Поиск Кабинет

Разработка имплантируемых клеточно- и тканеинженерных конструкций вспомогательной печени для лечения печёночной недостаточности

Гены & Клетки: Том X, №1, 2015 год, стр.: 6-17

Авторы

Онищенко Н.А., Гулай Ю.С., Шагидулин М.Ю., Никольская А.О., Башкина Л.В.

ДЛЯ ТОГО ЧТОБЫ СКАЧАТЬ СТАТЬЮ В ФОРМАТЕ PDF ВАМ НЕОБХОДИМО АВТОРИЗОВАТЬСЯ

В статье проанализированы современные достижения и перспективы создания трансплантируемых клеточно- и тканеинженерных конструкций (КИК и ТИК) вспомогательной печени для лечения печёночной недостаточности. Подчёркивается необходимость обеспечения длительного и устойчивого функционирования имплантируемых КИК и ТИК при лечении печёночной недостаточности путём формирования в них de novo гепатоспецифических структур и превращения этих структур в новые центры восстановления повреждённой печени. КИК и ТИК приобретают указанные свойства за счёт включения в их состав ряда малодифференцированных клеток: тканеспецифических клеток печени (паренхиматозных и непаренхиматозных), клеток, коммитированных в гепатоцитарном направлении, и клеток костного мозга, адгезированных на биосовместимом и биодеградируемом трехмерном материале, имитирующем свойства внеклеточного матрикса. В статье проведён анализ преимуществ, недостатков и перспектив применения основных групп каркасных материалов (биологические, синтетические, включая биополимерные, композитные и тканеспецифические материалы, полученные при децеллюляризации печени). Указывается, что биополимеры занимают предпочтительное место среди биодеградируемых матриксов, так как обладают не только биосовместимостью, но и свойствами «биостимуляторов». Поскольку при изготовлении ТИК требуется обеспечение адекватного стереотипического распределения различных типов клеток на матриксе, в обзоре уделено большое внимание изготовлению микромасштабных, среднемасштабных и крупномасштабных ТИК вспомогательной печени. Вместе с тем указывается, что ни одна из проблем изготовления ТИК печени (выбор источников и технологий получения малодифференцированных клеток, выбор матриксов и технологии их заселения клетками, выбор технологии сборки ТИК) не может считаться окончательно решённой.

Проблема лечения пациентов с тяжелыми формами острой и хронической печёночной недостаточности (ПН) всё ещё далека от эффективного решения, так как показатели смертности, временной нетрудоспособности и инвалидизации больных при заболеваниях печени по-прежнему занимают одно из первых мест среди других нозологий. Полагают, что ПН развивается в результате снижения в печени количества функционирующих тканеспецифических структур до критического уровня, а также из-за уменьшения у оставшихся клеток печени чувствительности к восприятию репаративных стимулов в связи с нарушением не только клеточно-клеточных и клеточно-матриксных взаимодействий, но и ввиду нарушения качества (снижения интенсивности и длительности) самих регуляторных сигналов. По современным представлениям, восстановительный морфогенез тканей и органов у высших животных и человека неразрывно связан с другими компенсаторно-адаптационными механизмами – гипертрофией и гиперплазией клеток, входящих в состав отдельных анатомо-функциональных структур тканей[1, 2].

Между тем, такие типы механизмов способствуют компенсации утраченного объёма ткани (компенсаторная гипертрофия), нормализуют функцию ткани или органа за счёт повышения нормы функции каждой сохранившейся структурно-функциональной единицы, но не за счёт увеличения количества таких структур[3]. Кроме того, следует учитывать, что индукция клеточной пролиферации при восстановительной регенерации, а также синтез de novo тканеспецифических белков, в том числе эмбриональных белков, характерных для развития и регенерации органов, сопровождаются онтогенетически детерминированным изменением программы функционирования их генов, которая регулируется прежде всего системой региональных стволовых клеток[4]. Между тем, известно, что развитие тяжёлой недостаточности функции какого-либо жизненно важного органа сопровождается угнетением активности системы региональных стволовых клеток, как в самих повреждённых органах, так и во всём организме[5]. В результате возможность самоиндукции восстановительного морфогенеза в тканях при тяжёлом повреждёнии органов оказывается заблокированной, а процесс повреждения – необратимым. С учётом основополагающих биологических закономерностей реализации восстановительной регенерации органов и тканей у высших животных и человека исследователи различных стран мира приступили к разработке новых биотехнологических методов восстановления структуры и функции повреждённой печени путём восполнения извне дефицита отдельных тканеспецифических структур и/или стимуляции восстановительной регенерации оставшейся части печени[6] с помощью методов тканевой инженерии.

