Поиск Кабинет

Пролиферативно-дифференцировочный потенциал мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани при культивировании в присутствии тромбоцитарного лизата

Гены & Клетки: Том IX, №2, 2014 год, стр: 63-67

 

Авторы

Рогульская Е.Ю., Ревенко Е.Б., Петренко Ю.А., Петренко А.Ю.

ДЛЯ ТОГО ЧТОБЫ СКАЧАТЬ СТАТЬЮ В ФОРМАТЕ PDF ВАМ НЕОБХОДИМО АВТОРИЗОВАТЬСЯ, ЛИБО ЗАРЕГИСТРИРОВАТЬСЯ

Применение мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК) в клинической практике обусловливает необходимость поиска бессывороточных сред культивирования, способных поддерживать оптимальный рост и направленную дифференцировку клеток. Использование тромбоцитарного лизата (ТЛ) в качестве альтернативы ксеногенной фетальной сыворотке (ФС) позволяет осуществлять экспансию ММСК, полученных из жировой ткани человека. При этом тромбоцитарный лизат стимулирует пролиферативную активность клеток и увеличивает эффективность колониеобразования. При культивировании ММСК в присутствии 10% ТЛ выявляются колонии тех же типов, что и в присутствии 10% ФС, однако соотношение их изменяется в пользу плотных и смешанных колоний по сравнению с диффузными, также увеличиваются размеры и плотность колоний. Мезенхимальные стромальные клетки после экспансии в среде с тромбоцитарным лизатом сохраняют способность к дифференцировке в остеогенном и адипогенном направлениях, при этом эффективность индуцированной остеогенной дифференцировки их выше, чем у ММСК, прошедших экспансию в присутствии ФС. Результаты настоящей работы демонстрируют, что тромбоцитарный лизат является перспективным заменителем ксеногенной сыворотки при разработке технологий культивирования ММСК для регенеративной медицины и тканевой инженерии.

Постоянно возрастающее внимание к мультипотентным мезенхимальным стромальным клеткам (ММСК) обусловлено, прежде всего, возможностью их использования для лечения широкого спектра наследственных и приобретенных заболеваний человека. Благодаря способности к направленной дифференцировке, самообновлению и низкой иммуногенности ММСК также являются наиболее перспективным объектом для создания биоинженерных конструкций.

Основным источником ММСК до недавнего времени считался костный мозг [1], хотя они могут быть выделены и из других тканей взрослого человека: жировой и мышечной тканей, синовиальной мембраны, дермы, периферической и кордовой крови и др. [2]. Жировая ткань обладает рядом преимуществ перед другими источниками клеточного материала благодаря минимальной инвазивности процедуры получения, относительной доступности и высокому содержанию клеток-предшественников [3]. Было показано [4], что среди общей популяции клеток стромально-сосудистой фракции жировой ткани ММСК составляют около 1–5 %, в то время как в аспирате костного мозга – лишь 0,001–0,01 %.

Перспективы широкого клинического применения ММСК во многом определяются возможностью их получения в количестве, достаточном для аутологичной трансплантации. Культивирование in vitro дает возможность получить миллиарды клеток к 3–4-му пассажу всего лишь из 10 граммов жира [5]. Экспансию ММСК обычно проводят в присутствии 10% фетальной сыворотки (ФС) крупного рогатого скота. Однако с применением ксеногенной сыворотки связан риск передачи прионных и вирусных инфекций, а также вероятность иммунного ответа после введения в организм пациента [2, 6]. Такие недостатки ФС обусловливают необходимость поиска альтернативных компонентов, способных обеспечить оптимальный рост и дифференцировку клеток.

