Поиск Кабинет

Применение культур клеток и тканей для скрининга противоопухолевых препаратов in vitro

Гены & Клетки: Том VIII, №2, 2013 год, стр.: 20-28

 

Авторы

Мингалеева Р.Н., Соловьева В.В., Блатт Н.Л., Ризванов А.А.

ДЛЯ ТОГО ЧТОБЫ СКАЧАТЬ СТАТЬЮ В ФОРМАТЕ PDF ВАМ НЕОБХОДИМО АВТОРИЗОВАТЬСЯ, ЛИБО ЗАРЕГИСТРИРОВАТЬСЯ

Одной из причин провала потенциальных противоопу холевых препаратов на стадии клинических исследований является несовершенство существующих систем докли нического скрининга. Возможно, наиболее важна стадия тестирования in vitro, когда из множества веществ необ ходимо отобрать всего несколько, отвечающих заданным свойствам. Эффективная система скрининга должна быть максимально приближена по свойствам и по организации к естественной опухоли. Клеточные культуры были и остают ся наиболее простыми в техническом исполнении in vitro моделями опухолей. Однако по многим параметрам культу ры клеток отличаются от естественных опухолей. Разрабо тано несколько моделей, которые позволяют более полно имитировать опухоль и ее микроокружение, по сравнению с простыми монослойными культурами. Примером могут служить трехмерные культуры. Кроме того, развиваются гистологические методы тестирования противоопухолевых препаратов. В данном обзоре изложены современные in vitro модели, которые могут быть использованы для про верки активности потенциальных лекарственных веществ, способных подавлять рост опухолевых клеток.

Высокопроизводительные методы геномных и протеомных исследований внесли значительный вклад в понимание биологии онкологических забо леваний, что послужило основой для развития сис тем скрининга противоопухолевых веществ, позво лило идентифицировать и внедрить в клиническую практику множество соединений с потенциальной способностью подавлять рост трансформированных клеток[1]. Однако на сегодняшний день действие противоопухолевых препаратов ограничено всего не сколькими десятками видов клеточных белков-ми шеней. Исследовательская программа Центра рака Мура (Moores Cancer Center) при Университете Калифорнии в Сан-Диего (США) показала, что чис ло эффективных мишеней для противоопухолевых препаратов колеблется между 1000 и 4000. Кро ме того, эффективность препаратов в значительной степени зависит от индивидуальных особенностей организма конкретного пациента. Это вызывает большие трудности при разработке эффективных методов скрининга препаратов и при проведении до клинических испытаний. Рационально проведенный первичный скрининг и доклинические исследования потенциальных противоопухолевых препаратов по зволяют существенно снизить затраты на разработку эффективных и безопасных лекарственных средств.

Многообразие онкологических заболеваний

Формирование любой опухоли начинается с трансформации клеток. Трансформация может про ходить в любой части организма и практически из любого типа клеток. Множество заболеваний, в основе которых лежит опухолевая трансформация клеток, поражает своим разнообразием. Выделяют более 100 видов опухолей, без учета подтипов в специфических органах[2]. Наиболее простой клас сификацией новообразований является деление их на доброкачественные и злокачественные. Добро качественные опухоли включают высокодифферен цированные клетки и отличаются экспансивным ро стом, при котором опухоль медленно увеличивается и раздвигает прилежащие ткани. Для злокачествен ных новообразований характерна инвазия в приле жащие к ней ткани и метастазирование. Метастазы являются основной причиной смертности среди он кологических больных. Процесс метастазирования включает следующие основные этапы: локальную инвазию, интравазию, циркуляцию в кровотоке, экс травазию и колонизацию (заселение) ткани и (или) органа[3]. В процессе инвазии происходит наруше ние межклеточной адгезии, повышение мобильности опухолевых клеток, в результате чего они проникают в окружающие ткани. При интравазии, опухолевые 1]. клетки проходят через эндотелиальный барьер и попадают в системный кровоток. Выжившие в кровотоке клетки в процессе экстравазии прикрепляются к сосудам в отдаленных районах, проникают в окружающие ткани и начинают образовывать метастазы в новых условиях окружения[4].

