Поиск Кабинет

Разработка оптимальных условий культивирования и дифференцировки стволовых и прогениторных клеток ЦНС человека и животных

Гены & Клетки: Том IV, №4, 2009 год, стр.: 73-77

 

Авторы

Квачева З.Б., Пыко И.В., Вотяков В.И., Титов Л.П., Федулов А.С., Корень С.В.

ДЛЯ ТОГО ЧТОБЫ СКАЧАТЬ СТАТЬЮ В ФОРМАТЕ PDF ВАМ НЕОБХОДИМО АВТОРИЗОВАТЬСЯ, ЛИБО ЗАРЕГИСТРИРОВАТЬСЯ

Разработана технология приготовления культур стволовых и прогениторных клеток (СПК) из нейрогенных зон мозга человека и животных. Определен оптимальный состав среды для пролиферации нейральных СПК, выращиваемых суспензионным способом в виде нейросфер. Дана морфологическая и фенотипическая характеристика культивируемых клеток с использованием моноклональных антител к маркерам стволовых, прогениторных и зрелых клеток. Установлена способность к росту и накоплению биомассы СПК в течение 3-х пассажей. Проведена сравнительная оценка интенсивности роста нейросфер, полученных из разных областей мозга человека и животных. Выявлен более интенсивный рост СПК животных из суб-эпендимной зоны желудочков мозга и обонятельной луковицы.

К настоящему времени получены данные, свидетельствующие о наличии скрытого резерва обновления соматических клеток в постнатальном онтогенезе, благодаря поддержанию пула стволовых клеток (СК) — родоначальниц различных линий клеточной дифференцировки [1—4].

Установлен факт существования нейральных стволовых и прогениторных клеток в определенных зонах ЦНС взрослых млекопитающих. Они локализованы в субэпендимной зоне, зубчатой извилине гиппокампа и обонятельной луковице головного мозга человека и грызунов [5—7]. Эти клетки дают начало нейронам, макроглии и способны поддерживать локальный нейрогенез в течение всей жизни, значение которого, однако, в настоящее время недостаточно изучено. СПК, полученные от взрослых животных и человека, по многим свойствам имеют сходство с таковыми, полученными из эмбриональной ткани. Но они имеют также и различия, состоящие в количестве их в организме, в ограниченности потенциала к делению в условиях культуры. «Региональное стволовое пространство» органа (головного мозга) взрослого истощается по мере старения организма [8—10]. Не вызывает также сомнений, что только локальный нейрогенез не приводит к полному восстановлению анатомической структуры и функций при травматических повреждениях и сосудистой патологии ЦНС.

Причиной необходимости применения клеточных технологий в неврологии [11 12], как одного из методов терапии, являются неблагоприятные прогнозы у пациентов, перенесших обширный инсульт или страдающих нейродегенеративными заболеваниями различной этиологии.

Обнаружение нейральных предшественников, способных к развитию в нейроны и макроглию in vitro и in vivo [8—10], дает возможность для изучения клеточных механизмов, лежащих в основе развития нейропатологии и репарации [13 14]. Наименее всего исследованы свойства мультипотентных стволовых и прогениторных клеток (СПК) взрослого человека и половозрелых животных, их способность генерировать нейроны, астроциты и олигодендроциты de novo [8, 9, 11, 15].

Очевидно, что для решения практических задач и проведения фундаментальных исследований, потребуется накопление СПК в достаточном количестве в культуре. Однако в настоящее время отсутствует единый протокол получения культур СПК мозга. Поэтому представляет интерес установление оптимальных условий выделения и наращивания клеточной биомассы in vitro СПК из нейрогенных областей мозга человека и животных [7, 15—17], изучение их пролиферативного и диф-ференцировочного потенциала.

Материал и методы

Вся работа по получению, обработке ткани и культивированию клеток проводилась в асептических условиях в ламинарном боксе. Для приготовления культур использовали ткань из разных нейрогенных областей головного мозга экспериментальных животных (1 кролик, 4 мыши, 2 крысы): субэпендимная зона желудочков, гиппокамп, обонятельная луковица. Животные содержались на стандартном рационе вивария БГМУ, работа с животными проводилась в соответствие с законодательством Республики Беларусь.

