Поиск Кабинет

Применение пористо-проницаемых инкубаторов из никелида титана в качестве носителей клеточных культур

Гены & Клетки: Том V, №4, 2010 год, стр.: 31-37

 

Авторы

Кокорев О.В., Дамбаев Г.Ц., Ходоренко В.Н., Гюнтер В.Э.

ДЛЯ ТОГО ЧТОБЫ СКАЧАТЬ СТАТЬЮ В ФОРМАТЕ PDF ВАМ НЕОБХОДИМО АВТОРИЗОВАТЬСЯ, ЛИБО ЗАРЕГИСТРИРОВАТЬСЯ

В работе представлены данные о способности мульти-потентных мезенхимальных стромальных клеток образовывать популяции хондрогенных и остеогенных тканей в пористо-проницаемых инкубаторах из никелида титана.

Установлено достоверное увеличение активности щелочной фосфатазы и процентного веса сухого инкубатора в остеогенной среде, а также значительное повышение содержания ДНК в инкубаторе в хондрогенной среде. Сканирующая электронная микроскопия показывает развитие клеток в поровом пространстве инкубатора во временном интервале.

Комплексное исследование на патофизиологической модели опухолевого роста показало эффективное антиме-тастатическое действие общей популяции клеток аллоген-ного костного мозга в инкубаторах из пористого никелида титана и их пролонгированный эффект.

В настоящее время применение биоматериалов включает в основном следующие направления:

1) функциональные материалы;

2) системы доставки лекарственных препаратов;

3) скаффолды — временные и постоянные клеточные подложки, поддерживающие или корректирующие функцию органа;

4) внешние коммуникационные устройства;

5) поверхностные покрытия[1—4].

Новые «интеллектуальные» материалы требуют и новейших разработок тестирования, они должны чутко реагировать на температуру, pH, биоактивные молекулы[5, 6].

Стандартом культуральной системы является мо-послойная культура, где клетки выращиваются на плоской поверхности. Однако, она не может воспроизвести пространственное расположение клеток, аналогичное естественным тканям и редко переводит популяцию клеток в функционирующую ткань. В настоящее время большинство подложек, носителей, матриц (scaffolds) для клеток представляют собой трехмерную пористую поверхность, в которой ткань может расти и развиваться. В трехмерном объеме матрицы клетки способны строить заданный тип ткани с ее сложной объемной архитектоникой.

Цель биоинженеров заключается в создании трехмерного эквивалента ткани взамен поврежденной или удаленной части, которая в инкубаторе может быть имплантирована в организм для излечения заболевания или устранения дефекта[7].

Технология создания матриц для клеточных культур предусматривает доступ клеток к питательным веществам и выводу ненужных метаболитов, а также обеспечивают трехмерное пространственное развитие. По этой причине большинство скаффолдов, независимо от материала, созданы пористыми[7]. Неорганические материалы, такие как биоактивные стекла, и фосфорнокислый кальций широко используются для воспроизведения (в данном контексте — инжениринга) костной ткани, в основном, из-за общих черт конфигурации структуры и их способности к интеграции с естественным минеральным комплексом кости[8]. Биоактивные стекла формируются и спекаются из порошка, и чтобы создать пористую структуру, их раствор вспенивают для образования пористого геля[9]. Точно так же пористость может быть спроектирована в полимерах, например, в полиэфирах (которые обладают преимуществом биологического разложения)[10, 11]. Пористые матрицы создают и из естественных материалов — например, гели коллагена могут быть высушены сублимацией перед клеточным засевом[12]. Но у каждого скаффолда есть свои недостатки. Неорганические скаффолды, такие как керамика и стекла, имеют низкий уровень физико-механических свойств, и не могут использоваться в конструкциях, несущих значительную знакопеременную нагрузку. Биоактивные стекла, созданные всего 30 лет назад, ограничены в применении, из-за несоответствия их свойств свойствам тканей и используются лишь для замены малых объемов костей. Искусственные полимеры воспринимаются организмом как инородное тело, клетки к ним плохо адгезируются, они имеют низкий уровень проницаемости и смачиваемости из-за гидрофобных свойств поверхности. Продукты их деструкции, в случае полиэфиров и кислых веществ, опосредованно могут создать нефизиологически кислую, токсичную микросреду.