Выделяют шесть признаков, или свойств («призна ки опухоли»), общих для большинства злокачествен ных новообразований: 1) самодостаточность в росто вых сигналах; 2) нечувствительность к антиростовым сигналам; 3) устойчивость к апоптозу; 4) неограни ченный репликативный потенциал; 5) непрерывный ангиогенез; 6) тканевая инвазия и метастазирование[5]. Однако сложность и разнообразие изменений, на блюдаемых в опухолевых клетках, не ограничиваются изменениями в указанных выше процессах. Даже в пределах одного новообразования наблюдается микрогетерогенность клеток, которая делает опухоль каждого конкретного пациента уникальной[2].

Современные способы борьбы с опухолями

Одним из основных методов лечения большинства опухолей является их хирургическое удаление, одна ко существует риск, что в организме останется часть трансформированных клеток, которые в дальнейшем могут стать причиной рецидива заболевания. Другими традиционными методами лечения являются луче вая и химиотерапия, но некоторые виды опухолей по не всегда ясным причинам устойчивы к этим видам воздействия. Даже после успешных циклов лечения, зачастую, опухоль исчезает не полностью, приобрета ет устойчивость к терапии или «уходит» в состояние покоя, чтобы позже вернуться в более агрессивной форме[6]. Традиционная терапия имеет множество нежелательных побочных эффектов, главным из ко торых является ненаправленное действие препаратов, вследствие чего поражаются нормальные клетки ор ганизма. Альтернативным направлением в разработке противоопухолевых лекарств является таргетная те рапия, действие которой должно проявляться только в опухолевых клетках. Нацеленность терапии может быть достигнута методами генной инженерии, напри мер, при воздействии на дефектные гены, которые определяют «признаки опухоли», или при использова нии моноклональных антител, специфичных к маркё рам, характерным для той или иной опухоли. Успешное подавление роста опухолевых клеток при блокирова нии ключевых дефектных генов показано в ряде ис следований[7-9]. Но, как оказалось, для полного исчезновения опухоли недостаточно подавить только один из «признаков опухоли» - необходимо блокиро вать большинство, если не все, потенциальные пути опухолеобразования, что оказалось сложной зада чей[2]. Следующим препятствием к использованию геннотерапевтических препаратов в онкологической практике оказалась сложность доставки ДНК или РНК потенциального терапевтического воздействия во все опухолевые клетки, что привело к широкому развитию области, ведущей поиск нацеленных и безопасных систем доставки геннотерапевтических препаратов в опухоль[10]. Еще одним направлением, находящим ся на стадии разработки, является иммунотерапия, в частности клеточная иммунотерапия, благодаря которым к опухоли интенсивно привлекаются клетки иммунной системы[8]. Несмотря на успехи на теку щем этапе исследований универсальный противоопу холевый препарат не разработан, поиск эффективных противоопухолевых веществ так же актуален, как и десятилетия тому назад.

Панель опухолевых клеток

Современный протокол фармацевтического скрининга был принят в 1990 году Национальным Институтом Рака (National Cancer Institute, NCI, США) и включает тестирование веществ на панели из 60 клеточных линий человека опухолевого про исхождения (табл. 1). На сегодняшний день этот тест, получивший название NCI60, наиболее часто используемый тест для предварительного скрининга противоопухолевых препаратов[11].

Преимущество NCI60 состоит в том, что каждая из 60 клеточных линий формирует специфический ответ на тестируемое вещество, что позволяет по лучить уникальный набор (паттерн) биологических эффектов, который в дальнейшем можно сравнить с уже известными паттернами с помощью алгоритма COMPARE[12] и сделать предположение о механиз ме действия тестируемого вещества или, при отсут ствии в базе данных подобных паттернов, предполо жить, что механизм действия вещества отличается от ранее описанных. Кроме того, если удается иден тифицировать различные молекулярные мишени в 60 клеточных линиях, то появляется возможность выбрать те вещества, которые с большой долей ве роятности взаимодействуют со специфическими мо лекулярными мишенями.

