Поиск Кабинет

Пролиферация и дифференцировка предшественников миелоидного ростка кроветворения пуповинной крови человека при экспансии in vitro

Гены & Клетки: Том VII, №1, 2012 год, стр.: 40-48

 

Авторы

Петёвка Н.В., Гончарова Н.В., Северин И.Н., Космачева С.М., Потапнёв М.П.

ДЛЯ ТОГО ЧТОБЫ СКАЧАТЬ СТАТЬЮ В ФОРМАТЕ PDF ВАМ НЕОБХОДИМО АВТОРИЗОВАТЬСЯ, ЛИБО ЗАРЕГИСТРИРОВАТЬСЯ

Исследованы закономерности пролиферации и дифференцировки в миелоидном направлении CD34+-популяции клеток пуповинной крови человека при экспансии in vitro над монослоем мультипотентных мезенхимных стромальных клеток костного мозга (ММСК КМ) и без него в бессывороточной среде под воздействием рекомбинантных факторов IL-3, IL-6, SCF и Flt3/l.

Из пуповинной крови здоровых рожениц (n = 4) выделяли фракцию мононуклеарных клеток (MK), часть которой обогащали CD34+ клетками, методом положительной иммуномагнитной сепарации (CD34об). Экспансию in vitro обеих фракций проводили в течение 2 нед. По мере роста клетки рассевали на новые площади. Экспрессию CD34 и CD45 определяли методом проточной цитофлуориметрии, субпопуляции миелоидных предшественников – колониеобразующим тестом.

За две недели культивирования количество CD34+ клеток фракции МК увеличилось в 70±29 раз без подложки и в 980±414 раз на подложке. Прирост CD34+ клеток в СD34об фракции достоверно не отличался от такового в МК. В течение первой недели экспансии субпопуляционный состав предшественников не менялся, на второй неделе – гранулоцитопоэз превалировал над эритропоэзом. Мониторинг экспрессии CD34 и CD45 показал существование двух популяций кроветворных клеток, одна из которых теряет CD34 на первой неделе экспансии, другая – только на второй. Подложка ММСК КМ способствует достоверно большему (р < 0,05) увеличению количества CD34+ клеток и колониеобразующих единиц в сравнении с вариантами культивирования без подложки и вызывает их перераспределение между суспензионной и адгезированной фракциями клеток. С ММСК связываются преимущественно либо эритроидные, либо мультипотентные предшественники. Для экспансии мультипотентных предшественников миелоидного ряда оптимальным является культивирование CD34об фракции клеток на подложке ММСК КМ в период до одной недели со средней кратностью увеличения ядросодержащих клеток – 56±32 раз, CD34+ клеток – 36±15 раз, мультипотентных предшественников – 45±18 раз, всех КОЕ – 60±11 раз.

Использование пуповинной крови при лечении онкогематологических заболеваний имеет ряд преимуществ: её легче заготовить, нет риска для донора, она практически не содержит активированные Т-лимфоциты, что снижает реакцию трансплантат против хозяина (РТПХ) и позволяет проводить успешные аллогенные трансплантации даже при несовпадении по одному-двум локусам гистосовместимости [1]. Успешное приживление гемопоэтического трансплантата зависит от количества и качества как гемопоэтических стволовых клеток (ГСК), дающих начало лимфоидному и миелоидному росткам кроветворения, так и от более дифференцированных клеток-предшественниц. Долговременные результаты репопуляции трансплантата обеспечиваются ГСК и зависят от их количества и функции, в то время как ранний период восстановления кроветворения обеспечивается клетками-предшественницами миелоидного ряда, от которых зависит быстрое восстановление уровня нейтрофилов и тромбоцитов [2, 3]. Скорость восстановления эритроидного и мегакариоцитарного ростка кроветворения также коррелирует с содержанием общих миелоидных и (или) мегакариоцитарноэритроидных предшественников [4].

