Поиск Кабинет

Применение электроаналитических методов для характеристики клеток человека

Гены & Клетки: Том VII, №1, 2012 год, стр.: 86-91

 

Авторы

Сайфуллина Д.В., Шахмаева И.И., Бондарь О.В., Абдуллин Т.И.

ДЛЯ ТОГО ЧТОБЫ СКАЧАТЬ СТАТЬЮ В ФОРМАТЕ PDF ВАМ НЕОБХОДИМО АВТОРИЗОВАТЬСЯ, ЛИБО ЗАРЕГИСТРИРОВАТЬСЯ

Бурное развитие клеточных технологий обусловливает востребованность информативных и экспрессных методов оценки жизнеспособности и физиологической активности клеток человека. В работе исследованы возможности новых инструментов для комплексного анализа биоэлектрохимических свойств клеток: поверхностного заряда клеточной мембраны и окислительно-восстановительной активности метаболитов. С применением анализатора динамического светорассеяния Malvern Zetasizer (Malvern Instruments) предложен подход к характеристике дзета-потенциала клеток человека и выявления на их поверхности фосфатидилсерина – раннего маркера апоптоза. На основе модифицированных электродов разработаны сенсоры, обладающие высокой чувствительностью к электроактивным метаболитам клеток: антиоксидантам и макроэргическим молекулам. Сенсоры применены для оценки метаболической активности/энергетического статуса клеток человека. Электрохимический сигнал адениновых нуклеотидов клеток на поверхности сенсора коррелирует с внутриклеточным содержанием АТФ по данным люциферазного метода и более чувствителен к изменению жизнеспособности клеток, чем метаболический MTS-тест. Разработан прототип портативного анализатора на основе печатного электрода, предназначенный для экспресс-оценки состояния клеток в суспензии, в том числе, различных донорских клеток, в объеме пробы менее 5 мкл. Предложенные инструменты и методы актуальны для трансплантации клеток, фундаментальных исследований и медицинской диагностики.

Трансплантация клеток является одним из наиболее эффективных подходов в лечении широкого спектра наследственных и приобретенных заболеваний, включая травмы и дегенеративно-дистрофические процессы различной этиологии [1]. Пересадку клеток костного мозга, а также переливание тромбоцитарной массы рутинно проводят в клинической практике для восстановления кроветворной функции после химиотерапии при лейкемии [2, 3].

Выраженным регенеративным потенциалом в отношении различных тканей организма обладают как специализированные клетки (фибробласты, эпителиальные клетки, леммоциты), так и мультипотентные мезенхимные стромальные и гемопоэтические стволовые клетки. С использованием подобных клеток к настоящему времени предложено и продолжает разрабатываться множество протоколов для терапии нейродегенеративных [4], сердечно-сосудистых заболеваний [5–7], сахарного диабета [8], патологий печени [9, 10], повреждений кожных покровов и др. заболеваний [11, 12].

Введению в организм реципиента донорских клеток, как правило, предшествует целый ряд манипуляций с ними, в том числе криоконсервация, хранение, культивирование, которые могут существенно влиять на состояние клеток и их биологические свойства [13]. Весьма актуальной проблемой клеточной трансплантологии является применение информативных и удобных методов анализа качества клеток человека, включая уровень их жизнеспособности и функциональной активности. Подобный скрининг призван обеспечить максимальный терапевтический эффект и уменьшить риск побочных эффектов при пересадке клеток [14, 15].

В настоящее время для исследования клеток человека широко применяют оптическую микроскопию и проточную цитометрию, которые в сочетании с различными флуоресцентными зондами позволяют проводить качественный и количественный анализ жизнеспособности, апоптоза, выявлять биомаркеры клеток [13, 14, 16, 17]. Несмотря на несомненную значимость, отмеченные методы являются достаточно дорогостоящими, длительными и чувствительными к условиям анализа. Бурное развитие клеточных технологий обусловливает необходимость и в более удобных и экспрессных аналитических инструментах для выявления ранних изменений физиологической активности клеток.