Синтетические соединения или натуральные ве щества отбираются по их способности подавлять рост или вызывать гибель клеток в культуре in vitro. На первом этапе скрининга к трем высокочувствитель ным клеточным линиям человека MCF-7 (карцинома молочной железы), NCI-H460 (карцинома легких) и SF-268 (глиома) добавляют исследуемое вещество в стандартной концентрации и проводят инкубацию в течение 48 ч. В основе NCI60 лежит SRB-метод определения жизнеспособности клеточных культур с использованием розового анионного красителя суль фородамина В[13]. Если исследуемое вещество подавляет рост, по крайней мере, одной клеточной линии, оно переходит на следующий этап тестирова ния на полной панели из 60 клеточных линий. Теперь вещество добавляют к клеткам в пяти различных кон центрациях. Вещество проходит на стадию скрининга in vivo, если по результатам тестирования на полной панели оно оказалось способным: вызывать гибель клеток хотя бы одной клеточной линии; имеет уни кальный механизм действия и (или) может подавлять рост клеток в очень низкой концентрации. Для удоб ства все используемые в анализе клеточные линии сгруппированы в соответствии с типами опухолей, из которых они были получены. В результате, вместо анализа 60 отдельных клеточных линий, исследова тель имеет дело с 9 группами онкологических заболе ваний: лейкоз, меланома, опухоли центральной нерв ной системы, рак легких, толстой кишки, яичников, молочной железы, почки и предстательной железы. Такая система позволяет проводить быстрый скрининг цитотоксичности потенциальных противоопухолевых веществ. При этом основное внимание уделяется не самому препарату (compound-oriented), для которого предсказан определённый биологический эффект, а заболеванию, по отношению к которому препарат показал потенциальный терапевтический эффект (disease-oriented)[1].

Одним из важнейших вкладов NCI60 в развитие химиотерапии онкологических заболеваний было открытие противоопухолевых свойств бортезомида (PS-341) - препарата для лечения миеломы[14]. PS-341 (дипептид борной кислоты) обратимо ингиби рует химотрипсиноподобную активность протеасомы 26S - белкового комплекса, который катализирует расщепление основных белков и регулирует их вну триклеточные концентрации. PS-341 проявляет высо кую цитотоксичность по отношению к широкому спек тру опухолевых клеток человека и индуцирует апоптоз при низких наномолярных концентрациях[15].

Ежегодно в тестировании на стадии in vitro в NCI60 задействовано примерно 2500 соединений и только 2% из них оказываются достаточно эф фективны, чтобы перейти к стадии тестирования на мышах. Однако даже вещества, показавшие эффек тивность в системе in vitro, зачастую демонстриру ют низкую корреляцию in vivo[16, 17]. Отчасти это можно объяснить тем, что при скрининге веществ в такой системе не учитывается, что на клетки ор ганизма воздействуют такие различные факторы микроокружения, как межклеточная коммуникация, аутокринная и паракринная регуляция, а также вза имодействие клеток с трехмерным внеклеточным матриксом (ВМ)[18].

