Поиск Кабинет

Проявление иммунокорригирующего эффекта криоконсервированных клеток фетальной печени разных сроков гестации в условиях развития экспериментальной модели реакции «трансплантат против хозяина»

Гены & Клетки: Том V, №3, 2010 год, стр.: 82-86

 

Авторы

Гольцев А.Н., Дубрава Т.Г., Луценко Е.Д., Останкова Л.В., Мацевитая И.Ю., Останков М.В., Сироус М.А., Порожан ЕА., Гольцев КА, Димитров А.Ю.

ДЛЯ ТОГО ЧТОБЫ СКАЧАТЬ СТАТЬЮ В ФОРМАТЕ PDF ВАМ НЕОБХОДИМО АВТОРИЗОВАТЬСЯ, ЛИБО ЗАРЕГИСТРИРОВАТЬСЯ

В работе проведена сравнительная оценка иммунокорригирующей активности криоконсервированных и нативных клеток фетальной печени (КФП) разных сроков гестации в экспериментальной модели локальной реакции «трансплантат против хозяина» (лРТПХ). Индукцию лРТПХ проводили на мышах линии C57BI/6 путем подкожного введения в подушечку задней лапы клеток лимфоузлов (ЛУ) линии СВА/Н. Через 1 сут. после инициации лРТПХ мышам внутривенно вводили нативные (нКФП) или криоконсервированные (кКФП) КФП 14-х или 18-х сут. гестации мышей линии СВА. На 5-е сут. после инициации патологии оценивали следующие показатели: индекс РТПХ, содержание Treg (FoxP3 ', CD4 ' CD25 ' клеток) лимфоузлов (ЛУ) на проточном цитофлуориметре FACS Calibur (Becton Dickinson, США), экспрессию гена tgf-$ — методом ПЦР; содержание ИЛ-2, ИЛ-10, ФНО-а в сыворотке крови животных — иммуноферментным методом на анализаторе Stat Fax 2100 (США). Установлено, что при индукции лРТПХ манифестируются признаки, характерные для заболеваний аутоиммунного генеза. В условиях развития лРТПХ, КФП минимизируют клинические признаки патологии и интенсивность развития иммуновоспалительной реакции. Терапевтическая активность КФП в большей степени коррелировала с содержанием в ЛУ F0XP3+ клеток и экспрессией гена tgf-p, но не содержанием CD4 '/CD25' клеток и степенью их флуоресценции. По мере увеличения срока гестации с 14 пкд к 18 пкд иммунокорригирующая активность КФП снижалась. Однако после криоконсервирования КФП-18 приобретали иммунокорригирующую активность нКФП-14.

Трансплантация аллогенного костного мозга (КМ) обременена одной из серьезных проблем — развитием иммунного конфликта в виде болезни «трансплантат против хозяина»[1 ]. Данная патология имеет ряд признаков аутоиммунного заболевания (АИЗ) и ассоциируется с появлением в организме аутореактивного клона иммунокомпетентных клеток (ИКК), формируемого из донорских стволовых кроветворных клеток (СКК)[2]. Экспериментальным аналогом данного системного АИЗ является локальная реакция «трансплантат против хозяина» (лРТПХ), которую индуцируют введением аллогенных лимфоидных клеток в региональном к месту их введения лимфоузле (ЛУ)[3].

Одной из основных причин развития АИЗ является разбалансировка состояния субпопуляций ИКК с регуляторной активностью[4, 5]. Факт причастности к развитию АИЗ нарушения гемопоэза[2, 6] определил необходимость применения при их лечении препаратов, обладающих способностью комплексно корригировать состояние иммунокомпетентной сферы и гемопоэти-ческого плацдарма[2]. Коррекция иммунокомпетентной сферы при аутоиммунной агрессии предусматривает необходимость подавления эффекторного и (или) активации регуляторного звена ИКК с супрессорной активностью, как основного гаранта обеспечения естественной толерантности. Неоднократно отмечалась

уникальная способность мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК) оказывать гемато- и иммунокорригирующий эффект[7]. Для таких целей используют ММСК, полученные из КМ путем серийных пассажей in vitro[8]. Однако указанная способность ММСК снижается уже через 24—48 ч культивирования, что обусловлено нарушением их метаболических характеристик, появлением признаков старения и (или) апоптоза[9]. Потенциально гема-то- и иммунокорригирующей активностью и, соответственно, возможностью применения для лечения РТПХ, обладает фетальная печень (ФГП, в которой СКК и ММСК являются основными структурными компонентами[2]. Вместе с тем известно, что по мере пролонгации сроков гестации изменяется как компонентный состав, так и функциональный статус клеток фетальной печени (КФП)[10, 11], а, следовательно, вполне реальна возможность изменения и их терапевтического потенциала, в том числе при лечении АИЗ.