В работе использовали также образцы мозга (субэпендимная зона желудочков, белое вещество полушарий мозга, обонятельная луковица) 4-х человек, полученные при оперативных вмешательствах, выполненных по жизненным показаниям (тяжелая черепно-мозговая травма). Выбор областей для получения образцов определялся расположением очага травматического повреждения головного мозга и необходимым объемом оперативного вмешательства. Образцы мозга доставлялись в лабораторию в среде ДМЕМ с антибиотиками (ген-тамицин ^100 мкг/мл и амфотерицин Б — 10 мкг/мл) (Sigma, США). Хранение материала для посева клеток — не более 4-х ч при +4°С.

Для приготовления культур СПК животных использовали суспензионный метод культивирования в виде нейросфер [17].

Отсутствие единого стандартного протокола выделения и культивирования in vitro нейральных СПК взрослого человека побудило нас на первых этапах воспользоваться методом, предлагаемым для культивирования СПК животных [17] в собственной модификации. Образцы ткани мозга человека вначале подвергали механической дезагрегации: в чашке Петри измельчали ножницами в течение 3 мин до фрагментов 1 мм3. Затем обрабатывали не только 0,25% раствором трипсина, но и 0,1 % раствором коллагеназы типа 1 (1:1), (Sigma, США) в течение 2^3 ч в термостате при 37°С. После ферментативной диссоциации освобождались от крупных конгломератов клеток фильтрованием через нейлоновые фильтры с размером пор 150 мкм, затем центрифугировали 10 мин. при 1500 об./мин. Осадок ресуспендиро-вали в ростовой среде и доводили концентрацию клеток для посева до 500 тыс. клеток в 1 мл ростовой среды. Суспензию клеток в 6 мл ростовой среды заливали в культуральные флаконы (Greiner bio-one, Германия), покрытые антиадгезивным материалом (поли-2-гидро-оксиэтил-метакрилатом) (Sigma, США). Клетки культивировали в С02-инкубаторе при 37°С. В качестве ростовой среды использовали питательную среду ДМЕМ с FGF-b в концентрации 20 нг/мл и гепарином — 8 мкг/мл. Каждые три дня добавляли новую порцию ростового фактора в той же концентрации. При микроскопии на 7^10 сут. культивирования наблюдали образование свободноплавающих клеточных агрегатов, состоящих из 50 и более клеток, размеры которых к 14 сут. увеличивались. В последующем осуществляли смену ростовой среды на идентичную по составу путем центрифугирования суспензионной культуры 10 мин при 1500 об./мин. Осадок ресуспендировали пипетированием и рассевали в новые флаконы. Диссоциацию клеток из нейросфер при их пересевах проводили механически (пипетированием) или при помощи 0,25% трипсина и 0,02 % ЗДТА (Sigma, США) в соотношении 1:3. Культивировали клетки в инкубаторе в атмосфере, содержащей 5% С02, при 37°С.

В работе использовали Дульбекко модифицированную среду Игла ДМЕМ и F-10 (Sigma, США) в соотношении 1:1 с добавками (Stem Cell Technologies, Канада) в следующих вариантах:

1) фактор роста фибробластов (FGFb, 20 нг/мл); эпидермальный фактор роста (hEGF, 10 нг/мл);

2) FGFb 20 нг/мл; фактор, ингибирующий лейкемию (LIF, 10 нг/мл);

3) FGFb, 20 нг/мл;

4) hEGF, 10 нг/мл; LIF 10 нг/мл.

Во все варианты сред добавляли гепарин (8 мкг/мл) и гентамицин в дозе 100 мкг/мл.

Культуры характеризовали по жизнеспособности с помощью окраски их 0,5% водным раствором трипано-вого синего, а также по пролиферации и способности формировать нейросферы при переносе суспензии клеток в культуральные флаконы с ростовой средой и добавками факторов роста стволовых клеток. Индекс пролиферации (ИП) клеток в пассажах определяли по их наращиванию в 3-х отдельных флаконах на 9-е сут. каждого пассажа. Количество клеток подсчитывали в камере Горяева общепринятым методом [18].

Наблюдение за ростом и развитием живых культур проводили ежедневно с помощью фазово-контрастной микроскопии Nikon Eclipse 50i (Nicon, Япония), при увеличениях х100^600. При морфологическом анализе оценивали количество, форму, размеры нейросфер, количество живых пролиферирующих клеток во флаконе после их диссоциации из нейросфер.

Для фенотипирования нейральных СПК использовали антитела фирмы Stem Cell Technologies, Канада. Первичные антитела: кроличья антисыворотка к глиальному фибриллярному кислому белку (ГФКБ) для идентификации астроцитов, 1:100; моноклональные антитела к нестину, клон Rat 401 для определения стволовых клеток, 1:50; моноклональные антитела к маркеру О 4 олигодендроцитов, 1:50; моноклональные антитела к микротубулярному ассоциированному белку (МАР-2) развивающихся нейронов, 1:200.