1. Биотехнологические методы индукции восстановительной регенерации в повреждённой печени

Известно, что при хронических прогрессирующих заболеваниях печени с избыточным разрастанием в ней соединительной ткани у оставшихся клеток печени снижается чувствительность к естественным ауторегуляторным регенерационным стимулам. Сниженное участие гепатоцитов и некоторых других клеток печени в процессах восстановительной регенерации нарушает адекватность выработки в ней регуляторных про- и противовоспалительных сигналов (цитокинов) и антифиброгенных факторов (матриксных-металлопротеиназ и их ингибиторов). В результате в печени создаются условия для осуществления не восстановительной регенерации, а хронически поддерживаемого воспаления и фиброзирования[7, 8]. Именно по этой причине в экспериментальных и клинических исследованиях ведутся разработки способов индукции восстановительной регенерации печени путём трансплантации донорских гепатоцитов и клеток костного мозга (КМ)[9–11], которые, как установлено, обладают потенциалом дифференцировки в гепатоцитарном направлении[12] и оказывают прямое противовоспалительное воздействие.

1.1. Трансплантация суспензии клеток печени и костного мозга

Трансплантация суспензии гепатоцитов, как альтернатива ортотопической трансплантации печени, была изучена не только у взрослых, но и у детей с генетически обусловленной патологией метаболических процессов в печени (болезнь Вильсона – Коновалова; дефицит α-1 антитрипсина; эритропоэтическая протопорфирия; липидозы (болезнь Нимана – Пика); тирозинемия I типа; конгенитальная гипербилирубинемия; семейная гиперхолестеролемия; синдром гипераммонемии; Гемофилия А; дефицит IX фактора, наследственная ангиоэдема)[13, 14]. В этих наблюдениях общая масса гепатоцитов, трансплантированных под капсулу селезёнки или портальную вену, составляла не более 10% от эквивалента массы печени реципиента, но это количество оказалось достаточным для частичной нормализации метаболизма[15]. Вместе с тем, несмотря на клинический эффект, выживаемость донорских гепатоцитов была низкой, и к концу наблюдения (6 мес.) их количество не превышало 1% от массы печени реципиента[13]. Полагают, что неспособность донорских гепатоцитов длительно поддерживать эффективную метаболическую активность клеток повреждённой печени связана с тем, что гепатоциты, будучи дифференцированными клетками, способными к выполнению специфических функций, в культуре не пролиферируют, не дедифференцируются и поэтому после трансплантации не продуцируют в организме полный спектр гепатотропных факторов роста[14].

Недостаточная эффективность зрелых гепатоцитов при лечении острой или хронической ПН[16] способствовала росту интереса исследователей к индукции восстановительной регенерации в поврежденной печени с помощью регионарных стволовых и (или) прогениторных клеток (СПК) печени – овальных клеток (внутрипечёночных СПК) и клеток костного мозга (КМ), которые, как оказалось, также являются непременными участниками восстановительного морфогенеза печени[8]. Оба типа клеток признаны регионарными СПК печени, т.к. они способны экспрессировать гены гепатоцитарных белков, приобретать некоторые функции гепатоцитов[17] и восстанавливать функциональные резервы клеток повреждённой печени[18]. Интенсификации исследований по применению клеток КМ для восстановительной регенерации повреждённой печени способствовали многочисленные наблюдения способности гемопоэтических и негемопоэтических (мезенхимальных стромальных) СПК КМ (ГСК и МСК соответственно) и крови взрослого человека дифференцироваться в гепатоцитоподобные клетки[19], а также наблюдения, доказывающие появление в печени после введения клеток КМ полноценных гепатоцитов костномозгового происхождения, которые обеспечивают коррекцию моделированной ПН[20].

В современной литературе широко обсуждается вопрос о возможности восстановительной регенерации печени при использовании клеточных технологий не только за счет усиления пролиферации гепатоцитов и восстановления массы паренхимы печени, но и за счет регресса уже сформировавшегося фиброза[21, 22].

Уже установлены факты антифиброзного действия СПК КМ[23, 24]. Однако не все исследователи признают фибролитический эффект СПК КМ и даже имеются указания на возможность усиления фиброза при их применении[25]. Можно думать, что диаметрально противоположные результаты воздействия клеточной терапии на процессы фиброзирования в печени могут быть следствием недоучёта типа и дозы используемых клеток, а также стадии (степени тяжести и обратимости) фиброзирующего процесса, при котором они применяются. В нашей работе[26] показано, что аллогенные донорские МСК КМ при трансплантации крысам с хроническим фиброзирующим повреждением печени способны предотвращать в ней развитие соединительной ткани, если МСК КМ используются в достаточной дозе (например, 5×106) и на ранних сроках развития фиброзирования, т.е. когда в печени ещё сохранены резервы адаптации, регуляции и перепрограммирования процессов регенерации. Тот факт, что клетки КМ имеют мезенхимальное происхождение, заставляет сомневаться в том, что в клинических условиях после трансплантации возможна их трансдифференцировка и длительное выполнение гепатоцитарных функций. Именно по этой причине при лечении ПН для возмещения дефицита функционирующих клеток печени и создания условий для их пролонгированной активности исследователи стремятся не только применять клетки КМ в сочетании с донорскими гепатоцитами[27], но и создавать условия для их контактного взаимодействия путём иммобилизации на биосовместимых матриксах.