Псевдодвухмерные модели

Отдельное направление исследований - созда ние псевдодвухмерных моделей взаимодействия трансформированных (опухолевых) и нормальных (соматических, в том числе стволовых) клеток с использованием ВМ. При ко-культивировании флуоресцентно меченых мультипотентных мезенхимных стромальных клеток (ММСК) из зачатков третьего моляра человека (CD29+, CD73+, СD90+, CD105+, CD166+, CD14-, CD34-, CD45-, CD133-,) и клеток нейробластомы человека SH-SY5Y на тонком слое Матригеля (аналог внеклеточного матрикса) мы наблюдали быструю самоорганизацию ММСК и клеток SH-SY5Y с образованием блюдцеподобных образований, в центре которых располагались ММСК, а по периферии - «ореол» из клеток SH-SY5Y (рис.)[19]. Этот вид самоорганизации ко-культуры может отражать характер взаимодействия опухолевых и стволовых клеток во время метастазирования опухоли. Ранее рядом исследователей было показано, что кроветворные клетки-предшественницы, полученные из костного мозга, могут формировать кластеры-нишы для заселения опухолевыми клетками при метастазировании[20]. Хотя клетки SH-SY5Y продемонстрировали медленный рост на Матригеле, они активно росли вокруг агрегатов ММСК в кокультуре. Дополнительные исследования показали, что присутствие в ко-культуре ММСК значительно повышало жизнеспособность клеток SH-SY5Y в условиях окислительного стресса. Данное наблюдение согласуется с предыдущими работами, в которых было показано, что опухолевые клетки проявляют более устойчивый фенотип в трехмерных in vitro моделях по сравнению с однослойными культурами[21, 22]. Интересно, что ММСК показали значительную устойчивость к окислительному стрессу, что может быть связано с низким эндогенным уровнем активных форм кислорода (АФК) у стволовых клеток[23, 24] и опухолевых стволовых клеток[25]. Кроме того, ММСК в ко-культуре с опухолевыми клетками также приобрели большую жизнеспособность в условиях окислительного стресса, поскольку известно, что опухолевые клетки активно секретируют различные биологически активные молекулы, обладающие защитными свойствами (например, способствующие выживанию, пролиферации и метастазированию опухолевых клеток). Таким образом, предложенная нами модель взаимодействия стволовых и опухолевых клеток может быть полезной при моделировании различных онкологических процессов in vitro.

Модифицированная камера Бойдена

Изначально камера Бойдена, двухполостная ка мера с полупроницаемой мембраной, широко ис пользовалась для изучения хемотаксической ак тивности лейкоцитов и других неадгезивных in vitro клеток, а также хемоаттрактантной активности веществ, выделяемых различными типами клеток[26]. Хемотаксическая активность клеток оцени валась путем аспирации среды в одном из отсеков камеры и определением количества мигрировавших клеток с использованием спектрофотометра или гемоцитометра[27, 28].

В настоящее время камеру Бойдена адаптирова ли также для исследования миграции опухолевых клеток через монослой эндотелиоцитов или фильтр, покрытый Матригелем, под действием различных хемоаттрактантов, что имитирует процесс инвазии в естественных условиях[29]. При скрининге противо опухолевых препаратов оценивается их способность подавлять процесс миграции опухолевых клеток. Опухолевые клетки после прохождения мембраны адгезируются на ее нижней стороне, поэтому для детекции их метят флуоресцентными или радиоак тивными метками. Однако основными недостатками данной модели является отсутствие прямого меж клеточного взаимодействия, что не позволяет моде ли в полной мере имитировать опухоль in vivo.

Доклинические исследования анти-ангиоген ного и противоопухолевого препарата SIM010603 включали изучение его влияния на хемотаксис VEGF-индуцированных эндотелиальных клеток аор ты свиньи PAE-KDR, сверхэкспрессирующих KDR, с использованием модифицированной камеры Бой дена. Было показано, что SIM010603 дозозависимо ингибирует хемотаксис данной клеточной линии, что указывает на его анти-ангиогенные свойства[30]. В других исследованиях с использованием камеры Бойдена было показано, что препарат LJJ-10 инги бирует миграцию и инвазию клеток остеосаркомы U-2 OS[31]. Оба препарата являются ингибиторами рецепторов тирозин-киназы. Также с помощью рас сматриваемой модели была продемонстрирована эффективность препарата Trichostatin A (TSA, инги битор гистондезацетилазы) в подавлении инвазии клеток остеосаркомы[32].