Неоднократно отмечалось, что в общем технологическом процессе апликации фетальных тканей в клинической практике обязательным компонентом является их криоконсервирование[12]. Это, прежде всего, обусловлено необходимостью хранения материала и его применения по мере востребованности, а также обязательной сертификации качественных его характеристик и стерильности. При этом известно, что эффективность криоконсервирования биообъекта определяется его исходным структурно-функциональным состоянием[11]. То есть КФП разных сроков гестации, априори имея разный исходный статус и различную криочувствительность, по-разному могут изменять и терапевтический потенциал. Такого рода предположения могут найти подтверждения либо опровержения в экспериментальных исследованиях, включая моделирование различных форм АИЗ.

На основании сказанного, целью исследования была оценка особенностей модуляции субпопуляций регуляторных Т-клеток и в целом иммунокомпетентной сферы животных с лРТПХ после применения нативных и крио-консервированных КФП разных сроков гестации.

Материал и методы

Эксперименты проводили на мышах линий C57BI/6, СВА/Н 3-месячного возраста, массой 22—24 г в соответствии с Международными принципами «Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей»[Страсбург, 1985).

Выделение КФП 14-го (КФП-14) и 18-го (КФП-18) посткоитального дня (пкд), а также клеток взрослой печени (КВП) проводили на рабочей среде 199 с 10% эмбриональной сывороткой коров и 2% цитратом натрия; криоконсервировали по ранее описанной методике[11]. Клетки ЛУ выделяли путем их гомогенизации на той же среде.

Локальную РТПХ (лРТПХ) индуцировали у мышей линии C57BI/6 путем подкожного введения им 2x107 клеток ЛУ мышей линии СВА/Н в объеме 0,1 мл (в рабочей среде) в подушечку задней лапы по общепринятой методике[3]. Контрольным мышам линии C57BI/6 вводили физиологический раствор.

Определение основных показателей лРТПХ: количества клеток в опытном (региональном к месту введения) и контрольном ЛУ, индекса РТПХ (Инд.РТПХ) — отношение количества клеток в опытном ЛУ к контрольному проводили на 5 сут. после инициации патологии[3].

Введение КФП: нативные (нКФП) или криоконсер-вированные (кКФП) КФП разных сроков гестации (КФП-14 или КФП-18) мышей линии СВА вводили после инициации лРТПХ. В качестве контроля вводили КВП в той же дозе.

Фенотипические характеристики клеток ЛУ определяли на проточном цитофлуориметре FACS Calibur (Becton Dickinson, США) с использованием флуорохром-ных (FITC или РЕ) конъюгатов моноклональных антител (BD Bioscience, США) к FoxP3, CD4, CD25 структурам согласно инструкции фирмы-производителя. Помимо процентного содержания FoxP3 + , CD4+CD25+ клеток оценивали степень экспрессии этих молекул по средней интенсивности флуоресценции (СИФ).

Экспрессию гена Cgf-p определяли методом ОТ-ПЦР. Праймер гена Cgf-p был сконструирован на основе базы данных на сайте «GenBank» NCBI BLAST, США и синтезирован в АОЗТ «Медбиосервис» (Киев). Амплификацию фрагментов ДНК проводили в термостате «Терцик» ЗАО «НПФ ДНК-технология» (Россия). Последующие этапы реакции выполняли согласно общепринятым рекомендациям[13]. Детекцию продуктов амплификации и количественный анализ проводили методом капиллярного электрофореза в чип-анализаторе «Agilent 2100» (США). По наличию специфического фрагмента амплификации размером 200—350 пар нуклеотидов судили о присутствии искомого продукта в анализируемом материале. Маркер молекулярных весов, вносимый в отдельную лунку, служил контролем для определения размера фрагментов ПЦР.

Содержание цитокинов: ИЛ-2, ИЛ-10, ФНО-« в сыворотке крови животных с лРТПХ определяли им-муноферментным методом на анализаторе Stat Fax 2100 (США) с помощью наборов реагентов фирмы BD Pharmingen по прилагаемым протоколам.

Индекс суммарной степени отклонения (ССО)[14] использовали для интегральной оценки иммунокорригирующей способности КФП. Индекс выражается в условных единицах и представляет собой сумму значений отклонений исследуемых показателей в процентах от контроля, деленную на 100. Наименьшее значение ССО характеризует лучший эффект КФП при лечении патологии.