1.2. Трансплантация клеток печени и костного мозга в составе тканеподобных структур (биоинженерных конструкций)

Современный этап совершенствования разработок по созданию биоискусственной печени связывают с использованием клеток донорской печени в составе тканеподобных структур, которые в виде имплантируемых тканеинженерных конструкций предназначены обеспечивать адекватные условия для долгосрочной жизнедеятельности внесённых в них клеток (их прикрепление, контактные взаимодействия, тканеспецифическое функционирование) и способствовать достижению и длительному поддержанию клинического эффекта при их применении[28–30]. Основные направления современных исследований и возможные области применения достижений тканевой инженерии печени представлены на рис. 1[31].

Из схемы на рис. 1 следует, что в основе успешной разработки тканеинженерных конструкций печени лежит, прежде всего, создание и использование биоматериалов (матриксов) с заданными свойствами, среди которых в качестве каркаса или носителя клеток используют натуральные, синтетические и композитные материалы.

При выборе оптимального материала и способа его изготовления должно быть одновременно учтено множество условий, определяющих его свойства, таких как внутренняя архитектоника материала, время его резорбции, биосовместимость, присутствие в матриксе и контролируемое высвобождение биологически активных веществ (специфичные белки внеклеточного матрикса, факторы роста, цитокины), поддерживающих пролиферацию и рост клеток. Однако, несмотря на прогресс в области изготовления имплантируемых систем доставки биологически активных веществ и клеток в органы и ткани, создание биосовместимых матриксов остается нерешённой, а потому актуальной задачей. Преимущества, недостатки, а также перспективы использования некоторых групп материалов, изученных к настоящему времени, представлены в табл. 1[31].

Важно подчеркнуть, что формирование самих тканеинженерных конструкций также не может считаться решённой проблемой. Используются разные технологии их изготовления, которые могут различаться по принципу сборки отдельных элементов[32] и по масштабу создаваемых при этом конструкций[33].

Различают два основных подхода при сборке элементов тканеинженерных конструкций: принцип «сверху вниз» и принцип «снизу вверх»[32]. При осуществлении принципа «сверху вниз» (нисходящий принцип) биодеградируемый и биосовместимый носитель (матрикс) заселяется клетками в расчёте на то, что они проникнут в носитель, колонизируют его и начнут синтезировать собственный матрикс. При реализации принципа «снизу вверх» (восходящий принцип) с помощью различных методов создаются тканевые строительные блоки, которые в последующем объединяются в более крупные тканевые конструкции.

Масштаб создаваемых конструкций может колебаться в зависимости от размера целого органа (например, использование каркасов после децеллюляризации печени) до размера микротканевого элемента (сфероиды).

Для реализации любого из этих технологических подходов исследуются матриксы с различными заданными биофизическими и биотехнологическими свойствами, наиболее пригодные из которых для тканевой инженерии печени представлены в табл. 2.

Из табл. 2 следует, что среди биодеградируемых матриксов, используемых для клеточных технологий, биополимерные материалы (альгинаты, коллаген, желатин, хитозан, гиалуроновая кислота, полиэфиры бактериального происхождения и др.) занимают особое место, т.к. они обладают не только высокой биосовместимостью, но и свойствами биостимуляторов[34]. При имплантации биополимеры расщепляются на более простые соединения, которые выводятся из организма либо принимают активное участие в метаболизме на клеточном уровне. Продуктами данного класса материалов, уже получившими признание на рынке биополимеров медицинского назначения, являются: композиция гетерогенного имплантируемого геля – Сферо®ГЕЛЬ (Биомир сервис, Россия) и биополимерные имплантируемые мембраны – ЭластоПОБ®, разработанные в ФГБУ «Федеральный научный центр трансплантологии и искусственных органов имени акад. В.И. Шумакова» Министерства здравоохранения РФ совместно с АНО «Институт медико-биологических исследований и технологий» (Москва).

В настоящее время биополимерные импланты Сферо®ГЕЛЬ и ЭластоПОБ® разрешены для применения в клинической практике в России[48, 49]. По своим свойствам Сферо®ГЕЛЬ представляет собой комплекс пептидов и гликозамингликанов и имеет вид зернистого желеобразного вещества. По аминокислотному составу Сферо®ГЕЛЬ идентичен коллагену, но превосходит его по содержанию гексозаминов в 2 раза, а уроновых кислот – более чем в 15 раз. Размер микрочастиц в Геле от 30 до 300 мкм, набухаемость не менее 87%, рН 4,8–7,2. Среднее время биорезорбции в организме – от нескольких недель до 9 мес., что зависит от места имплантации и размера частиц; выпускается в инъ- екционной форме, в шприцах 1,2 и 5 мл.

ЭластоПОБ® изготавливается в виде пленки или губки ЭластоПОБ®-3D, пористая структура которой получена методом выщелачивания из нанокомпозитного материала на основе бактериального сополимера полиоксибутират-оксивалериат и полиэфира. Среднее время резорбции имплантата в организме – от 6 мес. до 1 года, в зависимости от места имплантации, формы и размеров изделия.

