медицины. Одна из важных задач состоит в изучении действия вирусных инфекций на структуру и функцию мужских гамет, а также в оценке эффективности действия противовирусных препаратов на вирусиндуцирован-ные патологические процессы. Актуальным объектом для решения этих задач являются вирусы семейства Herpesviridae — вирус простого герпеса (ВПГ) и ци-томегаловирус (ЦМВ), которые широко распространены как в человеческой популяции, так и среди животных. Герпесвирусы вызывают широкий спектр заболеваний, в том числе с тяжелыми последствиями и нередко — с летальным исходом. Установлено, что ВПГ и ЦМВ являются этиологическими агентами заболеваний, передающихся половым путем.

Цель работы заключалась в разработке органной культуры яичка и в создании на её основе модели герпесвирусной инфекции (ГВИ) in vitro.

Материал и методы

Для разработки и оптимизации условий культивирования фрагментов мужских гонад на первом этапе проводили эксперименты с семенниками взрослых половозрелых мышей линии DBA. На следующем этапе проводили опыты с фрагментами яичек человека, полученных из операционного материала от пациентов (средний возраст 65 лет) с раком простаты, которым выполнялась радикальная простатэктомия с орхэктомией.

Оптимальные условия культивирования определяли, варьируя величину эксплантатов, состав питательных сред и тип культуральных планшетов. Лучшие результаты были получены при использовании: фрагментов органов объемом 3 мм3; ростовой среды ДМЕМ, содержащей 10% сыворотки эмбриона коровы («Gibco»); витамины А, С и Е; 1 ммоль/л пирувата натрия («Sigma»); 10 мкг/мл инсулина («Lilly»; 4 ммоль/л глутамина; 5 мкг/мл трансферрина и 50 мкг/мл гентамицина («Панэко»), Зкспланты помещали на полупроницаемую мембрану в 6-луночные планшеты со вставками («Falcon Labware»), что создавало возможность культивирования на границе двух фаз — воздушной и жидкой. Инкубацию проводили при 37°С в атмосфере 5% С02, со сменой среды с интервалом в 2 сут.

Каждые 4 суток изучали морфологию извитых семенных канальцев (ИСК). На гистологических срезах идентифицировали четыре типа ИСК: I тип — содержащие половые клетки четырех стадий развития (сперматогонии, сперматоциты, сперматиды, сперматозоиды); II тип — содержащие три стадии; III тип — две стадии; IV тип — одну стадию. Суммарное количество клеток в 100 семенных канальцах вычисляли умножением числа канальцев первого типа на четыре, второго — на три и т.д. Для оценки влияния условий и продолжительности культивирования на выживание половых клеток высчитывали индекс сперматогенеза (ИС) — отношение суммарного количества клеток к числу изученных семенных канальцев (100). Ультраструктуру половых клеток исследовали методом электронной микроскопии.

Для заражения органной культуры эксплантаты инкубировали с вирусом в течение 1 ч, после чего промывали, культивировали и изучали морфологическими методами, как описано ранее. Выявление ВПГ и ЦМВ в культуральной жидкости проводили быстрым культуральным методом через каждые 48 ч. Вирусную нагрузку выражали в количестве бляшкообразующих единиц в 1 мл (БОЕ/мл). Для выявления зараженных клеток проводили иммунопер-оксидазное окрашивание с использованием моноклональных антител к ранним белкам ВПГ и ЦМВ.

Результаты

Начиная с 4-х сут. культивирования органной культуры семенника мыши, наблюдали постепенное уменьшение численности герминативных клеток, преимущественно за счет сперматоцитов и сперматид. На 16-е сут. пребывания клеток в культуре отмечали отхождение базального слоя герминативного эпителия от мембраны и гибель сперматогониев. Указанные изменения нашли отражение в двухкратном снижении ИС на протяжении 16 сут. культивирования (с 3,4 до 1,73).