Полученные данные статистически обрабатывали по методу Стьюдента с применением компьютерной программы MS Excel.

Результаты и обсуждение

Известно, что в экспериментальной модели лРТПХ, манифестируемая ответная реакция ЛУ на введение аллогенных лимфоцитов является обоюдно направленной реакцией донорских и клеток реципиента. Выраженность инд. РТПХ более 1,5 считается четким свидетельством развития этой реакции[1]. То есть, установленное нами двукратное увеличение инд. РТПХ в сравнении с контролем подтверждает развитие этой реакции. В условиях развития лРТПХ более, чем в три раза снижалась концентрация FOXP3+ клеток (табл.), которые характеризуются как Тгед[15]. Оценка СИФ FOXP3+ клеток продемонстрировала снижение содержания в них FoxP3 белка, концентрация которого, коррелирует с активностью FOXP3+ клеток[15].

На протяжении длительного времени дискутируется вопрос по поводу идентичности пула FOXP3+h CD4+CD25+ клеток, проявления их иммуносупрессивной активности и соподчиненности понятию Т-регуляторные (Тгед) клетки[5]. Как видно, в контроле показатели процентного содержания этих субпопуляций в ЛУ были достаточно близки. Вместе с тем, оценка СИФ по маркеру CD25, имеющему приоритетную значимость для включения этих клеток в категорию Тгед, показала, что она в 3 раза уступала СИФ FOXP3+ клеток. При этом видно, что при лРТПХ эти показатели снижались в 1,6 и 2,1 раза для CD4+CD25+, FOXP3+ клеток соответственно.

Известно, что в реализации супрессорной функции Тгед активное участие принимает трансформирующий ростовой фактор-p (TGF-p)[16]. Этот медиатор индуцирует экспрессию рецептора ИЛ-2 (CD25) и гена белка FoxP3 в CD4+/CD25 Т-хелперах, переводя их в категорию Тгед. Полученные нами результаты показали снижение в условиях развития лРТПХ степени экспс контролем.

Как и для многих АИЗ, в том числе и системных[17], при лРТПХ было отмечено перераспределение ци-токинового профиля организма (см. табл.). Так, повышался уровень воспалительных цитокинов ФНО-а, ИЛ-2 и снижался уровень противовоспалительного ИЛ-10.

КФП, как препарат лечения лРТПХ, оказывали выраженный корригирующий эффект в отношении всех исследуемых показателей. Как следует из рис. 1, инд. РТПХ в наибольшей степени приближался к уровню контроля у животных после применения нКФП-14 и кКФП-18. Интересно, что до криоконсервирования КФП-18 проявляли более низкий корригирующий эффект, тогда как КФП-14 после криоконсервирования теряли его.

Насколько изменение клинических признаков лРТПХ в виде инд. РТПХ коррелирует с изменением показателей иммунокомпетентной сферы организма реципиентов? Результаты показали, что максимальная коррекция процентного содержания FOXP3+ клеток наблюдалась также после введения нКФП-14 и кКФП-18 (рис. 2А). Однако обращает на себя внимание тот факт, что после применения кКФП-18 СИФ в FOXP3+ клетках была почти в 1,5 раза ниже, чем после введения нКФП-14. Бесспорно, что кКФП-18 активируют формирование Тгед, которые идентифицируются цитофлуори-метрически как FOXP3+ клетки, но с более низкой концентрацией скурфина[5]. Еще более удивительными оказались результаты оценки «индуцибельного» потенциала в отношении этих показателей нКФП-18. Корригирующий их эффект был минимальным, судя по процентному содержанию FOXP3+ клеток, однако по СИФ он имел максимальную выраженность.

