Поиск Кабинет

Применение трансплантатов, содержащих мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки, для восстановления поврежденных суставных поверхностей в эксперименте

Гены & Клетки: Том V, №2, 2010 год, стр.: 44-55

 

Авторы

Григорян А.С., Деев Р.В., Кругляков П.В., Билибина А.А., Соколова И.Б., Павличенко Н.Н., Полынцев Д.Г.

ДЛЯ ТОГО ЧТОБЫ СКАЧАТЬ СТАТЬЮ В ФОРМАТЕ PDF ВАМ НЕОБХОДИМО АВТОРИЗОВАТЬСЯ, ЛИБО ЗАРЕГИСТРИРОВАТЬСЯ

Были изучены эффекты, оказываемые различными видами костно-хрящевых трансплантатов (аутогенными, аллоген-ными деминерализованными, трансплантатами, заселенными мультипотентными мезенхимальными стромальными клетками (ММСК) костного мозга, трансплантатами с гелем из коллагена I типа) на восстановление поврежденного суставного хряща и субхондральной кости у кроликов. Показано, что применение как аллогенных, так и аутогенных ММСК на деминерализованных костно-хрящевых трансплантатах, а также на трансплантатах в сочетании с гелем, приводит к ускорению ремоделирования регенерата и восстановлению гистотипи-ческих костных и хрящевых структур в сравнении с регенерацией суставной поверхности в отсутствии терапии и после процедуры мозаичной хондропластики. Тем не менее, положительные эффекты использования трансплантатов с клетками не несли выраженной значимости, что возможно связано с особенностями использованной модели.

Введение

Восстановление гиалиновой хрящевой ткани суставных поверхностей, поврежденных в результате травм и дегенеративных заболеваний, по сей день остается актуальной фундаментальной и практической проблемой медицины. Общим свойством всех хрящевых тканей является невысокий уровень метаболизма, отсутствие кровеносных сосудов, что обуславливает их сравнительно низкий потенциал к регенерации, осуществляющейся главным образом за счет малодифференцированных клеток надхрящницы. Гиалиновая хрящевая ткань, покрывающая суставные поверхности, лишена собственной надхрящницы, что делает репаративный хондрогенез практически невозможным. Восстановление хряща происходит только при периферических повреждениях, прилегающих к синовиальной оболочке сустава. При повреждениях же центральных участков суставной поверхности наблюдаются лишь повышение продукции гликозамингликанов и коллагена II типа, coставляющих межклеточный матрикс, в ряде случаев — появление краевых «хондроцитарных пролифератов» что, однако, не приводит к восстановлению целостности гиалинового хряща[1]. При глубоких повреждениях, затрагивающих субхондральную кость (так называемых остеохондральных повреждениях), восполнение локального дефицита ткани может происходить за счет мультипотентных клеток периваскулярного окружения или стромы костного мозга, что, как правило, завершается формированием волокнистой (фиброзной) хрящевой ткани, отличающейся от гиалиновой биохимическим составом межклеточного матрикса и механическими свойствами[2].

Одним из перспективных направлений восстановления суставной поверхности после остеохондральных повреждений считается трансплантация прекультиви-рованных in vitro хондроцитов[3—5]. Впервые подобная операция в эксперименте была проведена независимо друг от друга двумя научными группами в 1989 г. — S. Wakitani et al.[6] (аллогенные клетки) и L. Petersen et al.[7] (аутогенные клетки). Исследователям удалось показать, что пересаженные таким образом клетки индуцируют и сами встраиваются в репаративный хон-дрогенез. Последние — уже через 5 лет представили результаты лечения 23 пациентов с повреждениями суставного хряща[8].

Трансплантация аутогенных хондроцитов уже в течение примерно пятнадцати лет применяется в клинической практике[3], однако до сегодняшнего для не была признана «золотым стандартом» в лечении пациентов с повреждениями суставного хряща. Данная процедура связана с нанесением дополнительной травмы, необходимой для получения достаточного количества клеток из донорской области, а также, несмотря на многообещающие результаты доклинических испытаний[9], не подтверждает своей высокой эффективности в сравнении с общепринятой мозаичной хондропластикой[10, 11].

Мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки (ММСК), полученные из костного мозга — привлекательная для многих исследователей альтернатива хондроцитам, поскольку они являются малодифференцированными элементами, способными давать начало как клеткам костной, так и хрящевой тканей, а также сравнительно просты в получении и культивировании in vitro[12—15]. Доклинические испытания как на мелких[16—18], так и на крупных животных[19—21] продемонстрировали выраженный положительный эффект применения ММСК для восполнения остео-хондральных дефектов. Более того, данная методика уже зарекомендовала свою эффективность в первых клинических исследованиях[22]. Однако, следует отметить весьма значимый недостаток указанной клинической работы: авторы использовали для заполнения дефекта коллагеновый гель, заселенный аутоММСК, закрывая затем область дефекта лоскутом надкостницы, что, как было показано позднее, может приводить к гипертрофии регенерата и его кальцификации[23, 24]. В работах последних лет вместо лоскута надкостницы предлагается применять коллагеновые мембраны на основе коллагена I и III типов[25].

Таким образом, несмотря на большое количество исследований и на прогресс в области разработки методик восстановления поврежденных суставных поверхностей, пригодный для нужд клинической практики подход к настоящему времени не разработан. Целью нашего исследования явилась гистологическая и морфометрическая оценка эффектов пересадки различных костно-хрящевых трансплантатов, включая трансплантаты, заселенные аутогенными и аллогенными ММСК, при остеохондральных дефектах суставной поверхности в экспериментах на кроликах.

Материал и методы

Эксперименты выполнены на 14 беспородных кро-ликах-самцах в возрасте от 10 до 12 мес. Животных содержали в стандартных условиях вивария (12-часовой световой день, свободный доступ к воде и пище, температура 23—25°С).

Выделение и культивирование ММСК. Не менее чем за месяц до начала экспериментов у животных брали аспират красного костного мозга объемом примерно 5 мл из подвздошной кости. Полученный костный мозг фракционировали центрифугированием (1500 об/мин, 10 мин) в градиенте перколла (63%), забирали образовавшееся интерфазное кольцо ядро- содержащих клеток и помещали клетки на культуральный пластик в питательную среду —MEM (Hyclone, Новая Зеландия), содержавшую 20% сыворотки крови плодов коров (Gibco, США) и 100 мкг/мл пенициллина/ стрептомицина (Gibco, США). Через сутки адгезивные к пластику клетки отмывали от оставшихся в суспензии элементов крови с помощью физиологического раствора. Клетки культивировали при 37°С в 5% С02-инкубаторе в течение 6^7 сут. после эксплантации в питательной среде (до получения монослоя). В дальнейшем проводили пассирование культуры через каждые семь суток с исходной плотностью 1,27x103 клеток/см2. Для пассирования культуры использовали раствор трипсина и этилендиаминтетра-уксусной кислоты (ЗДТА) (Hyclone, Новая Зеландия). Замену питательной среды проводили каждые трое суток. В экспериментах использовали клетки третьего и четвертого пассажей.

Окрашивание ММСК флуорохромом РКН 26. Для окрашивания флуорохромом РКН 26 (Sigma, США) использовались ММСК кроликов после второго пассажа культуры. Окрашивание клеток проводили по протоколу фирмы-изготовителя, эффективность окрашивания оценивали с помощью флуоресцентного микроскопа Axioscope (Zeiss, Германия).

Моделирование остеохондрального дефекта. Кролики были наркотизированы золетилом (Zoletil 50, Virbac, Франция) в дозе 0,7 мл на одно животное внутримышечно. Во время операции проводили артротомию обоих коленных суставов с сохранением целостности собственной связки надколенника, которую аккуратно сдвигали, обнажая мыщелки большеберцовой кости. Повреждение проводили на рабочей поверхности сустава с помощью трепана для биопсии костной ткани диаметром 5 мм (Bloodline, Италия) на глубину 5 мм, изымая из суставного хряща и субхондральной кости стандартный по объему цилиндрический фрагмент. После нанесения повреждения в зону дефекта помещали трансплантат либо оставляли дефект незаполненным. Рану послойно ушивали и обрабатывали бициллином.