Поверхностный антиген клеток CD34 является наиболее часто используемым маркером для оценки пригодности и вероятности успешного приживления трансплантата кроветворных клеток в онкогематологии [2, 5, 6]. Как правило, этот маркер ассоциируют с активностью и функцией ГСК. Однако, большинство клеток в общей CD34+ популяции костного мозга (более 90%) и пуповинной крови человека (более 99%) являются клетками-предшественницами [7]. Примитивные ГСК могут вообще не экспрессировать CD34 [8]. Таким образом, клиническое значение CD34+ популяции клеток в гемопоэтических трансплантатах может быть связано не столько с количеством ГСК, сколько с количеством репопулирующих клеток-предшественниц.

Считают, что пуповинная кровь содержит достаточно ранних ГСК, способных обеспечить полное долговременное восстановление кроветворения взрослого пациента [1]. Проблемой таких трансплантаций скорее является малое абсолютное число предшественников, что приводит к длительному периоду цитопении после миелоаблативного кондиционирования и является одной из причин летальности пациентов в посттрансплантационном периоде [9].

Клетки-предшественницы миелоидного ряда в отличие от ГСК можно выявить по колониеобразованию в полужидкой среде. Среди них различают линейно коммитированные, которые уже необратимо определились как предшественницы клеток крови одного типа, бипотентные гранулоцитарно-моноцитарные или мегакариоцитарно-эритроидные, и общие миелоидные мультипотентные предшественники, выявляемые по смешанным колониям гранулоцитов, эритроцитов, моноцитов и мегакариоцитов (КОЕ-ГЭММ). Как правило, количество КОЕ в трансплантатах костного мозга и периферической крови прямо коррелирует с количеством СD34+ клеток, однако показано, что в случае низкого (менее 2×106/кг) содержания СD34+ клеток прогностическим критерием, наиболее точно коррелирующим со скоростью выхода из посттрансплантационной цитопении, является количество КОЕ [2, 4].

Одним из эффективных решений проблемы так называемой клеточной недостаточности трансплантата, является наращивание (экспансия) CD34+ клеток ex vivo [10]. Пролиферация, самоподдержание, дифференцировка и выживаемость кроветворных клеток зависят от микроокружения. В костном мозге таким микроокружением (так называемой «нишей» стволовых клеток) выступают негемопоэтические стромальные клетки, которые с помощью растворимых факторов и межклеточных контактов регулируют самообновление и дифференцировку пула ГСК [11, 12]. Предполагается, что интенсивно изучаемые в последнее время мультипотентные мезенхимные стромальные клетки (ММСК) костного мозга дают начало клеткам стромы, поддерживающим гемопоэз [13]. Для экспансии кроветворных клеток используют смеси ростовых факторов, непременными компонентами которых являются выделяемые ММСК цитокины: фактор роста стволовых клеток (stem cell factor, SCF), интерлейкин-6 (IL-6), интерлейкин-3 (IL-3), колониестимулирующие факторы гранулоцитов и макрофагов и другие. Ряд исследователей предпочитают вместе с добавляемыми цитокинами использовать и сами ММСК костного мозга в качестве подложки, моделируя, таким образом, in vitro аналог костномозговой ниши [14]. Тем не менее, очевидно, что ex vivo пока не удаётся воспроизвести условия естественного костномозгового микроокружения.

Целью настоящей работы являлось исследование закономерностей пролиферации и дифференцировки в миелоидном направлении CD34+ популяции клеток пуповинной крови человека при экспансии in vitro над монослоем ММСК костного мозга и без него для определения ключевых условий культивирования в бессывороточной среде, влияющих на наращивание субпопуляций предшественников миелоидного ряда.

Материал и методы

Выделение мононуклеарных и CD34+ клеток пуповинной крови человека

Получение пуповинной крови производили с письменного информированного согласия рожениц в областном роддоме г. Минска. Контейнеры для сбора компонентов крови в качестве антикоагулянта содержали гепарин. Мононуклеарные клетки (МК) получали методом центрифугирования в течение 30 мин при 400g на градиенте плотности фиколла 1,077 (Ficoll-Paque PLUS, GE Healthcare). Собранные МК дважды отмывали раствором Хэнкса (StemСell Technologies, Канада), содержавшем 2% эмбриональной телячьей сыворотки (Hyclone, США). Обогащенную CD34+ клетками фракцию МК (CD34об) получали с помощью набора EasySep для положительной иммуномагнитной селекции (StemСell Technologies, Канада), согласно инструкции производителя. Чистоту CD34об фракции оценивали с помощью проточной цитофлуориметрии.