Для решения данной задачи целесообразно использовать электрохимические методы, позволяющие изучать фундаментальные процессы переноса заряда с участием клеток и их компонентов [18, 19]. Ключевыми электрохимическими параметрами живых клеток являются поверхностный заряд, а также окислительно-восстановительная активность клеточных компонентов. На примере тромбоцитов показано, что заряд, оцениваемый по величине их электрокинетического потенциала, напрямую зависит от состава и свойств плазмалеммы и служит важным диагностическим показателем [20]. Будучи электрохимически активными, многие биомолекулы способны окисляться/восстанавливаться на электродах при характерном потенциале [19]. Благодаря этому можно проводить электрохимическое определение важнейших клеточных метаболитов, содержание которых отражает физиологическую активность и «здоровье» клеток [21].

В настоящей работе нами исследованы возможности двух современных инструментов для электроанализа клеток человека: анализатора динамического рассеяния света Malvern Zetasizer (Malvern Instruments) и разработанных нами ранее электрохимических сенсоров на основе электродов, модифицированных углеродными нанотрубками [22–25]. С помощью этих инструментов предложены эффективные методы анализа цитоплазматической мембраны и метаболического профиля, которые представляют интерес для экспресс-диагностики состояния донорских клеток и для фундаментальных исследований.

Материал и методы

Культивирование клеток. Реагенты для работы с культурами клеток произведены НПП ПанЭко. Клетки эндотелия матки (HeLa) и фибробласты кожи человека культивировали в среде DMEM с добавлением 10% телячьей эмбриональной сыворотки, 2 мМ L-глутамина, 100 мкг/мл стрептомицина и 100 ед./мл пенициллина. Клетки выращивали в полистироловых флаконах и после образования монослоя промывали раствором Хэнкса и диссоциировали обработкой 0,05% трипсином-ЭДТА. Концентрацию клеток в суспензии в ФСБ определяли на гемоцитометре; количество жизнеспособных оценивали путем избирательного окрашивания мертвых клеток трипановым синим, а также смесью акридинового оранжевого – этидия бромида (5 μg/мл) на флуоресцентном микроскопе Axio Vision (Carl Zeiss). Для уменьшения жизнеспособности клетки подвергали тепловому шоку путем прогревания суспензии при 45°С в течение 15 и 30 мин.

Выделение клеток из крови человека. Эритроциты и мононуклеары выделяли из периферической крови здоровых доноров, стабилизованной 0,27% ЭДТА в качестве антикоагулянта. Кровь отстаивали в пробирке в течение 60 мин. для осаждения эритроцитов. Содержащую лейкоциты плазму разделяли в градиенте плотности (1,077 г/мл) фиколл-пака при ×400g в течение 40 мин [26]. Содержащий мононуклеары слой отбирали, промывали центрифугированием и суспендировали в ФСБ.

Анализ дзета-потенциала клеток. Дзета-потенциал клеток в суспензии (0,5×106/мл) регистрировали методом электрофоретического светорассеяния на анализаторе Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments). Измерения проводили в U-образной кювете с позолоченными электродами при рН 7,0 и температуре 25°C. Результаты обрабатывали с помощью программного обеспечения Dispersion Technology Software 6.2 (Malvern Instruments).

Анализ жизнеспособности и АТФ клеток. Клетки помещали в 96-луночную планшету (2 тыс. клеток в лунке) и культивировали в течение 2 сут. в присутствии доксорубицина в различных концентрациях в стандартных условиях. Количество жизнеспособных клеток определяли по поглощению продукта метаболического восстановления тетразолия MTS (Promega) при 490 нм на микропланшетном анализаторе Stat Fax 2100 (Awareness Technology).