В последнее время появились обнадеживающие результаты о перспективности использования аутогенной сыворотки, сыворотки кордовой крови и обогащенной тромбоцитами плазмы (тромбоцитарного лизата, ТЛ) [7,8] в качестве добавки в среду культивирования. Установлено [9, 10], что ТЛ человека содержит уникальный комплекс ростовых факторов, таких как PDGF, ILGF, TGFβ1, TGFβ2, EGF, FGF, IL-1 и др., способный регулировать широкий спектр клеточных реакций от миграции до митогенеза и дифференцировки. В работах [9,11, 12] показано стимулирующее действие ТЛ на пролиферацию эндотелиальных клеток, фибробластов и ММСК различного происхождения. ММСК, культивированные в среде, содержащей ТЛ, сохраняют способность к направленной мультилинейной дифференцировке и специфический иммунофенотип CD29+, CD73+, CD90+, CD105+, CD34- и СD45- [13].

Целью данного исследования была сравнительная оценка пролиферативно-дифференцировочного потенциала ММСК жировой ткани взрослого человека при культивировании в средах, содержащих эмбриональную сыворотку или тромбоцитарный лизат.

Материал и методы

Приготовление тромбоцитарного лизата (ТЛ). Для получения ТЛ цельную кровь (500 мл) взрослых доноров (n = 5) фракционировали путем двукратного центрифугирования. В результате первого центрифугирования (680 g, 15 мин.) плазму, содержащую тромбоциты, отделяли от эритроцитов и лейкоцитов. Концентрирование тромбоцитов достигали при последующем центрифугировании при 2400 g (20 мин). После удаления верхней фракции бедной тромбоцитами плазмы, полученный препарат (~3×1010 тромбоцитов/мл) лизировали путем троекратного замораживания-отогрева и хранили при -20°C. Для нивелирования индивидуальных различий в содержании ростовых факторов аликвоты ТЛ от 5 доноров перед использованием смешивали, центрифугировали и фильтровали.

Выделение и культивирование клеток. Жировую ткань получали в результате хирургического удаления жировых отложений у взрослых пациентов с соблюдением норм комиссии по биоэтике ИПКиК НАН Украины после информированного письменного согласия доноров. ММСК жировой ткани получали, согласно методу, описанному нами ранее с небольшими модификациями [14]. Для этого к фрагментам жировой ткани добавляли раствор 0,1% коллагеназы II типа (Sigma, США) в объемном соотношении 1:3, а взвесь фрагментов инкубировали в течение 1,5 ч при 37°С и интенсивном перемешивании со скоростью 500–1000 об./мин. Полученную суспензию центрифугировали при 1500–2000 об./мин в течение 20 мин. Осадок ресуспендировали в 10 мл раствора Хенкса и фильтровали через систему для переливания кровезаменителей. Очищенную от детрита суспензию центрифугировали при 1000 об./мин в течение 10 мин. Полученный осадок представлял собой стромально-сосудистую фракцию жировой ткани, содержащую ММСК.

Экспансию ММСК проводили в среде α-MEM (Sigma, США), дополненной 10% ФС (РАА, Австрия) или 5% и 10% ТЛ, 2 мМ L-глутамина, 50 ед/мл пенициллина и 50 мкг/мл стрептомицина при 37°С, 5% СО2 и 95% влажности. В среду, содержащую ТЛ, дополнительно вносили 2 IU/мл гепарина для предотвращения желирования. При достижении клетками 70% конфлюэнтности культуру пассировали в соотношении 1:3 по стандартной методике с использованием смеси трипсин-версен (1:4). Для исследований использовали клетки 4–6-го пассажей.

Оценка морфологии и пролиферации ММСК жировой ткани. Прижизненные микроскопические наблюдения, микрофотосъемку, а также анализ окрашенных азур-эозином препаратов культур клеток выполняли с использованием инвертированного микроскопа CETI (Бельгия), снабженного цифровой камерой Nikon CoolPix 4500.

Прирост клеток в культурах с ФС или 5 и 10% ТЛ определяли в условиях монослойного культивирования после посева ММСК в равных концентрациях (5×103/см2) на поверхность адгезивного пластика. Через 7 сут. культивирования проводили трипсинизацию культур и прямой подсчет количества клеток. Оценка эффективности колониеобразования.