Вторичные антитела: козьи антимышиные, меченные флюоресцеинизотиоцианатом (FITC), 1:100; козьи антикроличьи, меченные 7-амино-4-метилкумарин-3-ук-сусной кислотой (АМСА), 1:100.

Фенотипирование СПК проводили непрямым имму-нофлюоресцентным анализом (НИФА): на предварительно покрытые поли-Ь-лизином (Sigma, США) покровные стекла наносили 200 мкл суспензии СПК в ростовой среде с 2% эмбриональной телячьей сыворотки (ЗТС) (Sigma, США) без ростовых факторов и в закрытых чашках Петри переносили их на 6^12 ч в термостат при 37°С для прикрепления и наращивания клеток. Далее постановку НИФА проводили согласно рекомендациям фирмы Stem Cell Technologies. Визуализацию реакции проводили с помощью люминесцентного микроскопа Nikon Eclipse 50i (Nikon, Япония) и светофильтров BV-400 с микрофотосъемкой. Содержание эспрессирую-щих маркеры клеток определяли, подсчитывая отношение количества флюоресцирующих клеток в трех ству клеток в тех же полях зрения при световой микроскопии.

При статистической обработке экспериментальных данных вычисляли среднеарифметические величины, их доверительные интервалы и проводили оценку достоверности различий с помощью критерия Стьюдента. На одну точку исследования брали не менее 3-х флаконов с культурами.

Результаты и обсуждение

Для наращивания биомассы СПК и поддержания их в недифференцированном состоянии необходимо было определить оптимальные условия для их длительного культивирования в пассажах. Для этого нами изучено влияние четырех вариантов составов ростовых сред на способность к пролиферации и генерации нейросфер (см. материалы и методы). На рис. 1 представлены данные накопления клеток 2-х первичных культур СПК человека (средние данные) в динамике субпассажей с использованием разных вариантов ростовых сред.

Как следует из диаграммы ИП при использовании первого варианта среды (ДМЕМ + F10 + FGFb + hEGF) был наибольшим.

Таким образом, добавление в смесь питательных сред (ДМЕМ + F10) 2-х ростовых факторов: FGF-b и hEGF обеспечивало лучшую генерацию нейросфер и наращивание в них клеток, что согласуется с данными некоторых исследователей, которые для индукции роста нейральных СПК использовали два фактора роста. Что касается добавления фактора, препятствующего спонтанной дифференцировке клеток — LIF, то, как показали наши исследования, он существенно не влиял на пролиферативную активность клеток. Полученный нами результат согласуется с литературными данными [17]. Этот фактор, по данным литературы, чаще добавляют для роста СК, полученных из эмбриональной и фетальной ткани, и реже для культивирования СПК взрослых млекопитающих. В то же время имеются данные, что LIF может иммортализовать стволовые клетки из ткани мозга взрослых, изменять их свойства на генетическом уровне таким образом, что после трансплантации в организм они теряют способность дифференцироваться в специализированные клетки ЦНС [17]. Поэтому можно заключить, что вопрос о роли LIF требует дальнейшего изучения.

При микроскопии на 4—5-е сут. культур из образцов ткани мозга человека наблюдали образование свободноплавающих клеточных агрегатов — нейросфер, состоящих из 50^100 и более клеток. Размеры и количество нейросфер к 9 сут. культивирования увеличивались, и соответственно увеличивалось количество клеток в агрегатах. Отмечена морфологическая гетерогенность нейросфер, которая выражалась в их разных размерах, плотности укладки клеток (рис. 2). На 10—12 сут. культивирования наблюдалось замедление роста СПК, и возникала необходимость в пересеве их в новые флаконы со свежей питательной средой.

При диссоциации клеток из нейросфер и рассеве их в новые культуральные флаконы через 3^5 сут. наблюдали появление вновь сформированных нейросфер (вначале небольших размеров), которые в последующем увеличивались в размере за счет пролифирации клеток. При длительном пассировании в культурах наблюдали формирование новых клонов путем отпочковывания от старых нейросфер, а не только рост клонов за счет экспансии периферических слоев прогениторных клеток, выявлявшийся при высокой плотности культур (см. рис. 2).