Экспериментальные группы. Животные были разделены на 7 групп. Всем животным проводилась стандартная ежедневная обработка операционных ран Монклавитом-1 (Оргполимерсинтез СПб, Россия) и перекисью водорода (Самарамедпром, Россия) в течение первых двух недель после операции. Срок наблюдения во всех группах составил 60 сут.

Группа контроля-1 (отрицательного). После нанесения остеохондрального повреждения животным не выполняли дополнительных лечебных манипуляций за исключением стандартного послеоперационного ухода.

Группа контроля-2 (положительного). После нанесения остеохондрального повреждения животным проводилась процедура, аналогичная операции мозаичной хондропластики: нативный аутогенный костно-хрящевой фрагмент (аутотрансплантат), извлеченный из кости, помещали обратно в дефект.

Экспериментальная группа-1. После нанесения остеохондрального повреждения в зону дефекта помещали предварительно деминерализованный в течение 5^7 сут. в 5% растворе уксусной кислоты, содержащем 10% формалина, аллогенный костно-хрящевой фрагмент (аллогенный костно-хрящевой трансплантат, аллоКХТ). Перед трансплантацией аллоКХТ однократно отмывали в 96° спирте и несколько раз в питательной среде —МЕМ

Экспериментальная группа-ll. После нанесения ос-теохондрального повреждения в зону дефекта помещали деминерализованный аллоКХТ, заселенный алло-генными ММСК. Заселение трансплантата клетками проводили следующим образом: после деминерализации и отмывок трансплантат помещали в чашку Петри и наносили на него суспензию аллогенных ММСК в культуральной среде, содержавшей 20% сыворотки плодов коров, из расчета 7^10 млн клеток на 1 см3 трансплантата. Затем помещали трансплантат в 5% С02-инкубатор на 48 ч при температуре 37°С. Эффективность заселения клеток на аллоКХТ оценивали выявлением РКН 26-положительных клеток в залитых в глицерин фрагментах трансплантата с помощью флуоресцентного микроскопа Axioscope (Zeiss, Германия) (рис. 1).

Экспериментальная группа-111. После нанесения ос-теохондрального повреждения в зону дефекта помещали деминерализованный аллоКХТ, заселенный по описанной методике аутогенными ММСК.

Экспериментальная rpynna-IV. После нанесения ос-теохондрального повреждения в зону дефекта помещали деминерализованный аллогенный костный фрагмент, заполненный гелем из коллагена I типа (концентрация 2 мг/мл), полученным из шкуры быка посредством щелочно-солевой экстракции[26] с добавлением суспензии аллогенных ММСК из расчета 1x10s клеток на 1 мл геля.

Экспериментальная rpynna-V. После нанесения ос-теохондрального повреждения в зону дефекта помещали деминерализованный аллогенный костный фрагмент, заполненный гелем из коллагена I типа с добавлением на 1 мл геля.

Животных выводили из эксперимента через 60 сут. после трансплантации (передозировкой золетила). Проводили артротомию коленных суставов и выпиливали дистальные эпифизы бедренных костей. Образцы фиксировали в растворе Буэна, проводили заливку в парафин и изготавливали гистологические срезы, которые затем окрашивали гематоксилином и эозином по стандартной методике[27].

Результаты и обсуждение

Группа контроля-1. Целостность суставного хряща у животных полностью восстановлена (рис. 2А), четко определяется граница предсуществовавшей и вновь образованной хрящевой ткани (рис. 2Б, Г). По хрящу она визуализируется благодаря обрыву линии минерализации — в новообразованной ткани линия минерализации отсутствует; по субхондральному слою кости обнаруживается в связи с четкой границей костной и хрящевой тканей, причем костная граница — некроти-зирована, о чем свидетельствуют запустевшие остео-цитарные лакуны. Тем не менее, вросшие кровеносные сосуды предопределяют дальнейшее ремоделирование костной ткани и воссоздание ее первоначальной структуры. Кроме того, между хрящевым регенератом и костной стенкой имеется тонкая оксифильная прослойка, состоящая, по всей видимости, из мощных коллагеновых волокон. Вблизи хондроцитарных лакун она отдает разветвления, оплетающие хондроциты, что указывает на образование в этой области волокнистого хряща.