Эффективность колониеобразования оценивали при посеве ММСК в культуральные флаконы площадью 25 см2 в концентрации 40 кл./см2 в среде a-МЕМ, дополненной 15% ФС [15] или 10% ТЛ, 50 ед/мл пенициллина, 50 мг/мл стрептомицина и 0,2 мМ L-глутамина. Через 14 сут. культивирования колонии фиксировали 70% спиртом и окрашивали азур-эозином по Романовскому – Гимза. Затем подсчитывали число колоний, определяли их размер и количество клеток.

Направленная адипогенная дифференцировка ММСК. Для индукции адипогенной дифференцировки после экспансии в ФС или ТЛ, клетки переводили в культуральную среду a-МЕМ с 10% ФС, L-глутамином и антибиотиками, содержащую индукторы адипогенеза: 0.5 мM 3-изобутил-1-метилксантин (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), 1 μM дексаметазон (Sigma-Aldrich), 10 μg/мл инсулина, и 100 μM индометацина (Sigma-Aldrich). Через 21 день культивирования клетки фиксировали в 4% забуференном формалине в течение 30 мин при 4°C и окрашивали раствором Oil Red O (30 мг/мл в 60% растворе изопропанола).

Эффективность адипогенной дифференцировки определяли как процентное соотношение клеток с липидными включениями, позитивно окрашивающихся Oil Red O, к общему количеству клеток. Определение общего количества клеток проводили путем прямого подсчета по ядрам, окрашенным 4’,6-диамидино -2-фенилиндолом – DAPI.

Направленная остеогенная дифференцировка ММСК. Для индукции остеогенной дифференцировки после экспансии в ФС или ТЛ, клетки переводили культуральную среду α-МЕМ с 10% ФС, L-глутамином и антибиотиками, а в качестве индукторов использовали 20 mM аскорбиновую кислоту (Sigma-Aldrich, США), 10 mM β-глицеролфосфат (Sigma-Aldrich, США) и 1 μM дексаметазон (SigmaAldrich, США). После 21 дня культивирования клетки фиксировали в 4% забуференном формалине в течение 30 мин. при 4°C. Экспрессию щелочной фосфатазы определяли с помощью набора Fast Blue RR Salts/Naphtol kit (Sigma-Aldrich) согласно инструкции производителя.

Эффективность остеогенной дифференцировки определяли как процентное соотношение клеток, экспрессирующих щелочную фосфатазу, к общему количеству клеток. Определение общего количества клеток проводили путем прямого подсчета по ядрам, окрашенным 4’,6-диамидино-2-фенилиндолом – DAPI.

Статистический анализ. Результаты представляли как среднее ± стандартное отклонение. Для оценки статистической значимости различий между группами использовался t-критерий Стьюдента для независимых переменных, при уровне значимости p<0,05.

Результаты

ММСК жировой ткани при культивировании в среде с 10% ФС или 5% и 10% ТЛ характеризовались типичной фибробластоподобной морфологией. При дополнении ростовой среды ТЛ, размеры клеток были меньше, а форма более вытянутой.

Для оценки влияния различных концентраций ТЛ (5 и 10%) на скорость роста клеточных культур, ММСК в равном количестве помещали на поверхность адгезивного культурального пластика. Через 7 сут. культивирования количество клеток в культурах с 10% ФС увеличилось в 2 раза (рис. 1). В среде, содержащей ТЛ, пролиферативная активность была значительно выше: количество клеток в культурах с 5% ТЛ возрастало в 3 раза, а с 10% ТЛ – в 4,8 раз. В связи с этим, в дальнейших исследованиях использовали ТЛ в концентрации 10%.

Эксплантация клеток с низкой посевной плотностью и последующее культивирование в ростовой среде на основе a-МЕМ позволило определить количество колониеобразующих единиц фибробластов (КОЕ-ф). Так, при посеве 1000 клеток во флакон площадью 25 см2 с ФС наблюдалось формирование в среднем 34–36 фибробластных колоний. В присутствии 10% ТЛ эффективность колониеобразования была в 1,9 раз выше, количество колоний во флаконе варьировало от 59 до 89.