Получение ММСК костного мозга человека

Эксплантацию костного мозга выполняли в центре трансплантации органов и тканей на базе УЗ «9-я ГКБ» г. Минска. ММСК костного мозга получали, как описано ранее [15]. Фенотип полученных ММСК, определённый методом проточной цитофлуориметрии, был следующий: CD34–/CD45–/CD105+/CD90+. Для получения подложки клетки второго или третьего пассажей растили до 100% конфлюэнтности, затем обрабатывали митомицином С (10 мкг/мл, Sigma-Aldrich, США) в течение 2,5 ч при температуре 37°С с последующей двукратной отмывкой клеток питательной средой.

Экспансия CD34+клеток пуповинной крови in vitro

МК и CD34об фракцию каждого образца пуповинной крови высевали в количестве 5×104 и 1×104 кл/лунку соответственно в 24-луночные культураль ные планшеты (Sarstedt, Германия) в триплетах и культивировали в бессывороточной среде StemSpan (StemСell Technologies, Канада). В питательную среду добавляли смесь рекомбинантных ростовых факторов: интерлейкин-3 (IL-3), 20 нг/мл, интерлейкин-6 (IL-6), 20 нг/мл, фактор стволовых клеток (SСF), 50 нг/мл, лиганд тирозинкиназы-3 эмбриональной печени (Flt3-l), 100 нг/мл (все факторы производства StemСell Technologies, Канада). Для каждой фракции клеток использовали два варианта культивирования: на фидере из ММСК костного мозга и без него. Культивирование проводили в течение 2 нед. при температуре 37°С и 5% СО2. По мере увеличения концентрации клеток более чем 5×105/мл культуру рассевали на новые лунки и добавляли среду с факторами. На 1-й, 7-й и 12-й или 14-й день проводили иммунофенотипический анализ клеток, колониеобразующий тест и параллельно вели подсчет ядросодержащих клеток (ЯСК) с трипановым синим.

Иммунофенотипический анализ клеток

Оценка фенотипа ММСК костного мозга и ГСК производилась моноклональными антителами к CD90 (кат. № IM1840), CD105 (кат. № AO7414), CD34 (кат. № IM1250U), конъюгированными с фикоэритрином (PE), и СD45, конъюгированными с флуоресцеин-изотиоцианатом (FITC) (кат. № 0647), (все Beckman Coulter, Immunotech, Франция) в соответствии с рекомендациями изготовителя. Для коррекции неспецифического окрашивания в образцы вносились блокирующие Fc-рецептор реагенты. Неспецифическое окрашивание оценивали по связыванию клетками конъюгатов IgG1-FITC (кат. № IM0639U) и IgG1-PE (кат. № IM0670U) (Beckman Coulter, Франция). Аналитическую цитометрию проводили на проточном цитофлуориметре FACScan (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA) с 15 мВт аргон-ионным лазером (длина возбуждения 488 нм), используя программу СELLQuest Software (BD). Популяции клеток оценивали после выделения логического ограничения в двумерной гистограмме по их линейному и боковому светорассеиванию (степень чистоты не менее 95%). Для расчета процентного содержания флуоресцентно меченых клеток и интенсивности флуоресценции использовали статистический пакет программы СELLQuest. Для каждого образца анализировалось не менее 50 тыс. клеток.

Колониеобразующий тест

Дифференцировочный потенциал гемопоэтических клеток-предшественниц исследовали методом колониеобразующего теста в полужидкой среде с цитокинами (MethoCult GF+ H4435, Stem Cell Technology, Канада) в соответствии с инструкцией производителя. Клетки вносили в 35-миллиметровые чашки в дуплетах в концентрациях от 5×102 до 1×104 клеток на чашку в зависимости от варианта культивирования и времени экспансии.