Хрящевая ткань суставной поверхности у края повреждения характеризуется наличием обширных бес-клеточных полей и разволокнением хрящевого матрикса, на некотором отдалении от суставной поверхности обнаруживаются запустевающие хондроцитарные лакуны (см. рис. 2Б). В хрящевом регенерате у края дефекта хондроциты образуют изогенные группы в виде корзинок — так называемые «хондроцитарные проли-фераты» (см. рис. 2Б), а на удалении от линии дефекта формируют колонны, что характерно для суставного хряща, воспринимающего и противостоящего вертикальным механическим нагрузкам. Вместе с тем, мощные пучки коллагеновых волокон, разделяющие столбчатые изогенные группы, указывают на преимущественно фиброзный характер образованной хрящевой ткани. Хрящевая ткань вдается в губчатое вещество эпифиза в виде тяжа, который у суставной поверхности имеет строение, приближенное к гиалиновому хрящу, глубже в эпифиз переходит в волокнистый хрящ и совсем в глубине — в плотную волокнистую соединительную ткань (ПВСТ).

В центральных зонах дефекта и на его дне отмечается бурный процесс, соответствующий энхондраль-ному остеогенезу (рис. 2В). Суть данного процесса сводится к тому, что избыточное количество хрящевой ткани резорбируется и на ее месте из скелетогенных предшественников дифференцируются активные остеобласты, формирующие костную ткань в непосредственной ассоциации с кровеносными сосудами. В результате дефект субхондрального слоя кости постепенно заполняется соответствующей тканью (рис. 2Д). Резорбцию избытка хрящевой ткани осуществляют хондрокласты, которые могут быть определены как гигантские многоядерные отростчатые, несколько окси-фильные клетки с зернистой цитоплазмой.

Таким образом:

— к 60 сут. наблюдения в основном процесс восстановления суставного хряща завершается и находится на стадии ремоделирования регенерата;

— в области дефекта образуется хрящевая ткань смешанного строения, в основном — фиброзная;

— параллельно с процессами репаративного хонд-рогенеза идут процессы репаративного остеогенеза;

— область регенерата можно четко разделить на 3 «слоя» — поверхностный новообразованный хрящевой; средний — воссоздаваемой субхондральной кости;

глубокий — занятый либо хрящевой тканью регенерата, либо ПВСТ;

— в ходе репаративной регенерации в зоне дефекта формируется избыточный мультитканевый комплекс, который постепенно ремоделируется.

Остается дискутабельным вопрос об источниках репаративного хондрогенеза. По-видимому, следует исключить краевую регенерацию дифференцированного суставного хряща, так как признаков пролиферативной активности там не наблюдалось, наоборот, выявлялись четко сохраненная линия дефекта и обширная бесклеточная зона матрикса. Следовательно, остается предполагать участие стромальных остео-хондроген-ных клеток периваскулярного окружения и костного мозга, которые имели возможность выхода в «хрящевую рану», т. к. субхондральный слой кости был частично разрушен при нанесении повреждения. Об этом же свидетельствуют и островки хряща под формирующейся субхондральной костью.

Группа контроля-2. Целостность суставного хряща восстановлена, вместе с тем новообразованный массив хрящевой ткани избыточен, большая часть дефекта по глубине заполнена хрящевой тканью, при этом отчетливо визуализируется «западение» суставной поверхности в этом месте и ее деформация (рис. ЗА). При этом костно-хрящевой аутотрансплантат находится ниже суставной линии, его хрящевая ткань располагается под новообразованным хрящом реципиента, а под ним — интегрированный с костью реципиентного ложа субхондральный слой трансплантата.

Состояние хрящевых краев дефекта соответствует группе контроля-1. Всегда имеется бесклеточная «прослойка» между собственным и новообразованным хрящом (рис. ЗБ, В). Костные края дефекта содержат запустевшие остеоцитарные лакуны, т. е. некротизи-рованы и подвергаются последовательному ремоделированию.

Новобразованная хрящевая ткань реципиента, расположенная над суставным хрящом аутотрансплантата, имеет смешанное строение и включает как участки волокнистого, так и гиалиноподобного хряща. Причем в краевых частях очень часто с «сочными» «хондроци-тарными пролифератами» (рис. ЗВ, Д). Зачастую участки гиалиноподобной ткани разобщены мощными тяжами волокнистого хряща или коллагеновых волокон.