Микрофлуидные системы

Микрофлуидные системы имеют большой потен циал в исследовании миграции опухолевых клеток при воздействии на них тестируемого препарата. Си стема состоит из камеры, имеющей два канала для доставки реагентов. Клетки в ростовой среде или в составе ВМ (например, Матригеля) вводятся в один из каналов и прикрепляются ко дну камеры. Затем в другой канал вводят тестируемое вещество с гради ентом концентрации и наблюдают за миграцией кле ток в ответ на исследуемое вещество. При исполь зовании такой камеры расход клеток и тестируемого вещества минимален, однако требуется ежеднев ная замена ростовой среды. На сегодняшний день микрофлуидные системы находятся на стадии упро щения и автоматизации, что сделает их использова ние доступным и легким. Микрофлуидные системы открывают перспективу одновременного управления несколькими параметрами микроокружения[33].

Трехмерные модели клеточных культур

В настоящее время развиваются трехмерные мо дели культивирования клеток, в которых, в отличие от плоской поверхности, на которой выращивают монослойные культуры, клетки растут либо в трех мерном окружении, либо внутри матрикса или кар каса с трехмерной архитектурой. При таком спосо бе культивирования клетки из монослоя переходят в многослойную культуру, образуя модель тканей опухоли[22]. Транспорт лекарственных препаратов к клеткам-мишеням в таких структурах имеет ряд препятствий, таким образом имитируются физиоло гические барьеры, влияющие на доставку лекарств in vivo[18].

Модель многоклеточных сфероидов

Наиболее исследованной является модель много клеточных сфероидов[34]. Сфероиды представля ют собой самоорганизованные сферические кла стеры-колонии с тканеподобной архитектурой[35]. Клетки в сфероиде приобретают большее сходство с клетками естественной опухоли, чем те же клетки, выращенные в монослойной культуре[35, 37]. Мор фологическое сходство сфероида с опухолью связа но с потерей опухолевыми клетками неестественной распластанной морфологии, характерной для моно слойной культуры[38]. В составе крупных (более 500 мкм) сфероидов можно условно выделить три зоны клеток: в центре находится зона погибших клеток, окруженная внутренним слоем живых по коящихся клеток, снаружи от которого расположена зона активно пролиферирующих клеток[39]. Та кое же строение имеют районы плотных опухолей с плохой васкуляризацией, что связано с затрудне нием диффузии питательных веществ и кислорода к центральным клеткам, а также со сложностью вы вода продуктов метаболизма[40]. Подобно опухоли in vivo, сфероид формирует внеклеточный матрикс[41], межклеточные взаимодействия и взаимодей ствия клеток с матриксом[42]. Клетки в сферои де дифференцируются подобно опухоли in vivo и сохраняют состояние дифференцировки в течение нескольких недель[43]. Различаются и профили экспрессии генов, отвечающих за ангиогенез, ми грацию и инвазию клеток[35]. В сфероиде клетки растут медленнее, чем те же клетки, выращенные в монослое на плоской поверхности[36, 44]. Повы шенная выживаемость клеток в сфероидах связана с минимизацией метаболизма, расходования АТФ и кислорода в агрегатах по сравнению с монослойной культурой[40]. Так же как для сóлидных опухолей и метастазов in vivo, рост сфероида можно моделиро вать с помощью математических моделей, примени мых для описания опухолей[45].

Новые свойства опухолевых клеток, общие для сфероида и опухоли in vivo, определяют изменение в чувствительности ко многим противоопухолевым пре паратам по сравнению с монослойными культурами[39, 46, 47]. Механизм приобретения устойчивости к лекарственным препаратам, вероятно, связан с уси лением межклеточных взаимодействий, на которое влияют клеточная адгезия, растворимые факторы, вырабатываемые опухолевыми клетками, и микро окружение (например, низкий pH и гипоксия)[18]. Традиционным методом получения сфероидов яв ляются культивирование клеток в «висячих каплях» на неадгезивных поверхностях с использованием ко нических центрифужных пробирок или биореакторов[39, 48]. Низкая производительность стандартных способов получения сфероидов и образование боль шого числа агрегатов разного размера создают неко торые трудности в широком применении данной мо дели для скрининга веществ. На сегодняшний день достигнуты большие успехи в автоматизированном получении сфероидов[34, 47]. С помощью данных систем можно проводить эксперименты, используя такие высокопроизводительные приборы, как план шетные спектрофотометры, автоматизированные системы визуализации и анализа[47]. Примером могут служить микрофлуидные системы с точным геометрическим ограничителем, с помощью которых можно получить сфероиды одинакового размера в высокой концентрации для дальнейшего более точ ного определения эффективности противоопухоле вых препаратов[18].