Результаты

Исследование проводили в среде, не содержащей сыворотку крови животных или человека, чтобы избежать влияния неконтролируемых активных компонентов сыворотки, а также учитывая перспективу использования метода для медицинской практики. Исследовали одновременно четыре варианта культивирования для каждого из образцов пуповинной крови. Фракцию МК и выделенную из части полученных МК положительной иммуномагнитной сепарацией CD34об фракцию клеток пуповинной крови параллельно культивировали в присутствии одной и той же смеси ростовых факторов на подложке ММСК костного мозга и без него.

Вариант 1: МК (5×104 кл/лунку) в смеси ростовых факторов.

Вариант 2: МК в условиях варианта 1 на подложке из ММСК костного мозга.

Вариант 3: CD34об фракция (1×104 кл/лунку) в смеси ростовых факторов.

Вариант 4: CD34об фракция в условиях варианта 3 на подложке из ММСК костного мозга.

На 3–5-й день культивирования увеличение количества клеток было очевидно при наблюдении под микроскопом во всех вариантах культивирования. На фотографиях представлены 4-й (рис. 1 А–Г) и 2-й (рис. 1 Д) варианты культивирования гемопоэтических клеток. При экспансии на подложке ММСК большая часть (около 2/3) гемопоэтических клеток оставалась в неприкреплённом состоянии как суспензионная культура. Около трети гемопоэтических клеток можно было открепить с поверхности лунки только вместе с ММСК обработкой раствором трипсин-ЭДТА. Прикреплённые к подложке клетки располагались в двух уровнях: на подложке (круглые, выпуклые клетки) и под подложкой (плоские, так называемая «булыжная мостовая», рис. 1В, Г). При рассеве пролиферирующих клеток, находящихся над подложкой, часть клеток прикреплялась к новой подложке и продолжала пролиферировать под воздействием ростовых факторов, что указывает на экспрессию молекул адгезии клетками суспензионной фракции. В свою очередь, над отмытыми прикреплёнными к подложке гемопоэтическими клетками вскоре появлялась суспензионная фракция в тех же условиях.

По темпам прироста общего количества ядросодержащих клеток (ЯСК) СD34об фракция значительно превосходила фракцию МК (рис. 2А). Так, при культивировании в присутствии только ростовых факторов содержание ЯСК в СD34об. фракции через 12 дней увеличивалось в среднем для 4 образцов крови в 80 раз, тогда как в МК фракции их количество за этот период выросло только в 27 раз. При культивировании клеток на подложке ММСК кратность увеличения ЯСК была гораздо выше, но наблюдаемая закономерность сохранялась. Содержание ЯСК фракции МК в среднем увеличилось за 12 дней в 80 раз, СD34об фракции – более чем в 1000 раз (рис. 2А). Так как значительную часть фракции МК исходно составляли зрелые клетки, а содержание СD34+ клеток было невелико, полученные результаты закономерны.

Иная зависимость наблюдалась при анализе популяции CD34+ клеток методом проточной цитофлуориметрии. В течение первой недели культивирования в МК фракции их доля выросла с 1,3±0,5% до 33±6% без подложки и до 61±6% на подложке из ММСК костного мозга, а после 2 нед. культивирования значительно снизилась (рис. 2Б). Мониторинг прироста CD34+ клеток показал, что в целом, за 2 нед. их количество в МК фракции увеличилось для различных вариантов экспансии (вариант 1 и 2) в среднем в 70±29 и 980±414 раз соответственно (рис. 2В). В СD34об фракции доля CD34+ клеток снижалась в течение всего периода культивирования. Относительное содержание CD34+ клеток коррелировало (r = 0,88) с относительным содержанием КОЕ для всех вариантов культивирования (рис. 2Б, Г). При этом общий прирост CD34+ клеток в СD34об фракции на подложке ММСК достоверно не отличался от такового в МК фракции, культивируемой в аналогичных условиях, и составил за 12 дней 1026±460 раз (рис. 2В). В целом, увеличение популяции СD34+ клеток в МК фракции оказалось сопоставимым с приростом в СD34об фракции и было значительным. Известно, что зрелые клетки крови, присутствующие в мононуклеарной фракции, могут выделять ингибиторы пролиферации ГСК и клеток-предшественниц, такие как фактор некроза опухолей-α, трансформирующий фактор роста−β и др. [16]. Однако, ингибирующее воздействие в данном случае могло быть нейтрализовано избытком ростовых факторов в расчете на небольшое исходное содержание СD34+ клеток в МК фракции.