Следует констатировать, что терминально дифференцированные и специализированные хондроциты обладают низкими потенциями к значимой пролиферации. Об этом свидетельствует как наличие бескле-точной зоны между «старым» и «новым» хрящом, так и отсутствие связи регенерата с хрящевым ложем.

Хрящевая часть трансплантата всегда находится под хрящевым регенератом и часто отделена от него щелью. Хрящевая ткань трансплантата находится в различной степени деградации. Со стороны субхондрально-го слоя трансплантата в хрящ постепенно врастают кровеносные сосуды, привнося с током крови хондро-класты, разрушающие деградирующий хрящ и создающие плацдарм для развертывания энхондрального остеогенеза. По-видимому, в более поздние сроки этот хрящ будет резорбирован и замещен костной тканью, которая образует костное ложе (субхондральную кость) для воссоздаваемого суставного хряща.

Выявленные изменения свидетельствуют о том, что и этот хрящ не является основным источником репаративного хондрогистогенеза. При изучении боковых участков трансплантата установлено, что наплывающие массивы новообразованного хряща, окружающие трансплантат и продолжающие расти выше него, берут начало из субхондральных отделов трансплантата — то есть из периваскулярного и костномозгового окружения (рис. ЗГ).

Костная ткань трансплантата подвергается постепенной перестройке и на этом сроке наблюдения еще содержит как погибшие, так и новообразованные костные трабекулы. Межтрабекулярное пространство заполнено состоятельным желтым и красным костным мозгом.

Таким образом:

— к 60 сут. наблюдения в процесс восстановления суставного хряща еще не завершен;

— в области дефекта образуется хрящевая ткань смешанного строения, в основном — фиброзная;

— всю область регенерата можно разделить на 3 «слоя» — поверхностный новообразованный хрящевой; средний — «переживающего» деградирующего и резор-бируемого хряща аутотрансплантата; глубокий — воссоздаваемой и перестраиваемой субхондральной кости.

Также остается дискутабельным вопрос об источниках репаративного хондрогенеза. По-видимому, и здесь мы можем исключить краевую регенерацию дифференцированного суставного хряща (или не придавать ей существенного значения), так как признаков пролиферативной активности в нем не наблюдалось, напротив, выявлялись четко сохраненная линия дефекта и дегенеративно-дистрофические процессы. Также может быть исключена роль в качестве источника хондрогенеза хряща аутотрансплантата. Светооптические данные указывают на ведущую в этом процессе роль периваскулярного и костномозгового окружения.

Экспериментальная группа-1. Целостность суставного хряща полностью восстановлена, область дефекта заполнена полиморфной хрящевой тканью (рис. 4А). На уровне слоя суставного хряща обнаруживается хрящевая ткань преимущественно гиалиноподобного строения со значительными группами гипертрофированных хондроцитов, в том числе и на стадиях деградации. На уровне дефекта субхондрального слоя кости — хрящевая ткань волокнистого строения. Приграничные с неповрежденным суставным хрящом участки регенерата — типичного строения, с обширными бесклеточ-ными полями и «хондроцитарными пролифератами» (рис. 4В).

Субхондральный слой кости находится на разных стадиях воссоздания и ремоделирования. В большей части полей зрения он еще не восстановлен, но прослеживается отчетливая тенденция к протеканию этого процесса. В нем чередуются остеоны смешанного строения — включающие как жизнеспособные костные образования, так и с запустевшими остеоцитарными лакунами.

Представляет особый интерес состояние декальци-нированного костно-хрящевого фрагмента. Его хрящевая ткань находится под хрящевым регенератом и под воссоздающимся слоем субхондральной кости (рис. 4Б). Погибший хрящ подвергается резорбции клеточными элементами, привнесенными врастающими в матрикс кровеносными сосудами. Параллельно с резорбцией денатурированного хрящевого матрикса скелетогенные периваскулярные клетки дифференцируются по остео-бластическому пути и приступают к формированию минерализованного матрикса, который в виде остеоида откладывается вокруг сосудов, а позднее образует ре-тикулофиброзную костную ткань (рис. 4Г).