Материалы на основе коллагена могут быть более перспективными, хотя бы потому, что естественный процесс остеогенеза включает минерализацию именно коллагена[13]. Другие общие проблемы, возникающие с пористыми скаффолдами, связаны с прикреплением и адаптацией клеток в трехмерной макросреде пористого матрикса. Данная проблема решается до некоторой степени изменением структуры поверхности и уменьшением размера пор.

В НИИ медицинских материалов (Томск) созданы пористо-проницаемые инкубаторы из никелида титана, которые обладают уникальными свойствами: имеют пористо-проницаемую структуру за счет открытых пор, высокой смачиваемостью тканевыми жидкостями, высокой биологической, биомеханической и биохимической совместимостью на клеточном уровне и отвечают многим перечисленным выше требованиям[14].

Известно, что костный мозг содержит популяцию мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК), способных формировать несколько видов тканей, включая хрящевую и костную. Заместительная биоинженерия тканей и органов человека имеет неограниченный потенциал возможностей получения, сохранения и использования источника органов для клинического применения[15, 16]. Геометрический рост числа дегенеративных заболеваний скелетно-мышечной системы и травм, при этом высокая стоимость хирургических реконструкций, подводят нас к исследованиям, связанными с созданием на основе инкубаторов-носителей клеточных культур и тканей эквивалентов кости и хряща. Для этих целей используют пористые матрицы в комбинации с клеточными популяциями и добавлением различных диф-ференцировочных факторов[17—19]. В последующем данные комплексы имплантируются in vivo, восстанавливая и реконструируя больной организм. Более того, имплантация инкубаторов с развивающимися тканями в структуре пор приводит к более быстрой регенерации прилежащих тканей и ускорению закрытия дефекта по сравнению с другими типами лечения[20—22].

Исследования по биосовместимости никелид-ти-тановых подложек с клетками фетальной печени, в-клетками поджелудочной железы и костного мозга проводились на различных патофизиологических моделях[23—25]. Гибридные искусственные органы применялись и в онкологии[26]. В настоящее время одним из наиболее эффективных методов при лечении неоперабельных онкологических заболеваний используют так называемую миниаллогенную трансплантацию. При данном виде лечения основной упор делается на реакцию «трансплантат против опухоли», а не на цитостатическую терапию. Согласно предварительным данным, проведение такого лечения позволяет надеяться на длительную ремиссию у больных с метастатическим раком, не ответившим на предшествующую терапию. Противоопухолевый иммунный ответ после аллогенной трансплантации может быть усилен за счет дополнительных трансфузий донорских лимфоцитов. Как показывают исследования, введение лимфоцитов донора позволяет добиться полной ремиссии опухоли даже в случае рецидива после аллогенной трансплантации от того же донора, но данные эффекты нестабильны и не продолжительны, из-за быстрой элиминации донорских лимфоцитов[27—29]. Пористые инкубаторы из никелида титана позволяют сохранить и пролонгировать действие введенных клеток[26].

Цель исследования — изучение возможности применения пористо-проницаемых инкубаторов из никелида титана, как матрицы для построения тканевых эквивалентов; изучение возможности модуляции противоопухолевого ответа при трансплантации аллоген-ного костного мозга в пористо-проницаемом инкубаторе из никелида титана.

Материал и методы

Пористо-проницаемые инкубаторы. Использовались пористо-проницаемые инкубаторы из никелида титана (4x4x10) с проницаемой пористостью в интервале — 40—60% и соответствующим распределением пор по размерам[14]. Перед испытанием инкубаторы выдерживались при Т=180°С, охлаждались и помещались в полную культуральную среду.