Иная картина наблюдалась при анализе содержания CD4+CD25+Т-лимфоцитов (рис. 2Б). Известно, что эти клетки предупреждают развитие заболеваний аутоиммунного генеза, в системе in vitro ингибируют эффек-торные клетки, проявляют ряд других иммуносупрес-сивных эффектов и также входят в когорту Тгед[5,15]. Однако в условиях развития лРТПХ и применения КФП их поведение существенно отличалось от FOXP3+ клеток. Во-первых, не было обнаружено, как для FOXP3+ клеток, «синхронизированного» проявления корригирующего эффекта нКФП-14 и кКФП-18. Кроме того, была очевидной превалирующая «индуцибельность» в отношении повышения концентрации CD4+CD25+ клеток криоконсервированных КФП. Такого рода феноменология могла быть обусловлена имеющими в некоторых случаях место изменениями после криоконсервирования иммуногенных характеристик аллогенного материала[2] и возможной активации субпопуляции клеток реципиента с низким профилем экспрессии рецептора ИЛ-2 (CD4+CD25|0W), которые функционально не являются Тгед[5]. Однако, СИФ этих клеток по CD25 маркеру в группах животных с введением криоконсервированных КФП не существенно отличался от его уровня у контрольных (интактных) мышей. Более того, мы наблюдали почти такой же эффект и после введения сингенных криоконсервированных кКФП-14 и кКФП-18 (данные не представлены). Как приведено в работе[5], формирование CD4+CD25+ регуляторных клеток в периферическом отделе ИС может реализоваться путем «передифференцировки» CD4+CD25~ клеток в Тгед с фенотипом CD4+CD25+FOXP3 + . В таком случае, потенциал индукции экспрессии маркера ИЛ-2 у КФП (вне зависимости от срока гестации) после криоконсервирования становится более выраженным.

Весьма интригующими оказались данные оценки степени экспрессии гена tgf-fi, которая, как видно из рис. 3, в большей мере коррелировала с характером восстановления содержания не CD4+CD25+ клеток, а FOXP3+ Treg. Как известно, TGF-p играет важную роль в развитии и реализации супрессивной функции Treg в периферическом компартменте ИС[161] и представляет собой один из основных триггеров экспрессии l/in-2R. Эту активность TGF-p реализует в тесной кооперации с незрелыми дендритными и некоторыми другими клетками, для которых он является и ауток-ринным фактором[161]. Особую значимость, при этом, играют элементы стволового компартмента стромы, прежде всего, упоминавшиеся выше ММСК[7]. Архиважным компонентом иммуномодулирующей активности ММСК является вырабатываемый ими уникальный по своему потенциалу фермент индоламин 2, 3-диокси-геназа (ИДО), которому принадлежит ключевая роль в активации супрессорного звена ИС[18]. Ранее мы отмечали, что после криоконсервирования такого рода активность ММСК в КФП может изменяться, и приводили возможные предположения такого рода изменений[12]. Недавно нами была подтверждена активация гена ИДО в ФП мышей 18 сут. гестации после криоконсервирования(работа в печати). Похоже, что различный характер модификации содержания в ЛУ FOXP3 + , CD4+CD25+ клеток после применения кКФП разных сроков гестации подтверждает возможность реализации событий по такому вектору. Эти данные также говорят о том, что криоконсервирование в одном и том же режиме в зависимости от срока гестации КФП может индуцировать либо экспрессию новых, либо ингибировать действие уже имеющихся активных начал, точкой приложения которых могут быть сигнальные пути наработки FoxP3 белка и (или) ИЛ-2Р.

Не удивительно, что модификация состояния субпопуляций регуляторных клеток после применения КФП находит свое отражение и в изменении цитокинового профиля организма in general (рис. 4). Представленные на этом рисунке данные позволяют получить информацию об интегральном ответе иммунокомпетентной сферы мышей с лРТПХ на КФП и оценить, какие из этих показателей в наибольшей мере коррелируют с улучшением клинического статуса животных. Итак, в очередной раз подтверждено, что максимально выраженный эффект коррекции оцененных показателей наблюдается после применения нКФП-14 и кКФП-18. Очевидно, что интегральный корригирующий эффект присущ именно фетальному материалу, так как введенные в качестве контроля клетки взрослой печени (КВП) не обладали такой активностью.

Выводы

Установлено, что при индукции лРТПХ манифестируются признаки изменения состояния иммунокомпетент-ной сферы организма, характерные для заболеваний аутоиммунного генеза. Очевидно, что лечебный эффект КФП, сопровождающийся минимизацией клинических признаков данной патологии и интенсивности развития иммуновоспалительной реакции, реализуется через коррекцию состояния субпопуляций ИКК с регуляторной активностью dreg). Терапевтическая активность КФП в большей степени коррелировала с восстановлением количественного содержания в ЛУ FOXP3+ клеток и экспрессией гена tgf-fi, но не содержанием CD4+CD25+ клеток и степенью их флуоресценции. По мере увеличения срока гестации с 14 пкд к 18 пкд им-муннокорригирующая активность КФП снижалась. Однако после криоконсервирования КФП-18 приобретали иммунокоррегирующую активность нКФП-14.

Подняться вверх сайта