В экспериментальных исследованиях с моделированием у крыс острой ПН (резекция 2/3 печени) и трансплантацией в брыжейку тонкой кишки КИК, изготовленного на основе биополимера ЭластоПОБ® (клетки донорской печени, иммобилизованные на матриксе ЭластоПОБ®-3D) нами было не только констатировано быстрое восстановление нарушенных биохимических показателей поврежденной печени, но и были выявлены в деградирующем матриксе ЭластоПОБ® через 90 сут. после их трансплантации живые клетки с фенотипом гепатоцитов и новообразованные полнокровные сосуды, поддерживающие их жизнеспособность[14].

В опытах с моделированием хронической ПН (затравка CCL4) и имплантацией в поврежденную печень клеточно-инженерных конструкций (КИК) на основе матрикса Сферо®ГЕЛЬ (клетки печени и МСК КМ в отношении 5:1 в биодеградируемом геле Сферо®ГЕЛЬ-лонг) нами было констатировано[41], что имплантация КИК, также как и имплантация суспензии клеток печени (преимущественно гепатоцитов), ускоряет нормализацию биохимических показателей (АлАТ, АсАТ, ЩФ и общий белок крови) поврежденной печени, однако нормализация морфологических показателей печени (снижение количества дегенерированных гепатоцитов, гепатоцитов с липидными включениями, увеличение количества двуядерных гепатоцитов и накопление гепатоцитами гликогена) и степень ее дефиброзирования были более выражены при имплантации КИК. Кроме того, гистологически уже на 90 сут. и далее на всем сроке наблюдения (365 сут.) после трансплантации в печень КИК путём множественных инъекций в паренхиму среди введенных клеток выявлялись активно функционирующие с фенотипом гепатоцитов клетки. Более того, в зонах трансплантации определялись формирующиеся de novo структуры печёночных долек (пролиферирующие гепатоциты, желчные протоки и сосуды), тогда как после трансплантации гепатоцитов в виде суспензии подобных признаков не наблюдалось. Полученные результаты позволили нам заключить, что более высокий уровень и пролонгированные сроки поддержания восстановительной регенерации печени при трансплантации КИК (наблюдение до 1 года) обусловлены созданием в КИК оптимальных условий для пролонгированной жизнедеятельности клеток, включённых в их структуру. Нельзя исключить также, что пролонгированная выживаемость гепатоцитов в КИК обусловлена присутствием в них ММСК КМ, которые формируют как местный, так и общий толерогенный фон в организме реципиента (установлено повышение FoxP3+ Treg клеток)[50].

Между тем на ранних этапах разработки и создания систем «Вспомогательная печень» для более эффективной иммунной защиты донорских гепатоцитов применялись технологии инкапсуляции клеток в альгинат[51]. Было продемонстрировано, что микроинкапсулированные гепатоциты выживали более 3 мес. после их интраперитонеального введения крысе-реципиенту на фоне иммунопротекции; микроинкапсулированные гепатоциты функционировали и компенсировали дефицит функции печени до 4 нед. у животных с моделью токсической печёночной недостаточности[52–54]. Точно так же была протестирована эффективность микросфер в качестве матриксов для гепатоцитов при трансплантации животным с моделями метаболической (энзимной) недостаточности[55] и острой печёночной недостаточности[56].

На культурах клеток печёночных линий было показано, что матриксы не просто служат опорой для клеток – их функции намного сложнее и разнообразнее. Они предназначены обеспечивать роль каркаса и создавать трёхмерную структуру, требуемую для обеспечения клеточной пролиферации, дифференцировки, а также клеточно-матриксных и межклеточных взаимодействий. На культурах клеток печёночных линий была продемонстрирована способность этих клеток к реализации указанных функций при использовании натуральных и синтетических биосовместимых и биодеградируемых материалов, полимеров с белковым покрытием, различных типов нановолокон, в том числе нановолокон с модифицированной поверхностью, матриксов из децеллюляризированных органов, а также показана способность к усилению этих клеточных функций при добавлении в культуральную среду ростовых факторов[57, 58].

При выборе матриксов для тканевой инженерии печени предпочтение отдается наличию у них сходства с 3D-структурой и внутренней архитектоникой нативного внеклеточного матрикса печени[59]. Размер пор и общая пористость матрикса играют важную роль в поддержании специфических функций адгезированных клеток печени. Размер пор влияет на массоперенос кислорода и питательных веществ внутрь носителя и тем самым поддерживает рост, жизнеспособность и функцию клеток в трансплантате. Клетки не мигрируют, если размеры пор матрикса более 500 мкм, поскольку они не распознают поверхность для прикрепления. Каркасы с пористостью от 50 до 150 мкм и большим количеством сообщающихся пор наиболее желательны для культивирования гепатоцитов в биоинженерных конструкциях[60].

Размер пор и общая пористость матрикса должны обеспечивать в нём не только диффузионные процессы (поступление кислорода, питательных веществ, факторов роста, элиминацию продуктов распада), но также осуществлять активный массоперенос-дренаж и доставку кислорода, питательных веществ, регуляторных факторов и удаление продуктов метаболизма за счёт прорастания в него сосудов для долговременного обеспечения биологических свойств и физиологических функций клеток, а также предотвращения их ишемического повреждения и гибели[61].