Костная часть пересаженного деминерализованного фрагмента резорбируется, о чем свидетельствуют многочисленные очаги фагоцитоза, включающие остатки резорбируемого матрикса, мононуклеарные фагоциты, гигантские многоядерные клетки, иногда небольшое количество лимфоцитов. Данные образования в местах резорбции далее обозначены «фагоцитарными гранулемами». В составе костного регенерата в области дефекта имеются костные трабекулы смешанного строения, включающие как новообразованные, так и пересаженные участки кости. Следует, однако, отметить, что при исследовании установлено, что пересаженный аллоКХТ не служит источником индукционных влияний, скорее — его части инкрустируют новообразованную кость в случайном порядке, а не побуждают клетки реципиента к остеогенезу. Особенно красноречиво об этом свидетельствует состояние костных фрагментов трансплантата, находящихся на некотором удалении от основного плацдарма регенерации — в этих участках они разобщены, окружены жировой тканью, признаков индукции остеогенеза нет, равно как и признаков их клеточной резорбции; по-видимому, в этом случае (или на этом этапе) их рассасывание происходит благодаря действию иных, неклеточных механизмов.

Таким образом:

— к 60 сут. наблюдения в основном процесс восстановления суставного хряща завершен;

— в области дефекта образуется хрящевая ткань смешанного строения, в основном — волокнистая, но с тенденцией к приобретению гиалиноподобного строения;

— хрящевая часть аллоКХТ находится под хрящевым регенератом, резорбируется и замещается костной тканью, формирующей субхондральный слой;

— костная часть аллоКХТ резорбируется и в большей степени служит остеокондуктором, но не проявляет индукционных свойств.

Экспериментальная группа-ll. Целостность хрящевого покрытия к 60 сут. наблюдения восстановлена, толщина новообразованного хрящевого покрытия лишь незначительно превышает толщину интактного хряща (рис. 5А, Б), т. е. к этому времени уже произошла резорбция гипертрофического регенерата, либо он изначально формировался без избытка. Кроме того, архитектоника расположения хондроцитов соответствует распределению вектора нагрузки (сверху вниз), и, таким образом, воспроизводит расположение колончатых изогенных групп нативного суставного гиалинового хряща. Обращает на себя внимание, что новообразованный хрящ несет в себе признаки активного хондро-генеза, о чем можно судить по большому количеству «хондроцитарных пролифератов» не только в краевых частях регенерата, как в группах контроля и экспериментальной группе-1, но и по всему его объему (рис. 5Б). Еще одной особенностью данной группы является включение в состав хрящевой части регенерата элементов деминерализованного костного матрикса из аллоКХТ (рис. 5Г).

Под воссозданным хрящом расположена субхонд-ральная кость с признаками активнейшей перестройки — происходит процесс замещения донорской кости на собственную (рис. 5В). Следует отметить более интенсивный процесс замещения трансплантата на собственную кость в сравнении с контрольными группами и экспериментальной группой-1, что регистрируется по количеству оставшихся к этому сроку фрагментов деминерализованной кости.

При исследовании регенерата обнаружены многочисленные слабо выраженные лимфоидные узелки и лимфоцитарная инфильтрация. Как правило, скопления этих клеток расположены в непосредственном контакте или вблизи резорбируемых элементов аллоКХТ (рис. 5Д, Е). На поверхности сохранившихся трабекул аллоКХТ признаков пролиферации остеогенных предшественников или репаративного остеогенеза не выявлено.

Таким образом:

— к 60 сут. наблюдения процесс восстановления суставного хряща в основном завершен, причем восстановленный хрящ несет признаки гисто- и органотипической организации;

— к 60 сут. наблюдения хрящевой регенерат не является избыточным, на этом сроке происходит активное воссоздание субхондрального слоя кости;

— хрящевая и костная части аллоКХТ практически полностью резорбированы и перестроены, причем пересаженные хрящевые элементы не выявляются вовсе;

— отмечены морфологические признаки иммунной реакции в виде активации лимфоцитов вблизи остатков костных балок, заселенных аллогенными ММСК;

— выявленные эффекты, по всей видимости, связаны с трансплантацией ММСК.