Трехмерные культуры можно использовать для ис следования цитотоксичности препаратов на нормаль ных клетках, например, на гепатоцитах. В отличие от монослойной культуры гепатоцитов, эти же клетки, организованные в сфероид, имеют повышенную вы живаемость и надолго сохраняют способность к ме таболизированию вредных веществ[39, 40, 43, 44]. Недостатком трехмерных культур является труд ность наблюдения за клетками. Несмотря на разра ботку систем визуализации, предназначенных для отслеживания изменений, происходящих с клет ками в трехмерных структурах, примером которой является флуоресцентный микроскоп, основанный на принципе LSFM (Light Sheet-based Fluorescence Microscopy)[49], более доступной на сегодняшний день является так называемая «сэндвич»-система, в которой монослой опухолевых клеток помещается в узкий зазор между двумя предметными стеклами. Рост клеток приводит к формированию ядра, содер жащего некротические клетки, с прилегающими к нему снаружи двумя слоями живых клеток, то есть образуется аналог среза с поперечного сечения сфе роида. Преимущество такой структуры в том, что все клетки можно рассмотреть под микроскопом, в от личие от сфероида, когда для анализа необходимо провести фиксацию и получить срезы. Кроме того, любой из слоев клеток может быть изолирован от общей структуры простым поднятием верхнего стек ла, после чего клетки можно анализировать вне «сэндвич»-системы[50].

Несмотря на все достоинства, модель много клеточных сфероидов не полностью соответствует ткани in vivo, поскольку сфероиды, выращенные in vitro, не участвуют в иммунном ответе и в них не наблюдается ангиогенез[18, 42]. При попытках создать эффективную систему скрининга противо опухолевых веществ обнаружили, что взаимодей ствие нормальных клеток, прилежащих к опухоли, с опухолевыми клетками определяет агрессивность опухоли и ее ответ на противоопухолевые препараты[51, 52]. Генетические мутации клеток стромы, при легающих к опухоли, при некоторых онкологических заболеваниях, а также участие этих клеток в при обретении устойчивости опухоли к терапевтическим препаратам подтверждают эту теорию[53].

Трехмерные культуры, выращенные с использованием матрикса ВМ играет роль структурной поддержки клеток в ткани и является важным компонентом клеточного микроокружения. Благодаря различным природе и составу ВМ способен выполнять ряд других важных функций, включая регулирование межклеточного взаимодействия[54]. Таким образом, включение компонентов ВМ в систему in vitro позволяет полу чать трехмерную структуру с более точной имитацией клеточного микроокружения. На основе природного ВМ получены гидрогели, то есть каркасы с большим содержанием воды для роста клеток, которые состо ят из коллагена, фибрина, гиалуроновую кислоты, Матригеля и др. Также природные гидрогели могут быть получены из других биологических источников, примером могут служить хитозан и алгинат. Такие гели биосовместимы и биоактивны[55]. Однако сложный характер природного ВМ[54] ограничи вает его применение в системе in vitro в связи со сложностью стандартизации и интерпретации био логического действия отдельных компонентов ВМ. Вот почему синтетический внеклеточный матрикс (например, изготовленный из полиэтиленгликоля или поливинилового спирта) становится привлека тельной заменой для трехмерных моделей in vitro с потенциально хорошей корреляцией результатов in vitro и in vivo[55-57]. Матрицы на основе синтети ческих материалов являются химически чистыми, не содержат неохарактеризованные ростовые факторы и другие «загрязняющие» вещества. Кроме того, их достаточно просто получить. Недостатком синтети ческих гидрогелей является отсутствие сигнальных молекул, которые секретируется клетками тканей в природный ВМ[44]. Поскольку состав и плотность трехмерной матричной системы можно экспериментально контролировать, подобная система может более адекватно имитировать естественное микро окружение клеток и может быть применена для кон кретных типов клеток с различной морфологией и поведением. Также существуют гибридные матрицы, которые представляют собой синтетический каркас, содержащий молекулы пептидов, встречающиеся в составе белков природного ВМ. Часто в составе гибридной матрицы можно встретить пептид, со держащий мотив RGD (Arg-Gly-Asp), который при сутствует в составе фибронектина, витронектина и фибриногена[58]. Такая сшивка позволяет матри це эффективно связывать большинство интегринов клетки, что приводит к усилению клеточной адгезии, когда это необходимо[44, 58]. Применение матриц для формирования трехмерных структур позволяет исследовать миграцию клеток, инвазию, метастази рование и ангиогенез при воздействии различных противоопухолевых препаратов.