Первыми такими гепатоподобными функциональными структурами были преваскуляризированные, недеградируемые поливинилалкогольные губки с адгезированными на них гепатоцитами. Такие губки содержали около 5×108 гепатоцитов и этого количества было вполне достаточно для замещения функций печени крысы[62–64]. Полная преваскуляризация конструкции достигалась путем предварительной имплантации полых губок в хорошо васкуляризированные ткани (ткани брыжейки кишки) на срок более недели с последующим заселением гепатоцитами[63].

В более поздних исследованиях ускорения васкуляризации конструкции добивались модификацией её поверхности рекомбинантными факторами роста, такими как VEGF[65, 66], а применение таких конструктов способствовало увеличению выживаемости животных в моделях острой и хронической печёночной недостаточности, в том числе у крупных животных[67, 68].

Показано, что использование 3D-биоматриксов само по себе способствует формированию разветвленной сети сосудистоподобных структур и анастомозов с сосудами реципиента[69], и эти данные служат дополнительным подтверждением предпочтительности использования технологии 3D-культивирования клеток печени в тканеинженерных конструктах[70, 71].

Для ускоренного формирования разветвлённой сети сосудистоподобных структур в конструктах и анастомозирования их с сосудами реципиента было предложено проводить предварительное сокультивирование стволовых и (или) прогениторных клеток человека – клеток печени плода (Human fetal liver cells, hFLCs), эндотелиальных клеток пупочной вены (human umbilical vein endothelial cells, HUVECs) и мезенхимальных стволовых клеток (mesenchymal stem cells, hMSCs) на коллагеново-фибронектиновом матриксе in vitro в течение 48 ч.[72]. В течение этого срока происходило формирование ветвистых структур из эндотелиальных клеток (спрутинг), что позволяло рассматривать формирование этих структур как подтверждение преваскуляризации конструкта. Спустя 10 сут. после трансплантации аналогичных конструктов в ткань головного мозга (или под оболочки) иммунодефицитных мышей можно было через отверстия в черепе наблюдать сформировавшееся сосудистое русло, связанное с сосудами реципиента. К 14 дню hFLCs активно мигрировали в ткани мозга, дифференцировались и проявляли синтетическую функцию (альбумин). После 30 сут. тканеинженерный эквивалент уже имел высокоспецифическую морфологию: тяжистые структуры из гепатоцитов, чередующиеся с синусоидными капиллярами и желчными канальцами. Иммуногистохимический анализ подтвердил совершившуюся дифференцировку клеток плода печени в гепатоциты (выявление синтеза альбумина)[72].

Известен ещё один способ ускоренной васкуляризации трансплантата путем использования биологически васкуляризированного матрикса-каркаса (BioVaSc®). Его получают из децеллюляризированного сегмента тонкой кишки свиньи, который после обработки представляет собой сохранные трубчатые капиллярные структуры в коллагеновой матрице[73]. В целом для обеспечения длительной жизнедеятельности клеток печени и выполнения ими тканеспецифических функций в составе тканеинженерных конструкций матриксы, используемые в этих конструкциях для засева их клетками, должны обладать свойствами, имитирующими регуляторные свойства аутогенного нативного внеклеточного матрикса (рис. 2).

Хотя «идеальные» матриксы всё ещё не созданы, важно, что уже к настоящему времени определены направления поиска для создания матрикса со свойствами, идентичными печёночному внеклеточному матриксу.

Важно также подчеркнуть, что внеклеточный матрикс является предпочтительным субстратом для адгезии и функционирования не только молодых паренхиматозных клеток, но и развивающихся непаренхиматозных (холангиоциты, купферовские, звездчатые, эндотелиальные клетки, pit-клетки и др.) клеток печени. Структура и состав внеклеточного матрикса, в свою очередь, зависят от метаболической активности ансамблей клеток, прикрепившихся к нему, которые за счёт синтеза и секреции внеклеточных матриксных белков могут менять не только состав, но и свойства внеклеточного матрикса, определяя состояние микросреды и микроокружения для всех типов клеток.

Из вышеизложенного следует, что помимо гепатоцитов, чья тканеспецифическая функция нужна прежде всего, необходимо, чтобы все остальные виды непаренхиматозных клеток также присутствовали в составе тканеинженерной конструкции, так как они играют важную роль в поддержании жизнедеятельности гепатоцитов и участвуют в воспроизводстве белков внеклеточного матрикса (фибронектин, ламинин, коллаген и др.)[74]. Обеспечение стереотипического изготовления матриксов с набором и размещением всех клеток печени пока остается нерешённой задачей. К этому следует добавить, что современные стратегии сборки элементов тканеинженерных конструкций печени не обеспечивают наличия в тканеинженерном эквиваленте печени венозной, портальной и желчной сетей. И хотя некоторые исследователи, использующие принцип сборки «снизу вверх» (bottomup – см. выше), сообщают об успешном создании перфузируемой синусоидальной микроархитектуры печени, полученной с помощью микротехнологии[75, 76], такие конструкты очень сложны в производстве и пока непригодны для клинического применения[77]. Иными словами, поиск технологии создания идеального каркаса с синусоидальной микроархитектурой[78], активно производящего регуляторные сигналы[79] для стимуляции длительного выживания и функционирования всех типов клеток в составе имплантируемого тканеинженерного конструкта – продолжается.