Жизнеспособность органной культуры яичка человека оказалась значительно выше: в течение 16 сут. культивирования снижение ИС составило менее 4% (с 3,32 до 3,19). На рисунке 1А представлен ИСК I типа, содержащий клетки всех стадий сперматогенеза. Ультраструктурный анализ показал, что архитектоника органа и морфология половых клеток сохраняются in vitro в течение, по крайней мере, 16 суток. На рисунке 2А показаны ранние сперматиды с формирующейся акросомой.

Изучение динамики ВПГ-инфекции семенника мыши позволило выявить вирус в культуральной среде только на 12-е сут. инфицирования (8 БОЕ/мл), с нарастанием вирусной нагрузки к 16-м сут. (130 БОЕ/ мл). В зараженной культуре яичка человека ВПГ выявляли уже со 2-х сут. инфекции (25 БОЕ/мл), с пиком вирусной нагрузки на 8-е сут. (4130 БОЕ/мл). Сравнение ИС в зараженной и интактной культуре позволило выявить гаметотоксический эффект ВПГ: на 16-е сут. ИС составил 2,67 и 3,19 соответственно (р<0,05).

Вирусная нагрузка ЦМВ в культуре яичка человека оказалась значительно ниже, чем ВПГ: вирус выявляли в культуральной среде с 8-х сут. инфекции (2,5 БОЕ/мл), с максимумом на 12-е сут. (60 БОЕ/мл). Морфологические изменения, вызванные ЦМВ, также оказались менее выраженными: на 16-е сут. инфекции ИС в зараженной и интактной культурах составил соответственно 2,99 и 3,19 (р<0,05).

Наиболее чувствительными к герпесвирусам оказались сперматоциты и ранние сперматиды — численность популяции этих клеток к 16-м сут. культивирования составила соответственно 18% и 20% от исходных значений. Иммуногистохимическая окраска и электронная микроскопия подтвердили преимущественное поражение этих клеток в органной культуре яичка. На рисунке 1Б показано выявление раннего белка ЦМВ в сперматоците. Результаты ультраструк-турного анализа эксплантата представлены на рисунке 2Б: капсиды ВПГ выявлены в ядре сперматиды, полноценные вирионы — в межклеточном пространстве.

Обращают на себя внимание морфологические изменения в инфицированной культуре: вакуолизация герминативного эпителия, нарушение межклеточных контактов (рис. 1Б), дегенеративные изменения ак-сонемы, накопление плотных телец в цитоплазме сперматиды (рис. 2Б).

Заключение

Проблема орхитов герпесвирусной этиологии представляется актуальной в свете накопления данных о влиянии вирусов на фертильность[3, 4], а также о возможности вертикальной передачи инфекции с мужскими гаметами[5]. Механизмы взаимодействия вируса с мужскими половыми клетками изучены недостаточно, что во многом связано с трудностью моделирования in vitro сперматогенеза — многоэтапного процесса пролиферации и дифференцировки половых клеток, регулируемого больших количеством клеточных и гуморальных факторов.

Нами разработана органная культура мужских гонад и получена модель ГВИ мужских гонад in vitro на двух биологических объектах — семеннике мыши и яичке человека, позволяющая изучать процессы спер- матогенеза, их нарушения и коррекцию в течение 16 сут. Моделирование на яичке человека представляет сложность в связи с труднодоступностью материала, однако обладает рядом преимуществ: лучшие показатели витальности герминативного эпителия в культуре по сравнению с семенником мыши; возможность моделирования как ВПГ-инфекции, так и видоспецифичной ЦМВ-инфекции человека; большая степень приближения к процессам, происходящим в организме человека.

Изучение влияния ВПГ и ЦМВ на сперматогенез позволяет не только исследовать патогенетические механизмы, лежащие в основе нарушения фертильности у мужчин, но и разработать рекомендации по лечению таких пациентов.

Подняться вверх сайта