Микроокружение опухоли можно моделировать, используя для этого гетерологичные трехмерные культуры, которые состоят из опухолевых клеток и стромальных фибробластов, остеоцитов, нейро нов, макрофагов, эпителиальных или эндотелиаль ных клеток[44, 46, 59]. При ко-культивировании клеток можно использовать каркас из ВМ[59], а можно обойтись без него, вырастив обе культуры в составе одного сфероида[48]. Такие системы ко культивирования можно использовать для тестиро вания лекарств и для скрининга агентов, действую щих на взаимодействие опухолевой и нормальной клетки микроокружения. Гетерогенные культуры сохраняют ряд преимуществ, присущих отдельным культурам, также сохраняются межклеточные взаи модействия и взаимодействие клеток с матриксом[43]. С помощью таких культур исследуют влияние противоопухолевых веществ на инвазию и метаста зирование[39].

Многоклеточные слои

Многоклеточные слои представляют собой раз новидность трехмерных культур, разработанные для прямого измерения диффузии лекарственных препаратов в опухолевом микроокружении[60]. В этой модели клетки выращивают на микропори стой тефлоновой мембране, покрытой коллагеном. Мембрану погружают в большой объем ростовой среды и постоянно помешивают. Это приводит к формированию симметричного многоклеточного слоя с ядром из некротических клеток и окружаю щих его живых тканей. Такой многоклеточный слой можно получить для многих клеточных линий, даже для тех, которые не образуют сфероиды[18]. Важ ное преимущество такой культуры перед другими моделями трехмерных структур состоит в возмож ности прямого измерения потока лекарственных препаратов через многоклеточный слой. Для этого исследуемое вещество добавляют с одной стороны от мембраны и измеряют кинетику его появления с другой стороны, используя аналитические ме тоды, например, высокоэффективную жидкост ную хроматографию[60]. Это свойство сделало многоклеточные слои отличным инструментом для исследования внесосудистого транспорта противо опухолевых веществ, таких как низкомолекулярные лекарственные препараты, пролекарства и макро молекулярные агенты[18].

Использование модели многоклеточных сло ев для исследования проникновения в опухоль противораковых лекарств проиллюстрировано на примере гипоксического цитотоксина тирапазами на (hypoxia-selective cytotoxin tirapazamine, TPZ), который в настоящее время проходит третью фазу клинических исследований. TPZ проявляет высо кую селективную цитотоксичность по отношению к клеткам, находящимся в условиях гипоксии[61]. Гипоксические клетки представляют собой важную целевую популяцию в опухолях из-за их устойчи вости к радио- и некоторым формам химиотера пии. Также показана их роль в прогрессировании опухоли[62]. Исследования с многоклеточными сфероидами V79 показали снижение активности TPZ по отношению к клеткам «ядра» в условиях ги поксии всего сфероида. Это свидетельствует о том, что способность TPZ проникать через ткани в со стоянии гипоксии может быть ограничено в связи с быстрой метаболитической деградацией препара та[63]. Данное предположение было подтверждено в дополнительных экспериментах с многоклеточны ми сфероидами V79, в которых показано сниже ние транспорта TPZ в условиях полного отсутствия кислорода (аноксия)[64], и с клетками карциномы мочевого пузыря человека MGH-U1.