АТФ в клетках определяли в реакции с люциферазой с помощью биолюминесцентного набора, согласно рекомендациям производителя (Люмтек, Россия). Для этого лизаты обработанных клеток смешивали со свежеприготовленным раствором люциферазы (2000 ед/мл) и далее регистрировали интенсивность люминесценции при 570 нм на хемилюминометре Хемилюм-12 (Пущино, Россия). Для проточной цитометрии клетки (1×106/мл) обрабатывали смесью FITC-аннексина V и пропидиума йодида в связывающем буфере в соответствии с протоколом производителя (BD Biosciences). Анализ проводили на цитометре BD FACSCalibur (BD Biosciences); количество флуоресцентных событий составляло более 1000.

Электрохимические измерения. Для определения внутриклеточных метаболитов клетки лизировали путем гипоосмотического шока в деионизованной воде. Для предотвращения деградации метаболитов лизаты замораживали до проведения анализа. В качестве сенсоров использовали стеклоуглеродные электроды (диаметр 1,5 мм), модифицированные многослойными углеродными нанотрубками. Ранее нами показано, что модифицированные сенсоры характеризуются пористой наноструктурированной поверхностью и воспроизводимыми электрохимическими свойствами [22–24].

Электрохимические измерения проводили в трехэлектродной ячейке, состоящей из модифицированного сенсора в качестве рабочего электрода, хлоридсеребряного электрода сравнения (Ag/AgCl) и никелевого противоэлектрода. Аликвоту суспензии или лизата клеток (5 μл) известной концентрации наносили на поверхность сенсора и выдерживали 5 мин. для адсорбции клеточных компонентов. Далее сенсор с адсорбатом переносили в фоновый электролит (0,1 М хлорид натрия + 0,01 М ацетат натрия, рН 5,0) и регистрировали сигнал окисления в режиме квадратноволновой вольтамперометрии на потенциостате/ гальваностате Autolab PGSTAT12 (EcoChemie) в отсутствии электроактивных компонентов в растворе.

Результаты и их обсуждение

Для анализа электрических свойств мембраны животных клеток широко применяют микроэлектрофорез и капиллярный электрофорез, с помощью которых подтверждают ряд заболеваний человека [27, 28], а также изучают процессы дифференцировки и взаимодействия клеток [29, 30]. Перспективной альтернативой является метод динамического светорассеяния (ДСР), основанный на зависимости частоты/ фазы колебаний рассеиваемого света от подвижности диспергированных в растворе частиц и клеток [31].

Нами охарактеризованы электрические свойства различных клеток человека методом ДСР на анализаторе Malvern Zetasizer. На примере клеток эндотелия матки выяснено, что при рН 7,0 суспендированные клетки генерируют однородную кривую дзета-потенциала с максимумом при 19,4 мВ (рис. 1). Регистрируемый дзета-потенциал является мерой потенциала двойного электрического слоя на поверхности клетки [30], значение которого зависит от биохимического состава плазмалеммы. Фибробласты кожи и мононуклеары человека обладали сходными с клетками эндотелия матки значениями дзета-потенциала (-23,2 и -21,9 мВ соответственно), тогда как дзета-потенциал эритроцитов составил -31,8 мВ (табл.). Отрицательные значения потенциала клеток при физиологических рН, очевидно, являются следствием суммарного присутствия в плазмалемме фосфолипидов, белков и их конъюгатов с полисахаридами.

Установлено, что дзета-потенциал липосом из фосфатидилхолина – преобладающего мембранного липида – составляет почти -62 мВ, указывая на значимый вклад липидов в суммарный заряд клеточной мембраны. Тот факт, что в сравнении с липосомами животные клетки (эндотелиоциты матки, фибробласты, мононуклеары крови) характеризуются меньшим зарядом (см. табл.), можно объяснить присутствием в составе липидного бислоя белков и остатков нейтральных углеводов. Эритроциты, в отличие от других исследуемых клеток, имели почти на 10 мВ более отрицательный дзета-потенциал, что объясняется наличием на поверхности эритроцитов большого числа отрицательно заряженных остатков сиаловой кислоты [32].