Экспериментальные группы-ill, IV и V. При гистологическом анализе препаратов, полученных от животных данных групп, существенных отличий по сравнению с экспериментальной группой-ll не выявлено (рис. 6А^В). Целостность хрящевого покрытия к 60 сут. наблюдения восстановлена, происходит активная резорбция избыточных участков хрящевого регенерата, под которым идет восстановление субхондрального слоя кости. В хрящевой регенерат происходит включение фрагментов костной части аллоКХТ, и наоборот — в костный регенерат — участков пересаженного хряща в экспериментальной группе-111 (рис. 6Г). Данное наблюдение свидетельствует о том, что особыми гистотропными индукционными факторами аллоКХТ не обладает, как и гель из коллагена I типа, примененный в экспериментальных группах-IV и V.

Интенсивность замещения трансплантата на собственную кость, по-видимому, существенно не отличается от данного процесса в экспериментальной группе-ll. Костные трабекулы трансплантата продолжают подвергаться резорбции, при этом гигантские многоядерные клетки обнаруживаются в «резорбци-онных гранулемах», когда в них аллоКХТ присутствует в следовых количествах (рис. 6Д), в то время как вокруг свободно лежащих трабекул нет ни активности остеокластов, ни лимфоцитарной инфильтрации. Последний факт следует отметить особо, это, пожалуй, единственное значимое отличие от экспериментальной группы-ll, где применялся аллоКХТ, заселенный аллогенными ММСК. Возможно, аутопроисхождение ММСК в экспериментальных группах-ill и V, а также применение геля из коллагена I типа в группах-IV и V снижают вероятность развития данных процессов, что ранее было показано на других экспериментальных моделях[28]. На поверхности сохранившихся трабекул аллоКХТ признаков пролиферации остеогенных предшественников или репаративного остеогенеза нет.

Таким образом:

— к 60 сут. наблюдения процесс восстановления суставного хряща в основном завершен;

— на данном сроке происходит активное воссоздание субхондрального слоя кости;

— трансплантат практически полностью резорбиро-ван и перестроен;

— признаки иммунной реакции в виде активации лимфоцитов вблизи костных балок, заселенных ММСК, не обнаружены как в случае аутогенного происхождения клеток (экспериментальные группы-ill и V), так и их аллогенного происхождения (экспериментальная rpynna-IV).

Морфометрическая характеристика состояния суставного хряща и субхондральной кости животных

В работе были измерены размеры зоны дефекта и регенерата в абсолютных цифрах (табл. 1), а также проведен подсчет доли погибшей костной ткани в субхонд-ральных участках — последний показатель свидетельствует об интенсивности процессов ремоделирования, т. е. чем больше в составе регенерата погибшей костной ткани, тем медленнее протекает процесс ремоделирования (табл. 2). При этом погибшими считали костные трабекулы с запустевшими остеоцитарными лакунами; причем наличие на их поверхности активных остеобластов не расценивали как признак жизнеспособности всего костного образования. Статистически значимых различий между группами получено не было.

Таким образом, следует заключить, что полнослойное повреждение суставного хряща и субхондральной кости у кролика способно за 60 сут. восполняться гис-тотипическими тканевыми структурами без дополнительных лечебных манипуляций, что делает примененную модель не слишком адекватной и убедительной, несмотря на то, что большинство авторов предпочитает работать именно с ней[4, 5, 18].

Качественные отличия между экспериментальными группами выражены не всегда, однако в целом в группах клеточной трансплантации процессы ремоделирования регенерата протекают интенсивнее. Наиболее интенсивно они происходят при замене хрящевой части трансплантата гелем из коллагена I типа. Значимых качественных различий при трансплантации ауто- и аллоММСК выявить при этом не удается.

К сожалению, использование морфометрических критериев не способствует объективации оценки результатов, поскольку данные критерии не отражают характера восполнения дефекта и анатомо-функциональ-ных результатов.

Из полученных данных мы можем заключить, что клеточная терапия с помощью ММСК, заселенных на деминерализованные костные и костно-хрящевые матриксы, при остеохондральных дефектах, несмотря на оказываемые положительные эффекты на репаратив-ные процессы, не обеспечивает ярко выраженных отличий от естественного восстановления суставной поверхности, а также от процедуры мозаичной хонд-ропластики на данной экспериментальной модели. Основываясь на результатах гистологического исследования, следует отметить перспективность использованного нами подхода и необходимость поиска более адекватных экспериментальных моделей для его объективной оценки.

Подняться вверх сайта