Гистологические методы анализа

Широко используемым методом моделирования естественного микроокружения является органо типическая модель, в которой получают тканевые экспланты. В данной системе часть живой ткани опухоли пациента удаляют, затем с помощью ви братома готовят срезы толщиной 400 мкм, кото рые инкубируют in vitro в течение нескольких суток. Использование этого метода позволяет сохранить основную архитектонику ткани и индивидуальную вариабельность опухоли[49]. Тканевые экспланты используются почти во всех областях биомедицин ских исследований. Однако и такая модель имеет недостатки, такие как сложность в получении об разцов, стандартизации и этических ограничениях[39, 53].

Для исследования инвазии опухолевых клеток в головной мозг млекопитающих была разработана in vitro модель, объединившая камеру Бойдена и орга нотипическую модель срезов мозга[65, 66]. Обыч ные фильтры, используемые в камере Бойдена, на пример покрытые Матригелем, не могут обеспечить необходимые для инвазии сигналы. Такие сигналы вырабатываются при прямом контакте опухолевых клеток с нормальными клетками мозга. Если в каче стве фильтра в камере Бойдена использовать срезы тканей мозга, то такие сигналы сохраняются и по является возможность исследовать механизм опу холевой миграции и тестировать противоопухолевые препараты, действующие на инвазию клеток[65]. Так же как и сами тканевые экспланты, эта модель имеет проблемы со стандартизацией изготовления органотипических культур. Кроме того трехмерная архитектура затрудняет наблюдение за состоянием клеток в режиме реального времени.

Альтернативной является модель органотипиче ского ко-культивирования, при которой миелиновые аксоны эмбриона цыпленка культивируют совместно с опухолевыми клетками. Глиомные клетки поме щают вблизи эксплантов (при этом два компонен та системы не соприкасаются) и наблюдают за их инвазией[67]. В связи с двухмерной организацией подобной системы возможно наблюдение in vitro за поведением живых клеток при помощи видеоско пии в реальном времени. Тем не менее, остается проблема стандартизации и интерпретации таких органотипических культур. Любая система на осно ве органотипических культур содержит множество различных типов клеток и, хотя подобная гетероген ность позволяет точнее моделировать клеточное микроокружение, контроль за поведением и анализ отдельных клеточных субпопуляций остается непро стой задачей.

Заключение

Человечество долгое время ведет поиски эффек тивной системы скрининга противоопухолевых ве ществ in vitro. Сначала это было тестирование толь ко на монослойных опухолевых клеточных линиях, затем появились трехмерные модели культивирова ния опухолевых клеток, что значительно приблизило систему скрининга к реальной ситуации в тканях in vivo. Актуальными остаются и гистологические ме тоды исследования. На сегодняшний день разрабо тано множество систем скрининга, но ни одна из них не гарантирует полную корреляцию данных in vitro и in vivo. У каждой из систем имеются серьезные не достатки. Следовательно, используя для тестирова ния противоопухолевых веществ только один из спо собов, мы получаем ограниченное представление о действии вещества на клетки. Для получения досто верных результатов целесообразно проверять сходи мость результатов, полученных при использовании разных способов тестирования, выводить системы тестирования на уровень высокопроизводительного скрининга, повышать возможности систем визуали зации клеток. Возможно, развитие тканевой инже нерии или исследование действия и привлечение в имеющиеся системы «стволовых опухолевых» кле ток позволит улучшить предиктивность систем скри нинга противоопухолевых веществ. Очевидно, что для точной интерпретации биологических эффектов необходим компромисс между сложностью системы и способностью исследователя анализировать слож ные взаимодействия среди различных клеточных компонентов.

Подняться вверх сайта