Анализ экспрессии CD34/CD45 антигенов показал, что исходно CD34+ популяция клеток пуповинной крови характеризуется очень слабой экспрессией панлейкоцитарного антигена CD45 (рис. 3А, Б). Низкая экспрессия CD45RA связывается многими исследователями с присутствием либо ГСК, либо коммитированных предшественников эритропоэза. Клетки с высокой экспрессией CD45 обогащены грануломоноцитарными предшественниками [17]. По мере экспансии уровень экспрессии CD45 на неприкреплённых гемопоэтических клетках увеличивается для всех вариантов культивирования (рис. 3 В–К, 4А). При анализе гемопоэтических клеток, откреплённых вместе с ММСК обработкой трипсин-ЭДТА, на двумерной гистограмме вновь обнаруживается небольшая фракция по уровню экспрессии CD34/CD45 антигенов аналогичная исходно выделенным клеткам пуповинной крови (рис. 3А, Б, Л, М).

Экспрессия CD34 меняется иным образом. В течение первой недели экспансии уровень экспрессии CD34 для части клеток усиливается, для другой части, наоборот, падает, что хорошо видно на приведенной гистограмме (рис. 4Б). Потеря CD34 антигена сопровождается появлением популяции более зрелых, скорее всего дифференцированных клеток с фенотипом CD45+/CD34– (рис. 3В–К). Подобный характер распределения CD34 маркера может указывать на существование двух популяций кроветворных клеток – ранней и более поздней, культивирование которой сопровождается дифференцировкой, в то время как более ранние предшественники начинают дифференцироваться только в течение второй недели экспансии, что подтверждается падением уровня экспрессии CD34 на большинстве клеток (рис. 3Ж–К).

Для каждого из проанализированных четырёх образцов пуповинной крови кратность увеличения ЯСК на подложке была больше чем без нее. При этом доля CD34+ клеток была выше при экспансии над подложкой в обеих культивируемых фракциях (рис. 2Б). Представленные данные одного из экспериментов (рис. 3) убедительно демонстрируют более выраженное падение экспрессии СD34 на клетках, культивируемых без подложки из ММСК костного мозга. Так, доля CD45+/CD34– клеток на 6-й день культивирования без подложки ММСК приближалась к 50% и 47% для разных фракций клеток крови (рис. 3В, Г), тогда как при экспансии над подложкой она равнялась 35% и 20% соответственно (рис. 3Д, Е). Большая часть культивируемых с ММСК клеток была положительна по CD34 маркеру.

Наиболее функциональным тестом, подтверждающим экспансию клеток-предшественниц миелоидного ряда, является колониеобразующий тест в полужидкой среде на основе метилцеллюлозы в присутствии факторов, стимулирующих дифференцировку гранулоцитов, макрофагов и эритроцитов. Наблюдаемая динамика увеличения общего количества КОЕ аналогична динамике прироста CD34+ клеток (рис. 5А). Положительное влияние подложки на экспансию предшественников также прослеживается в этих тестах. При этом не наблюдалось достоверной разницы по приросту всех КОЕ для МК и CD34об фракций клеток в параллельных вариантах культивирования.

В то же время анализ прироста мультипотентных предшественников выявил достоверное (p < 0,05) отличие между МК и CD34об фракциями клеток. Наилучшим вариантом экспансии КОЕ-ГЭММ оказалось культивирование CD34об фракции клеток пуповинной крови на подложке ММСК костного мозга. Увеличение количества мультипотентных предшественников на фидере происходило в среднем почти на порядок быстрее, чем без него: в 45 и 5 раз соответственно на первой неделе, и в 396 и 46 раз соответственно на второй (рис. 5Б). Для фракции МК общий прирост КОЕ-ГЭММ был намного ниже: в среднем 3 против 1,2 раза через одну неделю культивирования и 30 против 15 раз спустя две недели (рис. 5Б). Таким образом, ключевыми условиями экспансии мультипотентных предшественников является отсутствие в культуре зрелых мононуклеаров и присутствие стромальных клеток.