2. Cовременные технологии изготовления тканеинженерных конструкций (ТИК) печени

2.1. Способы изготовления микромасштабных тканеинженерных конструкций основаны на применении Bio MEMS-технологий и технологии создания 3D-культуры ткани печени методом наложения

BioMEMS-технология применяется для трехмерного конструирования тканей, в том числе печени, путем культивирования клеток в предварительно организованном пространстве в условиях контролируемого микроокружения (путём пространственного и временного распределения клеток, а также управляемого воздействия биофизических и биохимических факторов на микроуровне). Для этих целей используют микроэлектромеханические системы Bio MEMS, которые уже в настоящее время применяют для проведения биомедицинских исследований (создание кремниевых, стеклянных и полимерных подложек, ДНК и белковых микрочипов и др.)[80], а также тестирования лекарственных средств, хими- ческих и биологических агентов[81].

BioMEMS-технологии могут позволить также конструировать более сложную тканевую структуру печени при использовании микрофлюидных систем. Эти системы характеризуются использованием матриксов с микроканалами для распределения клеток и свободного проникновения кислорода при культивировании в условиях биореактора[82]. При культивировании отдельных типов клеток либо их смесей в микрофлюидных системах формируются сосудистоподобные структуры[83, 84], желчные капилляры, поддерживается активная синтетическая функция гепатоцитов на сроках более 30 сут.[85].

Технология создания 3D-культуры ткани печени методом наложения предусматривает сложение нескольких 2D-слоев клеток и служит для имитации естественной структуры ткани печени. Метод[86] позволяет создать условия для формирования желчных капилляров и «гепатоподобных структур», секретирующих альбумин уже спустя 5 сут.[87] после наложения слоев при культивировании гепатоцитов (малых гепатоцитов) или смеси клеток (малые гепатоциты, звездчатые и эндотелиальные клетки) на пористых мембранах[88].

В последнее время предложен ещё один подход к созданию 3D-культур ткани печени методом наложения. Способ предусматривает изготовление мультикомпонентных гидрогелевых волокон (d≈300 мкм) с клетками и их последующую сборку в трансплантируемые тканеинженерные эквиваленты. Гепатоциты и эндотелиальные клетки, полученные из человеческих iPSCs (индуцированные плюрипотентные стволовые клетки), инкапсулировали в мультикомпонентные волокна, причем для гепатоцитов в состав волокна входила галактоза, а для эндотелиальных клеток – коллаген I типа. На стадии in vitro полученные конструкции помещались в питательную среду для культивирования в течение 8 сут. Затем тканеинженерные эквиваленты, изготовленные методом наложения, пересаживали мышам, подвергшимся резекции 70% печени. В опытах in vivo при моделировании ПН у мышей было продемонстрировано, что присутствие эндотелиальных клеток в тканеинженерных эквивалентах и их расположение в непосредственной близости от клеток паренхимы значительно улучшает функционирование гепатоцитов и способствует васкуляризации трансплантата, в то время как в трансплантате, содержащем только гепатоциты, развитие сосудов не наблюдалось ни на 2, ни на 4 нед. после пересадки[89].

Полагая, что только в 3D-тканеинженерных эквивалентах возможно одновременное поддержание и фенотипа ткани и пролиферации клеток соответствующей ткани при обеспечении их соотношения и пространственного распределения, недавно была предложена новая 3D-органотипическая модель структуры печени в виде сложного двухслойного сэндвича[74]. Эта модель содержит три вида клеток: гепатоциты, клетки синусоидального эндотелия и клетки Купфера в количестве и в соотношении, соответствующем их содержанию в печени in vivo. Клетки располагаются на верхней и нижней поверхности полимерного матрикса-прослойки (на верхней поверхности – синусоидальные эндотелиальные и купферовские клетки, на нижней поверхности – гепатоциты), которая имитирует пространство Диссе, а точнее, создаёт базальную мембрану, для этих клеток. Используемая полимерная прослойка является оптически прозрачной, получена методом самосборки полиэлектролитных биополимерных мультислоёв (PEM) и характеризуется биофизическими свойствами – растяжимостью по модулю Юнга и толщиной (400– 600 нм), сопоставимыми с параметрами нативной ткани. Вся эта сложная конструкция со стороны нижней свободной поверхности гепатоцитов дополнительно укреплена слоем коллагена. Поддержание фенотипа и соотношения всех использованных типов клеток при моделировании этой микромасштабной тканеинженерной конструкции печени по данным авторов продолжалось более 12 сут. культивирования[74].

