Поиск Кабинет

Прямое наблюдение образования комплекса «холестерин – модель биологической мембраны» методами ЯМР-спектроскопии

Гены & Клетки: Том VII, №3, 2012 год, стр.: 41-48

 

Авторы

Галиуллина Л.Ф., Блохин Д.С., Аганов А.В., Клочков В.В.

ДЛЯ ТОГО ЧТОБЫ СКАЧАТЬ СТАТЬЮ В ФОРМАТЕ PDF ВАМ НЕОБХОДИМО АВТОРИЗОВАТЬСЯ, ЛИБО ЗАРЕГИСТРИРОВАТЬСЯ

Целью данной работы являлось исследование взаимодействия и комплексообразования холестерина и молекул додецилсульфата натрия, взятых в качестве модели биологической мембраны, а также описание комплекса холестерин – додецилсульфат натрия в растворе современными методами спектроскопии ядерного магнитного резонанса.

Спектры ядерного магнитного резонанса были записаны на импульсном спектрометре с Фурье-преобразованием Bruker Avance 500.

Сигналы в 1Н спектрах ядерного магнитного резонанса холестерина, додецилсульфата натрия, а также смеси холестерин + додецилсульфат натрия были соотнесены на основании литературных данных и данных 2D гомо- и гетерокорреляционных экспериментов ядерного магнитного резонанса. Для исследования мицеллообразования додецилсульфата натрия и образования комплекса холестерин+мицеллы додецилсульфата натрия были проведены селективные эксперименты спектроскопии ядерного эффекта Оверхаузера.

Образование мицелл на основе додецилсульфата натрия в растворе диметилсульфоксида было подтверждено данными спектроскопии ядерного эффекта Оверхаузера. Наличие комплекса между холестерином и мицеллами, образованными молекулами додецилсульфата натрия, устанавливалось с помощью одномерных селективных экспериментов спектроскопии ядерного эффекта Оверхаузера. В эксперименте наблюдается эффект Оверхаузера между ОН-группой холестерина и концевыми группами гидрофобной части додецилсульфата натрия, что соответствует их близкому пространственному расположению и наличию комплекса между холестерином и мицеллами додецилсульфата натрия.

На основании экспериментов, проведенных с использованием ядерного магнитного резонанса, было установлено, что додецилсульфата натрия образует в растворе диметилсульфоксида обратные мицеллы при концентрации выше критической концентрации мицеллообразования. Молекулы холестерина образуют межмолекулярный комплекс с мицеллами додецилсульфата натрия путем взаимодействия ОН-группы холестерина с концевыми алифатическими группами СН3-1 и СН2-2 молекулы додецилсульфата натрия. Такое взаимодействие имеет сходство с поведением холестерина в фосфолипидных бислойных мембранах, в которых холестерин проникает своей циклической частью в гидрофобные хвосты фосфолипидных молекул, ориентируясь преимущественно перпендикулярно к бислоям.

Холестерин (холестерол), «холестериновый каркас», представляет собой основу клеточной мембраны, регулирует проницаемость и активность мембранных ферментов, определяет «выживаемость» клетки, образование новых клеток при их делении, то есть играет ключевую роль в биосинтезе и метаболизме клетки [1], следовательно, и в обеспечении жизнедеятельности организма. Количество холестерина в разных его фракциях рассматривается как фактор риска в развитии атеросклероза (холестериновая теория атеросклероза) и, в целом, заболеваний сердечно-сосудистой системы, болезни Альцгеймера [2, 3] и др. Молекулы холестерина гидрофобны и образуют различные молекулярные комплексы с кислотами, белками, аминами, солями, что, вероятно и обуславливает сложности в установлении причинно-следственных связей в исследовании влияния холестерина на организм.

Возможности современных методик ядерномагнитно-резонансной (ЯМР) спектроскопии для исследования структуры и межмолекулярных взаимодействий внутри фосфолипидных мембран все еще сильно ограничены. Время протонной релаксации для фосфолипидных агрегатов мало в шкале ЯМР, что затрудняет такие исследования с помощью наиболее эффективной для подобных целей методики, основанной на использовании ядерного эффекта Оверхаузера. Кроме того, холестерин плохо растворим в воде, а большинство фосфолипидов не растворяются в органических растворителях. В связи с этим актуальной является задача поиска адекватных модельных систем, пригодных для изучения методом спектроскопии ЯМР высокого разрешения. В качестве компоненты такой системы нами был выбран додецилсульфат натрия (ДСН) как модель биологической мембраны.

В отличие от фосфолипидов, которые формируют бислои и мультислои в водных растворах, молекулы додецилсульфата натрия в растворах способны формировать мицеллы – относительно небольшие агрегаты сферической формы, распределенные по всему раствору, что делает ДСН подходящей модельной системой для изучения взаимодействия различных составляющих клеточных мембран и, в частности, холестерина с фосфолипидными мембранами [4–6].

Целью данной работы являлось исследование структуры и свойств молекулярного комплекса: холестерин – додецилсульфат натрия в растворе современными методами ЯМР высокого разрешения.