Клеточные культуры. Использованы костномозговые ММСК мышей-гибридов F1 CBA/j. После декапи-тации у животных в стерильных условиях извлекали бедренные кости. Костный мозг вымывали с помощью шприца во флаконы. Концентрацию клеток до-x

санные инкубаторы; помещали в 50 мл пластиковые флаконы (Corning). Проводили культивирование инкубатора без клеток и с клетками костного мозга в среде, которая состояла: из среды DMEM-F12 (ПанЗко, РФ), 10% сыворотки плодов коров (HyClone, США), гентамицина 40 мкг/мл (ПанЗко, РФ), глутамина 250мг/л (ПанЗко, РФ). В систему с остеогенной дифференцировкой были добавлены дифференциро-вочные добавки: p-глицерофосфат 3 мг/мл (Sigma, США) в комбинации с 0,15 мг/мл аскорбиновой кислоты (Sigma, США). В хондрогенную среду был до-p

с клетками содержали при 37°С при 100% влажности с 5% С02. Культивирование продолжалось в течение 28 сут. с заменой среды через каждые 6 сут. Периодически проводили окраску материала специфическими красителями.

После 28 сут. культивирования проводили взвешивание влажных образцов, затем образцы высушивали и определяли их вес.

Содержание ДНК. Содержание ДНК в инкубаторах определяли замораживанием в 3 мл ddH20 и размораживанием под действием ультразвука, затем центрифугировали и освобождались от дебриза. К порции ДНК добавляли 95 мл нагретого 10 ТЕ-буфе-ра с 1,5 М NaCI и 5% SDS. Затем обрабатывали РНКа-зой (20 мг) и протеинкиназой К (800 мг). Раствор был экстрагирован хлороформом и затем преципи-тирован в изопропаноле, промыт в 70% этаноле и разведен в ТЕ-буфере. Количество и чистоту ДНК определяли спектрофотометрически при длине волн 260 и 280 нм.

Активность щелочной фосфатазы. Исследование щелочной фосфатазы было произведено р-нитрофе-ноловым методом. Клетки вымывались смесью 10 мм Tris-HCI (ph = 7,6) и 0,1% Triton Х-100. Экстракты готовились на 0, 7, 14, 21, 28-е сут. Активность щелочной фосфатазы была измерена спектром поглощения р-нитрофенола при 405 nm (Sigma-Aldrich, США).

Гистологические окраски. Признаки хондрогенной дифференцировки определяли по ярко-голубой окраске толлуидиновым голубым.

Остеогенную дифференцировку культур определяли окраской ализариновым красным S (Даль, 1952). Навеску ализаринового красного S (Биолот, Россия) в 100 мг растворяли в 9,9 мл бидистиллированной воды. Доводили pH до 4,1—4,3 слабым раствором 10% аммиака. Препараты окрашивали в течение 1,5 мин.

Выявление солей кальция производили методом ван Косса. Использовался фиксированный клеточный материал — препараты, погружённые в приготовленный ex tempore 5% раствор нитрата серебра на 30 мин. Далее флакон помещали под ультрафиолетовое освещение. Промывали дистиллированной водой и фиксировали в 5% растворе натрия тиосульфата (Луппа X., 1980).

Сканирующая электронная микроскопия. Образцы были зафиксированы в течение 1 ч в 2,5% глюта-ральдегиде (Sigma-Aldrich, США), затем промыты 3 раза в PBS (15 мин каждый), далее их фиксировали 1 ч в 1% тетраоксиде осмия (Sigma-Aldrich, США), промывали 3 раза в PBS, и затем дегидратировали, пропуская через ряд растворов этанола (30%, 50%, 70%, 90%, 100%) по 15 мин в каждом. Фиксированные и дегидратированные образцы были высушены, и каждый образец инкубатора был исследован на растровом сканирующем электронном микроскопе Philips 513 и на Quanta 200 3D.