В ряде работ показано, что для формирования 3D-культуры клеток печени (микромасштабной тканеинженерной конструкции) целесообразно использовать гидрогели из нановолоконной целлюлозы (Growdex, nanofibrillar cellulose, NFC-hydrogel)[90], а также гиалуронан-желатиновый гидрогель Extracel (HG), (CellSystems, Германия)[91], которые способствуют формированию в культуре многоклеточных сфероидов с выраженной апикобазальной полярностью, с функционирующими желчными канальцевыми структурами, и органотипическими клетками печени при засеве этих матриксов или клетками линии Hepa RG (клетки гепатокарциномы человека) или прогениторными клетками печени. Сфероиды сохраняли жизнеспособность и демонстрировали функциональную активность в течение 14 сут. культивирования. И хотя данная модель преподносится авторами как успешная модель печёночной ткани человека для исследования лекарств и химических веществ in vitro, использованные матриксы признаны также подходящими для тканевой инженерии печени[92].

2.2. Технологии изготовления (культивирования и самосборки) среднемасштабных тканеинженерных конструкций печени

Культивирование гепатоцитов в проточном биореакторе на полимерных дисках. Выделенные из печени человека гепатоциты культивировали на дисках в проточном биореакторе в течение 6 сут. Скорость потока питательной среды, подаваемой перпендикулярно поверхности диска, составляла 24 мл/мин. В биореакторе использовали диски размером 18 мм в диаметре и 1 мм толщиной, изготовленные из биодеградируемого матрикса-полимера молочной кислоты (poly-(L-lacticacid), PLLA). Было показано, что при использовании такой технологии из живых гепатоцитов формируются сфероиды диаметром от 50 до 250 мкм со структурой, напоминающей строение печени и с признаками активной синтетической функции этих клеток (синтез альбумина), выраженной детоксикационной активностью (цитохром P-450). На 6 сут. культивирования выявление актиновых филаментов авторы рассматривали как признак формирования желчных капилляров в новообразованных гепатоидных структурах[93].

Культивирование гепатоцитов в проточном биореакторе в условиях микрогравитации. Матриксы, изготовленные из поли-L-молочногликолевой кислоты (PLGA, срок деградации ≈6мес), размером 1х4х5мм были засеяны первичной культурой мышиных гепатоцитов и культивировались в течение 7 и 14 сут. в проточном биореакторе в условиях микрогравитации[94].

Часть тканеинженерных эквивалентов после 7 сут. культивирования была пересажена в брюшную полость NOD-SCID мышей. Показано, что культивирование гепатоцитов в биореакторе в условиях перфузии и микрогравитации существенно улучшает физиологические показатели клеток в сравнении со статичной культурой (исследовали уровень синтеза альбумина, мочевины, активность цитохрома Р-450 в течение 14 сут. культивирования), а также обусловливает более выраженный результат трансплантации образовавшегося конструкта (выраженная васкуляризация конструкта, активный и продолжительный (14 сут.) синтез альбумина гепатоцитами). Полагают,[94] что отчётливо позитивные результаты предварительного культивирования гепатоцитов в условиях перфузии и микрогравитации связаны с активным массопереносом и снижением затрат энергии на преодоление гравитации.

Культивирование трёх видов клеток печени на матригеле. Мелкодисперсный затвердевший гель, содержащий смесь белков базальной мембраны из кожи человека засевали человеческими iPSCклетками, коммитированными в гепатоцитарном направлении (iPSC-derived hepatic endoderm cells, iPSC-Hes) в смеси с человеческими эндотелиальными клетками из пупочной вены (human umbilical vein endothelial cells, HUVECs) и человеческими МСК из костного мозга (human bone marrow-derived mesenchymal stem cells, hMSCs). В течение 48–72 ч. клетки формировали на матригеле устойчивые ассоциаты – «зачатки» печени (iPSC-derived liver bud) размером 4–7 мм. Выращенные in vitro «зачатки» ткани печени гетеротопически имплантировались в организм иммунодефицитных мышей. Лучшие результаты были получены при трансплантации «зачатков» в брыжейку тонкой кишки ближе к печени рядом с воротной веной. В течение 24–48 ч. трансплантат начинал кровоснабжаться, т.к. к этому сроку образовались анастомозы с сосудистой сетью реципиента. Успешная перфузия во многом объяснялась формированием сосудистоподобной сети в условиях in vitro (благодаря присутствию в ассоциате эндотелиальных клеток). В течение 2 сут. после пересадки сосудистая сеть развивалась и созревала, а к 7–14 сут. приобретала органоспецифическое строение. На тех же сроках появлялась активная специфическая синтетическая функция гепатоцитов – синтез альбумина и α-1-антитрипсина. Спустя 30–60 сут. после трансплантации образовавшихся зачатков печень мыши приобретала видо-специфический (человеческий) тип метаболизма лекарственных средств[95].

2.3. Технологии изготовления крупномасштабных тканеинженерных конструкций печени

Технология ЗD-биопечати тканей представляет собой послойную автоматическую (роботизированную) сборку трехмерных функционирующих предварительно сформированных массивов тканей и органных тканеинженерных эквивалентов с использованием клеточных сфероидов или тканеподобных фрагментов в качестве строительных блоков. Благодаря своим размерам, физическим свойствам, форме, контролируемому составу, известным пространственным характеристикам сфероиды или тканеподобные микрокусочки используются в качестве исходного конструкта для автоматизированного распределения или цифрового «впечатывания» их в матриксные слои, например гидрогелевые. После заполнения каждого отдельного матриксного слоя клеточными сфероидами следует их сборка и создание макротканевых структур или органных конструктов с помощью биопринтера[96].