В зависимости от размера и плотности упаковки клеточных элементов, образовавшиеся колонии как в ФС, так и в ТЛ могли быть распределены на три типа: плотные (I тип), смешанные (II тип) и диффузные (III тип). Колонии первого типа (рис. 2А) обладали большими линейными размерами (5,6–8,6 мм) и были представлены мелкими, веретеновидными клетками, плотно прилегающими друг к другу. Для плотных колоний было характерно наличие выраженного центра с характерной упаковкой в фибробластные «потоки» на периферии. Смешанные колонии включали в себя (3,1–5,5 мм) как вытянутые, сильно распластанные клеточные элементы, так и полигональные (рис. 2Б). В диффузных колониях (1,2–3,0 см) преобладали отросчатые фибробластоподобные клетки, которые располагались разреженно и практически не контактировали между собой (рис. 2В).

Анализ количественного соотношения клеточных колоний разных типов в культурах с ФС и ТЛ выявил значительные отличия: при дополнении среды культивирования 10% ТЛ преобладали плотные и смешанные колонии, тогда как в ФС 80% колоний были диффузными (табл.).

На следующем этапе определяли влияние экспансии в ФС или ТЛ на эффективность направленной дифференцировки ММСК in vitro. При культивировании в адипогенной среде уже через 6 сут. индукции как в ФС, так и в ТЛ культурах выявлялись клетки округлой формы с вакуолями, содержащими нейтральные липиды, которые позитивно окрашивались Oil Red О (рис. 3А, Б). Размер липидных включений в клетках после экспансии в среде с ТЛ, был меньше, чем в культуре с ФС (рис. 3Б).

На 21 сут. индукции остеогенной дифференцировки большинство клеток в обеих группах экспрессировали щелочную фосфатазу (ЩФ) (рис. 3В, Г), которая является ранним маркером остеогенеза. Оценка дифференцировочных свойств ММСК жировой ткани после экспансии в средах, содержащих ФС или ТЛ, показала различия в эффективности остеогенной дифференцировки клеток (рис. 4). Так, после культивирования ММСК в присутствии ФС количество ЩФ+ клеток составляло 76%±4%, а после экспансии в среде с ТЛ данный показатель был на 14% выше (р<0,05). Спонтанная дифференцировка в остеогенном и адипогенном направлениях не отличалась между группами и составляла менее 4%.

Обсуждение

В связи с весьма обнадеживающими результатами клинического применения ММСК, все более актуальной становится проблема разработки безопасных и стандартизованных методов получения необходимого количества клеточного материала. Экспансию клеток in vitro традиционно проводят в среде, дополненной ФС, которая служит источником питательных веществ и ростовых факторов. Однако с использованием ксеногенной ФС связан риск передачи реципиенту бактериальных, вирусных и микотических инфекций [16]. Кроме того, высока вероятность развития иммунного ответа организма на белки животного происхождения [6].

С целью повышения биологической безопасности разрабатываются альтернативные бессывороточные питательные среды, способные поддерживать рост клеток в культуре. Установлено, что в присутствии ТЛ повышается пролиферативный потенциал ММСК, кроме того клетки сохраняют стабильность фенотипа [9]. Исследования M. Lohmann и соавт. показали, что наличие ТЛ в среде экспансии увеличивает пролиферацию ММСК костного мозга в 1,4 раза, а жировой ткани – в 5 раз по сравнению с ФС [17]. По данным I.S. Blande и соавт. через 5 дней культивирования в среде, содержащей ТЛ, количество ММСК жировой ткани было в 8–9 раз выше, чем при экспансии в ФС [13]. В нашей работе ТЛ в концентрации 10% увеличивал прирост клеток в 3 раза по сравнению со стандартными условиями культивирования. Такое активизирующее действие на скорость роста клеточных культур очевидно обусловлено комплексным влиянием ростовых факторов, входящих в состав ТЛ.