Модели in vivo. В работе использовали штамм солидной опухоли меланомы В-16 (пигментный вариант), которая была получена из лаборатории опухолевых штаммов Российского онкологического научного центра РАМН (Москва). Опухоль прививалась животным по общепринятой методике.

Для имплантации использовали ткани костного мозга мышей C57BI/6. Клеточные суспензии костного мозга получали общепринятыми методами, жизнеспособность клеток в суспензии при оценке методом витальной окраски трипановым синим составляла не менее 90%. Клеточная суспензия в концентрации 1х107 клеток в полной культуральной среде (ПС) засевалась на инкубатор из пористо-проницаемого ни-келида титана и культивировалась 24 ч при 37°С в 5% атмосфере С02. Затем инкубатор вшивался внут-рибрюшинно животному под эфирным наркозом. Материал для исследований забирали на 20—21 -е сут. роста опухоли. При постановке экспериментов животные распределялись по 4 группам:

— 1-я группа «контроль» — интактные мыши;

— 2-я группа «опухоль» — мыши с опухолью;

— 3-я группа «КМ» — мыши с опухолью и однократной инъекцией суспензии клеток аллогенного костного мозга внутрибрюшинно;

— 4-я группа «КМ+TiNi» — мыши с опухолью и имплантированным пористым инкубатором из нике-лида титана с культивированными на нем клетками костного мозга. Динамика роста опухолей оценивалась по изменению объема, который вычислялся по формуле Р. Шрека (1980) и массе опухоли. Об эффективности терапии судили по проценту торможения роста опухоли (ТРО), который вычислялся по формуле:

ТРО = (Vk-Vo)/Vkx 100%,

где Vk — объем опухоли в контроле; Vo — объем опухоли в опыте.

Распостраненность метастатического процесса оценивали по частоте метастазирования, среднему количеству и объему метастазов в легких. Для оценки антиметастатической активности вычисляли индекс ингибирования метастазов (ИИМ,%) по формуле:

где Ак и А — частота метастазирования в легкие у мышей контрольной и опытной групп; Вк и В — среднее число метастазов в контрольной и опытной группах.

Общий объем метастазов вычисляли, исходя из диаметра отдельных метастатических узлов:

Статистическую обработку проводили с использованием параметрических и непараметрических критериев оценки достоверности из пакета статистических компьютерных программ «Statistika-б».

Результаты и обсуждение

Эксперименты in vitro

Перед проведением эксперимента все инкубаторы подвергались контрольному взвешиванию. Далее образцы были взвешены непосредственно после извлечения из культуральной системы, затем они высушивались, и определялось процентное отношение к весу влажной конструкции. Масса влажных инкубаторов не имела достоверных различий после 28 сут. культивирования в различных средах. При сравнении процентного соотношения высушенных инкубаторов наблюдается достоверное увеличение их веса. Процентное соотношение веса инкубаторов, которые культивировались в остеогенной среде было в 2 раза больше по сравнению с контрольной группой и увеличено в 1,6 раз по сравнению с группой, где конструкции культивировались в хондрогенной среде. Данный факт говорит о наработке специфического матрикса остеогенными клетками, что, по-видимому, связано с большим количеством кальция, чем в матриксе хондрогенных клеток (рис. 1).

Содержание ДНК и щелочной фосфатазы также указывает на различия в культивировании ММСК с различными факторами дифференцировки. При исследовании количества ДНК отмечен наибольший уровень в инкубаторах с хондрогенной дифференци-ровкой, где этот показатель достоверно превышал уровень контрольной группы в 1,8 раз и уровень инкубаторов, которые культивировались в остеогенной среде в 5,5 раз Срис. 2).