Мы проследили изменение дзета-потенциала клеток эндотелия матки при уменьшении их жизнеспособности после теплового шока. Обнаружено, что после 30 мин. обработки при 45°С дзета-потенциал клеток увеличивался почти на 4,2 мВ: с -19,4±0,8 до -23,6±0,8 мВ. По данным проточной цитометрии, подобная обработка приводила к уменьшению количества жизнеспособных клеток почти на 62%, регистрируемое по появлению клеток, окрашиваемых пропидиум йодидом, а также к увеличению числа FITC-аннексин-позитивных клеток почти на 68%. В условии отсутствия вносимых в суспензию клеток химических агентов, способных влиять на дзетапотенциал, регистрируемое увеличение последнего, вероятно, обусловлено изменением состава плазмалеммы при клеточной гибели.

Существенное увеличение числа окрашиваемых FITC-аннексином клеток после тепловой обработки свидетельствует о повышении содержания на внешнем слое плазмалеммы фосфатидилсерина [33]. В отличие от электронейтрального цвиттер-иона фосфатидилхолина, молекула фосфатидилсерина имеет в физиологических условиях значительный отрицательный заряд вследствие наличия карбоксильной группы. Это дополнительно свидетельствует о том, что повышение отрицательного заряда клеток при тепловом шоке, по-видимому, связано с экспозицией фосфатидилсерина на внешнем слое клеточной мембраны, сопутствующей апоптозу и некрозу [34].

Полученные результаты демонстрируют возможность применения метода ДСР для характеристики клеток человека по их поверхностному заряду, в том числе для выявления фосфатидилсерина – раннего маркера апоптоза [34]. Предложенный подход представляет интерес для разработки быстрых, требующих минимальной пробоподготовки методик анализа мембран донорских клеток и оценки понижения их жизнеспособности до и после презервации. Актуальным направлением применения ДСР является исследование электрохимических свойств мембран клеток при патологии, различных воздействиях, а также процессах клеточной дифференцировки и развития [35].

Наряду с поверхностным зарядом важным электрохимическим параметром животных клеток является уровень окислительно-восстановительной активности их метаболитов. Для анализа клеточных метаболитов мы применили сенсор на основе электрода, модифицированного углеродными нанотрубками. Последние обеспечивают эффективную адсорбцию биомолекул на электроде и увеличивают сигнал их окисления при характерных потенциалах [22–24]. Благодаря этому, модифицированные сенсоры (МС) могут быть использованы для прямого чувствительного определения редокс-активных метаболитов клеток.

Установлено, что суспендированные в ФСБ мононуклеары крови генерируют на поверхности МС три пика окисления при потенциалах +0,8; +1,05 и +1,2 В, обозначенные как пик 1, 2 и 3 соответственно (рис. 2). Сходный сигнал производили и другие исследуемые в работе клетки. По нашим данным, регистрируемый сигнал обусловлен ключевыми клеточными метаболитами. В частности, при потенциале пика 1 обнаруживаются аминокислоты и пептиды, включая глутатион, а также НАД(Ф)Н. Отмеченные биомолекулы, в особенности, основной внутриклеточный антиоксидант глутатион, проявляют выраженные антиокислительные свойства [36–38], что коррелирует с их относительно низким потенциалом окисления. Пики 2 и 3 соответствуют гуаниновым и адениновым нуклеотидам, и их величина, по-видимому, отражает присутствие в клетках соответственно ГТФ и АТФ – ключевых макроэргических молекул.

Внутриклеточное содержание адениновых нуклеотидов, в особенности АТФ, является важным биохимическим показателем интенсивности метаболических процессов в клетке. Концентрация АТФ в клетках служит полезным диагностическим маркером для оценки их жизнеспособности [39], индукции апоптоза [40, 41], повреждения кардиомиоцитов [42] и функциональности сперматозоидов [43].

Мы изучили возможность анализа АТФ и энергетического статуса клеток человека с помощью МС. Сигнал окисления АТФ, адсорбированного на МС, линейно увеличивался в диапазоне концентраций 0,05–15 мМ согласно уравнению: I (μA) = 0,03±0,15 + 0,6±0,03 × C (mM); R = 0,99, что свидетельствует о широком диапазоне линейной зависимости и воспроизводимости анализа АТФ.