Экспансия клеток пуповинной крови в течение одной недели не привела к достоверным изменениям субпопуляционного состава КОЕ во всех вариантах культивирования (рис. 6А). На второй неделе выявлена воспроизводимая во всех случаях закономерность: вместе с абсолютным количеством увеличивается относительное процентное содержание предшественников гранулоцитов и макрофагов. Их доля достигает 80% и более от общего количества экспансированных КОЕ. Соответственно, доля предшественников эритроидного ряда в популяции снижается (рис. 6А).

Данная тенденция фиксировалась для всех вариантов культивирования (данные не представлены). Интересно, что на перераспределение предшественников в динамике экспансии в сторону гранулоцитарно-макрофагального ростка влияет исходная концентрация культивируемых CD34+ клеток [18]. Показано, что низкая начальная концентрация ГСК способствует стимуляции эритропоэза, более высокая – гранулоцитопоэза, вплоть до полной дифференцировки в нейтрофилы. В таком случае, увеличение концентрации клеток в статичной культуре, несмотря на периодический рассев, по мере культивирования должно приводить к повышению доли предшественников гранулоцитов и макрофагов.

Анализ распределения коммитированных предшественников между суспензионной и адгезированной с ММСК популяциями клеток пуповинной крови показал, что в прикреплённом состоянии находятся преимущественно линейно коммитированные и мультипотентные предшественники эритроцитов, а на второй неделе и макрофагов, тогда как суспензионная фракция клеток обогащена коммитированными предшественниками гранулоцитов (рис. 6Б). Таким образом, подложка ММСК вызывает перераспределение предшественников миелодного ряда между суспензионной и адгезированной фракциями клеток. Со стромальными клетками связываются преимущественно либо эритроидные, либо ранние мультипотентные предшественники, также обладающие эритроидным потенциалом (рис. 6Б). Кроме того, под ММСК могут находиться ГСК, колонии которых мы обнаружить не можем. Полученные результаты согласуются с данными по экспрессии панлейкоцитарного маркера СD45 суспензионной и адгезированной фракциями клеток.

Обсуждение

На пролиферацию, дифференцировку и апоптоз незрелых клеток при экспансии in vitro могут повлиять как сочетание добавляемых цитокинов и питательных веществ, так и состав и концентрация самих культивируемых клеток [19]. В статичных культурах эти параметры постоянно меняются во времени и зависят от ручных манипуляций по замене среды и добавлению ростовых факторов. Экспансия с различной эффективностью может проходить в биореакторах или газопроницаемых пакетах, в контакте со стромальными элементами или только с выделяемыми ими факторами. Неудивительно, что при анализе научных публикаций, посвященных экспансии стволовых клеток, мы видим большой разброс полученных результатов [20]. Исследователи отмечают увеличение количества апоптотических клеток, изменение экспрессии поверхностных маркеров, характерное для тех или иных условий культивирования, падение экспрессии маркеров незрелых клеток и маркеров адгезии [10]. Пока нет однозначных данных ни об оптимальном сочетании ростовых факторов, сокультивируемых клеточных субпопуляций, среды и сыворотки, ни о временных параметрах экспансии. Большинство исследований сосредоточено на подборе компонентов ростовых смесей, тогда как в костном мозге самообновляющиеся и дифференцирующиеся клетки имеют возможность мигрировать в отдельные компартменты, получая ограниченные сигналы и необходимые контакты. Передача сигналов в условиях костномозговой ниши представляется более упорядоченной, чем это можно соблюсти в условиях культуры ex vivo.