В то же время активность щелочной фосфатазы (ранний маркер остеобластического фенотипа) была наибольшей в инкубаторах с остеогенной диффе-ренцировкой и превышала данный показатель в 3,2 раза в инкубаторах контрольной группы и в 3,8 раза

Развитие хондрогенной дифференцировки было доказано гистологически позитивной окраской толуи-диновым голубым, а остеогенная дифференцировка была подтверждена окраской по ван Косса коричнево-черными выделениями кальцифицированного матрикса и ализариновым красным. При этом сравнительная окраска контрольных препаратов значительно отличалась от окраски клеток в инкубаторах, которые культивировались в специализированных средах. Данный факт подтверждает возможность использования инкубаторов из никелида титана как подложки для культивирования ММСК. При этом клетки в инкубаторе возможно дифференцировать факторами дифференцировки двух направлениях — хондро- и остеогенном.

Развитие ММСК в поровом пространстве инкубаторов было исследовано с использованием сканирующего электронного микроскопа во временном промежутке (1 нед.). На рис. 4 (А) показана исходная пористая структура никелида титана, полученная методом самораспостраняющегося высокотемпературного синтеза. К концу первой недели внутри пор наблюдалось прикрепление клеток и их размножение (см. рис. 4Б). В течение второй недели происходило дальнейшее разрастание клеточной популяции в порах инкубатора и синтез межклеточного матрикса (рис. 5). В конце третьей недели большинство пор инкубатора оказываются полностью заполненными клетками и соответствующим матриксом (рис. 6). Данный эффект стабильно прослеживается как in vitro, так и in vivo — образцы инкубаторов прорастают тканями и заполняют поры инкубатора в течение 3^4 нед.

Структура пористо-проницаемых инкубаторов, по нашему мнению, не влияла на направленную диффе-ренцировку и развитие хондро- и остеогенных тканей из ММСК. Наблюдалось неуклонное заполнение внутреннего порового пространства инкубаторов специфическими клетками с образованием специализированного для данных тканей матрикса.

Пористо-проницаемые инкубаторы из никелида титана были исследованы на патофизиологической модели in vivo. Были получены результаты по модуляции противоопухолевого ответа после трансплантации аллогенного костного мозга (КМ) на пористо-проницаемых инкубаторах. Согласно полученным данным (табл. 1), введение костного мозга снижает метаста-зирование на 30% и обладает незначительным (10%) противоопухолевым эффектом. В то же время имплантация клеток КМ на инкубаторе-носителе приводит к более выраженным противоопухолевым (25%) и существенным антиметастатическим эффектам(45%). Кроме того, продолжительность жизни животных с опухолями и имплантированным КМ на инкубаторе из никелида титана увеличивалась на 60%.

Показана умеренная противоопухолевая и антиме-тастатическая активность клеток костного мозга, трансплантированных на пористом носителе из никелида титана in vivo. Так как клетки костного мозга (КМ) не оказывают прямого антипролиферативного эффекта на опухолевые клетки-мишени in vitro, то можно считать, что одним из возможных механизмов влияния трансплантации костного мозга на опухолевый процесс является стимуляция эндогенных эффекторов противоопухолевого иммунитета.

Исследование морфофизиологических параметров иммунокомпетентных органов показало, что введение аллогенных клеток костного мозга способствует уменьшению регрессии тимуса и уменьшает сплено-мегалию у животных с перевиваемыми опухолями (табл. 2).

Заключение

Таким образом, показана направленная дифферен-цировка ММСК в хрящевую или костную ткани внутри пористо-проницаемых инкубаторов из никелида титана.

Выявлено, что трансплантация аллогенных клеток костного мозга на пористом инкубаторе пролонгирует и усиливает противоопухолевое и антиметастатическое действие по сравнению с инъекционным введением клеток. Это связано с обеспечением оптимальных условий сохранения жизнеспособности и функционирования донорских клеток в пористо-проницаемой структуре инкубатора и маскирующем эффекте от воздействия иммунной системы хозяина.

Растровая электронная микроскопия позволила проанализировать заполнение порового пространства клетками и развитие клеток и тканей в поровом пространстве инкубатора во временном промежутке. Комплекс исследованных гистологических и патофизиологических параметров отображает высокую биосовместимость исследуемых инкубаторов с данными типами клеток.

Подняться вверх сайта