Материал и методы

Спектры ЯМР были запсаны на импульсном ЯМР спектрометре с Фурье-преобразованием Bruker Avance 500 с частотой 1Н 500,13 МГц, 13С 125,758 МГц с использованием с 5 мм z-градиентного инверсного датчика при температуре 298±0,1 K. Образцы для экспериментов представляли собой растворы холестерина (концентрация 2 г/л), ДСН (концентрация варьировалась от 2 г/л до 80 г/л) и холестерина + ДСН (концентрация холестерина 2 г/л, ДСН – 80 г/л) в смешанном растворителе дейтерированный (степень дейтерирования 98%) ДМСО + Н2О (в соотношении 5:1), приготовленные непосредственно в стандартных 5 мм ампулах (XR-55). Объем каждого из образцов – 500 мкл. Химические сдвиги 1Н и 13С отсчитывали от соответствующих линий метоксильных групп ДМСО (δ 1Н 2,5 м.д., δ 13С 39,5 м.д.).

1Н ЯМР спектры записаны с использованием 90° импульсов длительностью 7.0 мкс и задержкой между импульсами 2 с; ширина спектра sw = 9,4 м.д.

13С ЯМР спектры записаны с использованием 45° импульсов и широкополосной развязки от протонов (длительность импульсов 14.0 мкс, задержка между импульсами 2 с, ширина спектра sw = 200 м.д.). Полное отнесение 1Н ЯМР спектров произведено с использованием 2D COSY, HSQC и HMBC экспериментов. Точность в измерении химических сдвигов 1Н и 13С составляла ± 0,01 м.д. и ± 0,1 м.д., соответственно. Для определения эффектов Оверхаузера проводились селективные 1D NOESY эксперименты [7, 8], для радиочастотного облучения образца использовали импульсы Гауссовой формы. Время между двумя накоплениями NOESY спектров было не менее, чем в три раза больше времени продольной релаксации Т1 для молекул ДСН и холестерина. Использовали времена смешивания 0,05; 0,1; 0,15; 0,2; 0,4; 0,6 и 0,8 с.

Результаты

Одномерная и двумерная ЯМР 1Н и 13С спектроскопия холестерина в растворе

1Н ЯМР спектр холестерина в растворе ДМСО + Н2O приведен на рис. 1. Сигналы в 1Н ЯМР спектре холестерина были соотнесены на основании литературных данных [9] и полученных нами данных 2D гомо- и гетерокорреляционных ЯМР экспериментов 2D COSY, HSQC (рис. 2) и HMBC (рис. 3).

Одномерная ЯМР 1Н и селективная NOESY спектроскопия додецилсульфата натрия

Начальным этапом в этой части исследования были регистрация и анализ ЯМР 1Н спектров ДСН в растворе ДМСО при концентрациях ниже (2 г/л) и выше (80 г/л) критической концентрации мицеллообразования [10]. Далее были получены ЯМР селективные 1D NOESY спектры для растворов ДСН в ДМСО с концентрациями 2 г/л (рис. 4) и 80 г/л (рис. 5).

Одномерная ЯМР 1Н и селективная NOESY спектроскопия комплекса додецилсульфата натрия и холестерина

Эксперименты с растворами ДСН и холестерина проводились при концентрации ДСН 80 г/л, то есть при условиях, когда молекулы ДСН в растворе образовывали мицеллы. Последнее дополнительно контролировалось с помощью 2D NOESY экспериментов. 1Н ЯМР спектры ДСН, холестерина, а также смеси холестерин + ДСН в растворе ДМСО + Н2O представлены на рис 6. Для установления образование молекулярного комплекса между холестерином и мицеллами, образованными молекулами ДСН, были проведены одномерные селективные NOESY эксперименты (рис. 7).

Обсуждение

Образование мицелл на основе додецилсульфата натрия в растворе ДМСО по данным ЯМР NOESY спектроскопии

1Н ЯМР спектры ДСН (рис. 4с; рис. 5с) содержат четыре сигнала – это сигнал от метильной группы СН3-1, разрешены также сигналы от групп СН2-12 тической цепочки (СН2-(2-10)) резонируют в одной области и представляют собой один интенсивный широкий сигнал в районе 1,2–1,25 м.д. Видно, что химические сдвиги сигналов в спектре с большей концентрацией ДСН (80 г/л, рис. 5с) отличаются от химических сдвигов сигналов ДСН в растворе с меньшей концентрацией (2 г/л, рис. 4с). В частности, при увеличении концентрации наблюдается существенный сдвиг сигнала СН2-12 (+0,7 м.д) в слабые поля, положение сигнала СН2-11 практически не изменяется, в то же время сигналы групп СН2-(2-10) и СН3-1 испытывают небольшое смещение (-0,1 м.д.) в сильные поля. Такие изменения химических сдвигов свидетельствуют о появлении межмолекулярных комплексов, которыми являются мицеллы ДСН.