Для определения внутриклеточного АТФ на МС клетки предварительно лизировали путем гипоосмотического шока для высвобождения метаболитов. Добавление 0,5 мМ АТФ к лизату клеток эндотелия матки приводило к увеличению пика 3 до величины 1,12±0,10 μA, почти равной сумме пиков, генерируемых отдельно АТФ (0,65±0,03 μА) и лизатом клеток (0,42±0,04 μА) в тех же концентрациях. Это указывает на возможность количественного анализа АТФ в лизатах клеток с использованием МС. Учитывая тот факт, что другие адениновые нуклеотиды, наряду с АТФ, также могут вносить вклад в пик 3, мы оценили корреляцию величины этого пика с содержанием АТФ и жизнеспособностью клеток с помощью независимых методов.

Для уменьшения жизнеспособности клетки эндотелия матки обрабатывали доксорубицином, который, интеркалируя в ДНК, ингибирует топоизомеразу II и вызывает повреждение клеток и индукцию апоптоза [44]. С помощью пролиферативного MTS-теста предварительно были подобраны 2 концентрации доксорубицина: наибольшая нетоксичная (2 μМ) и вызывающая гибель 50% клеток в культуре (9 μМ). Значения электрохимического сигнала клеток (пик 3) после их культивирования в присутствии антибиотика приведены на рис. 3.

Установлено, что доксорубицин в концентрации 9 μМ вызывает почти 3-кратное уменьшение пика адениновых нуклеотидов в клетках, очевидно, вследствие индукции апоптоза/некроза, сопровождающихся понижением содержания энергетических молекул [40, 41]. При этом электрохимический сигнал клеток достоверно уменьшался почти на 22% уже при действии доксорубицина в концентрации 2 μМ, нетоксичной для клеток по данным MTS-теста (рис. 3).

Дополнительно, мы оценили как электрохимический сигнал клеток эндотелия матки соотносится с внутриклеточной концентрацией АТФ, детектируемого в реакции с люциферазой. В этом опыте клетки кратковременно подвергли тепловому шоку при 45°С, который сопровождался значительным падением сигнала адениновых нуклеотидов клеток на МС (рис. 4).

По данным проточной цитометрии, уже 15минутное прогревание клеток приводило к появлению около 13% апоптотических и 38% некротических клеток в суспензии. По данным люциферазного метода уменьшение электрохимического сигнала обработанных клеток коррелировало с понижением содержания внутриклеточного АТФ (рис. 4).

В совокупности результаты демонстрируют, что МС характеризуются большей чувствительностью к изменению жизнеспособности клеток, чем MTS-тест. Сигнал адениновых нуклеотидов клеток на МС отражает уровень АТФ в клетках при изменении их жизнеспособности. Разработанные сенсоры являются эффективным инструментом для анализа метаболической активности клеток человека и выявления ранних изменений в их жизнеспособности. Преимуществом сенсоров является возможность одновременного определения в нескольких микролитрах пробы клеточных метаболитов, различающихся по редокс-свойствам. Проводимый анализ не требует применения нестабильных/дорогостоящих биохимических реактивов и специализированного оборудования, используемых, например, в люциферазном методе.

Разработанные сенсоры востребованы для быстрой оценки качества клеточных биоматериалов в биотехнологии и трансплантологии, а также для диагностического скрининга патологий, сопровождающихся изменением метаболизма клеток. Нами предложен прототип электрохимического устройства для исследования метаболической активности клеток (рис. 5), состоящего из портативного анализатора и плоского электрода (screen-printed electrode), изготавливаемого с помощью технологии трафаретной печати. Используемые печатные электроды, наряду с воспроизводимыми свойствами, имеют низкую себестоимость, что является важной предпосылкой для их практического использования в биоанализе [45].

Подняться вверх сайта