В наших экспериментах показано, что в присутствии SCF, IL-3, IL-6 и Flt3/l и в условиях периодического рассева культуры в период до одной недели удаётся в десятки раз (в среднем от 2 до 36 для различных вариантов) увеличить количество CD34+ клеток, сохранив субпопуляционный состав предшественников. Кроме того, в течение этого периода уровень экспрессии CD34 на значительной части размноженных клеток повышается, что указывает на присутствие самых ранних гемопоэтических предшественников с высоким пролиферативным потенциалом [21]. По этим причинам временной интервал до одной недели экспансии представляется наиболее оптимальным в этих условиях, несмотря на то, что за 2 недели экспансии очищенной СD34+ популяции клеток на подложке из ММСК костного мозга удалось в сотни раз увеличить количество миелоидных мультипотентных предшественников.

Несмотря на малое количество CD34+ клеток в трансплантате, накоплен достаточный положительный опыт трансплантаций пуповинной крови, содержащей на порядок меньшее количество ЯСК, чем костный мозг в аналогичных случаях. Неслучайно основным критерием для трансплантации пуповинной крови пока считается количество ЯСК, а не CD34+ клеток на килограмм веса реципиента. В то же время известно, что CD34+ популяция клеток пуповинной крови отличается от костного мозга меньшим содержанием ГСК, но более высоким содержанием мультипотентных предшественников [22]. Для трансплантатов костного мозга и периферической крови показано, что время восстановления эритроидного, тромбоцитарного и гранулоцитарного ростка кроветворения прямо коррелирует с количеством соответствующих бипотентных колониеобразующих единиц и, в наибольшей степени – с КОЕ-ГЭММ [4, 23]. В связи с вышеизложенным, значение популяции мультипотентных предшественников миелоидного ряда, как наиболее близких к кратковременно репопулирующим незрелым клеткам крови, представляется недооцененным.

Для эффективной экспансии мультипотентных предшественников получение очищенной CD34+ популяции клеток оказалось предпочтительнее, невзирая на то, что дополнительная сепарация мононуклеарной или общей лейкоцитарной фракции сопряжена с неизбежными потерями и без того немногочисленных кроветворных клеток пуповинной крови. Потери СD34+ клеток при дополнительной сепарации могут доходить до 50%, однако они будут оправданы, если в результате экспансии удастся увеличить количество репопулирующих предшественников хотя бы в 10 раз. При семидневной экспансии над подложкой из ММСК костного мозга нам удавалось добиться для КОЕ-ГЭММ показателей в разы превышающих вышеприведенный, что может способствовать решению проблемы недостаточной клеточности. Экспансия МК фракции приводила к большей дифференцированности предшественников (падение уровня экспрессии CD34, меньший прирост мультипотентных КОЕ), тогда как по общему приросту СD34+ клеток и всех КОЕ достоверных отличий не выявлено.

Результаты распределения субпопуляций предшественников между суспензионной и адгезированной фракциями на подложке ММСК КМ вместе с данными фенотипирования подтверждают возможность моделирования in vitro условий костномозговой ниши, как основы для наиболее адекватной экспансии. Значительное увеличение пула КОЕ-ГЭММ при культивировании на подложке даёт основание предполагать как дифференцировку ранних ГСК, так и самообновление популяции мультипотентных предшественников миелоидного ряда в контакте с ММСК костного мозга. Возможно, поддержание в культуре низкой концентрации предшественников и отсутствие контакта со зрелыми (созревающими) клетками, моделирует условия аналогичные заселению костного мозга после миелоабляции. Физиологическая роль отдельных пулов сокультивируемых с ММСК гемопоэтических клеток при трансплантации еще требует дальнейшего изучения, однако, не исключено, что наилучшим вариантом для уменьшения периода цитопении окажется трансплантация всей популяции CD34+ клеток после кратковременной (до одной недели) экспансии вместе с сокультивируемыми ММСК костного мозга реципиента.

Проблема утери предшественниками после экспансии ex vivo потенциала к миграции в костный мозг на сегодняшний день может быть решена внутрикостной трансплантацией клеток [24]. Таким образом, стратегия преодоления недостаточной клеточности может включать внутрикостную трансплантацию экспансированных из 1/3-1/2 части единицы пуповинной крови CD34+ клеток вместе с сокультивируемыми ММСК костного мозга реципиента и внутривенную трансплантацию остального объёма пуповинной крови.

Подняться вверх сайта