Для исследования образования различных молекулярных комплексов эффективным является использование метода NOESY. Известно, что максимальный наблюдаемый эффект Оверхаузера зависит от времени корреляции молекулярного движения, которое связано с размерами молекул [11, 12]. Эффект Оверхаузера оказывается положительным для малых молекул (молекулярная масса < 600) и отрицательным для больших молекул (молекулярная масса > 1200) [13]. Таким образом, ожидаемый эффект Оверхаузера для мономерной формы ДСН должен быть положительным, а для мицеллярной формы – отрицательным.

При низкой концентрации ДСН (2 г/л) (рис. 4) в спектрах ЯМР селективного 1D NOESY [7, 8] при облучении образца на частоте сигнала группы СН212 наблюдается эффект Оверхаузера для атомных групп СН2-11 и одной из групп, вносящих вклад в интенсивный сигнал СН2-(2-10), которой, вероятнее всего, является группа СН2-10, наиболее близкая по расположению к облучаемому сигналу. При облучении образца на частоте сигнала СН2-11 соответственно наблюдается эффект Оверхаузера для сигналов СН2-10 и СН2-12. Все наблюдаемые эффекты Оверхаузера являются положительными и, следовательно, соответствуют эффектам Оверхаузера для малых молекул, и ДСН при данной концентрации находится в мономерной форме. При высокой концентрации ДСН в растворе ДМСО (80 г/л) (рис. 5) в спектрах селективного 1D NOESY при облучении образца на частоте сигнала группы СН2-12 наблюдается эффект Оверхаузера для сигнала группы СН2-10. При облучении образца на частоте интенсивного сигнала от групп СН2-(2-10) наблюдается отрицательный эффект Оверхаузера и для группы СН3-1 и для группы СН2-11. Это соответствует области эффектов Оверхаузера для больших молекул, следовательно, в растворе ДСН присутствует в мицеллярной форме.

Диметилсульфоксид (ДМСО) представляет собой апротонный органический растворитель, соответственно, в растворе ДМСО молекулы ДСН могут образовывать обратный тип мицелл [14].

Комплексообразование «холестерин – додецилсульфата натрия» в растворе ДМСО по данным ЯМР спектроскопии

Химические сдвиги сигналов ДСН (рис. 6а) и холестерина (рис. 6b) в ДМСО по отдельности практически не отличаются от химических сдвигов тех же сигналов в спектре смеси ДСН + холестерин (рис. 6с). Небольшие отличия наблюдаются лишь для сигналов циклической части холестерина для атомов, наиболее близких к ОН-группе. Это означает, что если в растворе имеет место взаимодействие между молекулами холестерина и мицеллами ДСН, то в нем принимает участие ОН-группа молекулы холестерина.

Наличие молекулярного комплекса «холестерин – мицеллы ДСН» устанавливалось с помощью одномерных селективных NOESY экспериментов (рис. 7) [7, 8]. Радиочастотное облучение образца проводилось на частотах сигналов ДСН и холестерина, не перекрывающихся с другими сигналами: ОН, СН3-18, СН-6 групп холестерина, а также СН2-12 группы ДМСО. При радиочастотном воздействии на образец на частоте сигнала ОН-группы холестерина в селективном 1D NOESY спектре наблюдаются сигнал молекул воды, сигнал от СН3-1 группы ДСН и сигнал от одной из СН2 групп алифатической цепи молекулы ДСН. Вероятнее всего, им является сигнал от СН2-2 группы ДСН, ближайшей к метильной группе СН3-1 ДСН. Это означает, что наблюдается диполь-дипольное взаимодействие ОН-группы холестерина с концевыми группами гидрофобной части ДСН (рис. 7), что соответствует их близкому пространственному расположению и наличию комплекса между холестерином и мицеллами ДСН. Схематическое изображение комплекса приведено на рис. 8.

Данное наблюдение хорошо согласуется с реальными молекулярными системами. При взаимодействии холестерина с фосфолипидными мембранами, он проникает в пространство между гидрофобными «хвостами» фосфолипидных бислоев [15, 16] и, таким образом, близость ОН-группы холестерина и концевых алифатических групп ДСН оказывается аналогичной близкому расположению тех же групп холестерина и атомов алифатических цепочек фосфолипидных молекул. Отличие лишь в том, что в фосфолипидных мембранах холестерин «глубже» проникает в пространство между гидрофобными «хвостами» фосфолипидных молекул, а в модельной системе холестерин взаимодействует практически только с поверхностью мицелл ДСН, о чем свидетельствует отсутствие в 1D NOESY спектре сигналов групп СН2-(3..12) при облучении ОНгруппы холестерина.

Заключение

На основании проведенных ЯМР экспериментов было установлено, что додецилсульфат натрия образует в растворе ДМСО обратные мицеллы при концентрации выше критической концентрации мицеллообразования. Молекулы холестерина образуют молекулярный комплекс с мицеллами додецилсульфата натрия путем взаимодействия ОН-группы холестерина с концевыми алифатическими группами СН3-1 и СН2-2 молекулы додецилсульфата натрия. Такое взаимодействие имеет сходство с поведением холестерина в фосфолипидных бислойных мембранах, в которых холестерин проникает своей циклической частью в пространство между гидрофобными «хвостами» фосфолипидных молекул, ориентируясь преимущественно ортогонально к бислоям.

Подняться вверх сайта