Однако в настоящее время использование технологии биопечати не привело к получению длительно функционирующей тканевой культуры печени: описана лишь методика культивирования смеси клеток на микрочипах (подушечки из акриламидного геля с добавлением белков внеклеточного матрикса) в течение 7 сут., причем для сокультивирования использовалась смесь клеток, состоящая из HepG2, LX-2 (hepaticstellate cells), первичных фибробластов из стенки воротной вены (PFs) и эндотелиальных клеток аорты быка (bovineaortic endothelial cells, BAECs)[97]. Технология децеллюляризации-рецеллюляризации печени. Децеллюляризация целого органа позволяет получить его соединительно-тканный каркас (коллаген I, III, IV типов, фибронектин, ламинин) с сохранной архитектоникой печёночного матрикса: остается практически интактной глиссонова капсула (играет важную роль при перфузии органа), сохраняются каркасы печёночных долек, триад, центральных вен, воротной вены и микропористая структура матрикса паренхимы; сосуды сохраняют диаметр просвета и форму, остается проходимым микрососудистое русло; желчные протоки также остаются практически сохранными, кроме минимальных разрывов в мелких ветвях[98]. Эти же авторы показали, что в (матриксе) децеллюляризированной печени обязательно присутствуют и ростовые факторы, однако, содержание их снижено: VEGF (19%), IGF-1 (13%), HGF (19%) и bFGF (20%), по сравнению с содержанием в нативной печени, принятой за 100%.

Метод создания трансплантатов печени путем децеллюляризации-рецеллюляризации находится на самом раннем этапе его освоения, однако представляется очень перспективным[99,100–102], так как на сегодняшний день максимальный вес свиной печени, поддающейся децеллюляризации, составляет 506±27 г, а такой вес печени после её рецеллюляризации может обеспечить компенсацию печёночных функций[98].

Отмечено, что даже после частичной рецеллюляризации каркаса печени нативными свиными гепатоцитами в перфузируемой органной культуре печени наблюдался синтез альбумина и мочевины. На 4 сут. в перфузируемой культуре уровень альбумина и мочевины был выше, чем в культуре свиных гепатоцитов на коллагеновом слое, но ниже, чем в культуре гепатоцитов в двойном коллагеновом геле[98].

Частично рецеллюляризированная печень крысы сохраняла также белково-синтетическую функцию в течение 5 сут. в условиях непрерывной перфузии, а после пересадки признаки ишемического повреждения гепатоцитов отсутствовали в течение 8 ч.[99].

При заселении каркаса децеллюляризированной печени крысы смесью человеческих эндотелиальных клеток и человеческих фетальных печёночных прогениторных клеток наблюдалась дифференцировка этих клеток в гепатоциты, холангиоциты и эндотелиальные клетки с сохранением микроархитектуры печени и формированием сосудистой выстилки[102]. Изучение состава каркаса с помощью иммуногистохимического анализа выявило сохранение в ней ряда гликозаминогликанов, выступающих в качестве сайтов прикрепления факторов роста, регулирующих клеточный фенотип, миграцию и дифференцировку клеток.

Заключение

Анализ проблемы лечения ПН путём восстановления структуры и функции повреждённой печени убеждает в перспективности её решения путём совершенствования методов клеточной и тканевой инженерии.

Назначение этих методов обеспечить разработку и применение имплантируемых длительно функционирующих клеточно- и тканеинженерных конструкций (КИК и ТИК соответственно) печени, способных стать центрами формирования de novo специализированной ткани печени, для перепрограммирования процессов регенерации в собственной повреждённой печени с заместительного (фиброзирующего) типа на восстановительный (дефиброзирующий) тип. Для выполнения этих функций КИК и ТИК должны содержать оптимальный набор тканеспецифичных малодифференцированных клеток (стволовые и (или) прогениторные паренхиматозные и непаренхиматозные клетки) с высоким потенциалом пролиферации и дифференцировки, которые способны вступать в клеточно-клеточные и клеточно-матриксные взаимодействия, а также регулировать свою тканеспецифическую активность благодаря адгезии на биосовместимом и биодеградируемом 3D-матриксе, выполняющем функции внеклеточного матрикса.

Среди основных групп матриксов при разработке КИК и ТИК предпочтение отдаётся биологическим (фибрин, коллаген) и синтетическим (биополимерным) матриксам (Матригель, Сферо®ГЕЛЬ, ЭластоПОБ®), т.к. они обладают не только биосовместимостью и биодеградабельностью, но и свойствами биостимуляторов. Несмотря на ожидаемую перспективность применения ТИК для возмещения дефицита ткани печени ни одна из проблем изготовления ТИК вспомогательной печени (выбор источников и технологии получения малодифференцированных клеток печени, выбор матриксов и технологии их заселения клетками, выбор технологии изготовления и сборки ТИК и др.) не может считаться окончательно решённой и требует продолжения комплексных исследований.

Подняться вверх сайта