Следует отметить, что ТЛ в концентрации 10% являлся более эффективным стимулятором пролиферации ММСК, чем 5%. Аналогичные результаты получены при анализе влияний различных концентраций (5%, 7,5%, 10%) ТЛ на ММСК костного мозга [18]. Концентрационно-зависимый стимулирующий эффект ТЛ на рост фибробластов человека в культуре после 3–4 пассажей был показан Н.В. Калмыковой и соавт. [12]. Однако при анализе индивидуальных различий ТЛ от разных доноров выявлено, что довольно высока частота встречаемости образцов с низким митогенным эффектом (каждый девятый образец).

При оценке эффективности колониеобразования ММСК жировой ткани было выявлено 3 типа колоний, отличающихся по плотности упаковки и морфологическим особенностям клеток. Полученные нами данные указывают, прежде всего, на неоднородность исходной популяции КОЕф. Известно, что одни клетки способны к 5–6 удвоениям, тогда как другие к 20 и более [19]. КОЕф с высоким пролиферативным потенциалом генерируют большее количество потомков и образовывают плотные крупные колонии. Клетки смешанных и диффузных колоний характеризуются более низкой пролиферативной активностью [20].

Культивирование клеток с низкой посевной плотностью в среде, содержащей ТЛ, приводило к формированию преимущественно плотных и смешанных колоний, тогда как в ФС большинство колоний принадлежали к диффузному типу. Кроме того в присутствии 10% ТЛ количество и размер образовавшихся колоний значительно превышал аналогичные показатели в ФС, что согласуется с работами [17, 21, 22], где авторы исследовали ММСК костного мозга. В то же время, по данным С. Doucet с саоавт., 5% ТЛ влиял только на размер образующихся колоний, а не на их количество, что может быть связано с различиями в выделении и культивировании исследуемых клеток [9]. Очевидно, что присутствие факторов роста ТЛ в среде существенно повышает реализацию пролиферативного потенциала ММСК. Одним из возможных объяснений этого явления может быть вхождение части «покоящихся» клеток, находящихся в фазе G0, в митотический цикл и последующее активное деление в культуре.

Особый интерес представляют результаты анализа эффективности направленной дифференцировки ММСК после экспансии в среде с ТЛ. Полученные данные свидетельствуют о том, что ТЛ способствует реализации остеогенеза: так, более 90% клеток через 21 день индукции экспрессировали щелочную фосфатазу. В некоторых работах представлены сходные результаты по влиянию ТЛ на остеогенную дифференцировку ММСК костного мозга [23, 24].

Предварительная экспансия клеток в ТЛ также повышает вероятность формирования кости после эктопической трансплантации in vivo на моделях у животных [23, 25]. Остеоиндуктивный эффект ТЛ вероятно обусловлен действием входящих в его состав BMP 2, BMP 4, BMP 6, IGF, TGF-β, остеогенина и остеонектина, которые стимулируют образование костной ткани [23–25].

При сравнении адипогенного потенциала ММСК жировой ткани после экспансии с ТЛ и ФС было установлено, что размер внутриклеточных липидных включений в ТЛ культурах был меньше, чем при использовании ФС, хотя количество клеток, вступивших в адипогенную дифференцировку, не отличалось. W. Xia и соавт. [26] при изучении ММСК костного мозга также описали менее эффективные процессы адипогенной дифференцировки в случае ТЛ. Эти результаты могут свидетельствовать о том, что ММСК после экспансии с ТЛ в большей степени предрасположены к остеогенной дифференцировке. При этом известно, что ингибирование адипогенной дифференцировки сопровождается одновременной индукцией остеогенеза [27]. Такие реципрокные взаимоотношения между двумя линиями дифференцировки обусловлены существованием общих сигнальных путей, реализация которых регулируется в зависимости от поступающих к клеткам сигналов [28].

Таким образом, замена ФС в среде культивирования на ТЛ приводит к повышению пролиферации, эффективности колониеобразования и усилению остеогенной дифференцировки ММСК жировой ткани человека. Результаты настоящей работы могут послужить основой для создания новых, эффективных и безопасных протоколов получения ММСК для клинического применения.

Подняться вверх сайта