Для сравнительного изучения пролиферативной активности и роста культур СПК из ткани различных нейрогенных областей мозга человека и животных в асептических условиях из образцов разных нейрогенных областей (гиппокамп, субэпендимная зона желудочков, обонятельная луковица) мозга лабораторных животных и человека (обонятельная луковица, субэпендимная зона желудочков и белое вещество полушарий мозга) приготовлено 22 культуры СПК по методике описанной выше с использованием ростовой среды следующего состава: ДМЕМ + F-10 + FGFb + hEGF. При этом выявлено морфологическое сходство продуцируемых нейросфер, полученных как из клеток мозга человека, так и животных. Но интенсивность роста культур СПК человека и животных была разной.

На 1—3-й сут. после посева суспензии клеток из су-бэпендимной зоны желудочков мозга и обонятельной луковицы кролика и мышей выявлено образование свободноплавающих нейросфер, (4—5 в поле зрения микроскопа, при увеличении х200). Начало формирования нейросфер из клеток гиппокампа животных отмечалось только на 3^4 сут. Среднее количество свободноплавающих нейросфер, подсчитанных в 3-х полях зренияного роста СПК), представлено в таблице 1.

При подсчете нейросфер из клеток белого вещества полушарий мозга установлено их достоверно меньшее количество — 10+2 (Р<0,01). Наши данные о возможности использования белого вещества мозга в качестве источника для выделения и приготовления культур СПК согласуются с результатами других исследователей, которым также удалось получить аналогичные культуры [19].

Таким образом, СПК из нейрогенных зон мозга животных формируют нейросферы раньше, и они накапливаются в большем количестве, чем в случае культивирования клеток мозга человека. Возможно, это связано с наличием неодинакового количества СПК в разных областях мозга человека и экспериментальных животных, что в свою очередь связано с возрастом организма [2].

При иммуноцитохимическом анализе фенотипов клеток использовали нейросферы не позже 9-х сут. роста в культуре. Суспензионную культуру нейросфер переводили в монослойную путем подращивания клеток в течение 2^6 ч на высоко адгезивной поверхности (покровном стекле, обработанном поли-Ь-лизином). Имму-ноцитохимический анализ клеток нейросфер человека и животных из разных областей мозга выявил их гетерогенный состав, характеризующийся разной степенью зрелости клеток. Количество нестин+-, виментин+-, МАР-2+-, О 4+-клеток (маркер незрелых олигодендро-цитов) сильно варьировало в пределах одной опытной группы. Ни в одной из культур не наблюдалось превалирования монотипа выше уровня 30^50%. Постоянный полиморфизм клеток в нейросферах подтверждает их мультипотентность.

Как видно из данных, представленных на рис. 3, некоторые клетки человека из культивируемых нейросфер содержат маркер незрелых олигодендроцитов ^04 (рис. ЗА) или нейробластов — МАР-2+-клетки (рис. ЗВ). Выявляются также маркеры и зрелых астроцитов — ГФКБ+-клетки (рис. ЗБ).

При изучении фенотипов клеток из нейросфер, полученных от мышей, выявлены также нестин+-клетки, составляющие 3^15% (рис. 4В).

Полученные нами результаты по фенотипированию клеток из нейросфер подтверждают тот факт, что продуцируемые в культуре структуры являются истинными нейросферами — клонами СПК, а подобранные нами условия их роста обеспечивают их продукцию.

Заключение

Разработана технология приготовления культур СПК из нейрогенных зон мозга человека и животных, выращиваемых суспензионным способом в виде нейросфер.

Определен оптимальный состав среды для пролиферации нейральных СПК из нейрогенных областей мозга человека и животных: питательная среда ДМЕМи F-10 с добавлением ростовых факторов — FGF-b и hEGF. Установлено, что морфологический состав нейросфер гетерогенен. Они имеют разные размеры (от 50 до 350 мкм в диаметре) и разную плотность укладки клеток. Фенотипирование популяции клеток в нейросферах выявило их следующие типы: стволовые клетки (нестин+-клетки), предшественники нейрональной природы (МАР-2+-клетки), клетки-предшественники олигодендроцитов (О 4+-клетки) и зрелых астроцитов (ГФКБ+-клетки).

Исследованы морфофункциональные свойства 22-х первичных культур СПК из разных нейрогенных областей мозга человека и экспериментальных животных (кролик, мыши, крысы). Выявлена более активная пролиферация культур СПК человека, полученных из клеток обонятельной луковицы и субэпендимной зоны желудочков, чем из белого вещества мозга. Полученные результаты могут явиться научной и практической базой при разработке протоколов лечения больных с нейродегенеративными заболеваниями, травматическими повреждениями и сосудистой патологией цнс, основанных на аутогенной или аллогенной трансплантации СПК.

Подняться вверх сайта