Поиск Кабинет

Преемственность цитогенетических характеристик в пассажах эмбриональной герминативной клеточной линии мыши G1

Гены & Клетки: Том II, №3, 2007 год, стр.: 47-50

 

Авторы

Глазко Т.Т., Яцышина А.П., Пидпала О.В., Лукаш Л.Л.

ДЛЯ ТОГО ЧТОБЫ СКАЧАТЬ СТАТЬЮ В ФОРМАТЕ PDF ВАМ НЕОБХОДИМО АВТОРИЗОВАТЬСЯ, ЛИБО ЗАРЕГИСТРИРОВАТЬСЯ

Выполнен сравнительный анализ цитогенетических характеристик в популяциях клеток разных пассажей эмбриональной герминативной клеточной линии G1. полученной из полового бугорка 12.5-дневного эмбриона мыши линии BALB/c. Обнаружено, что несмотря на выраженную гетерогенность клеток по числу хромосом, робертсоновским транслокациям, для них характерны некоторые линейноспецифические черты кариотипа. в частности, близость числа хромосом к пента- и гексаплоидным наборам, а также присутствие транслокации t(6;12]. Обсуждается возможность связи выявленных кариотипических особенностей с линеноспецифичес-кими механизмами поддержания полипотентности и пролиферации эмбриональных герминативных клеток в культуральных условиях.

Введение

Исследования эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) и эмбриональных герминативных (ЭГ) клеток занимают цен тральное место в изучении молекулярных основ ранних эта пов эмбриогенеза и в разработках новых методов клеточ ной терапии. ЭС клетки получают из внутренней клеточной массы бластоцист, ЭГ - потомки примордиальных герми нативных клеток. Эти клетки имеют общие характеристики плюрипотентности, к которым относятся неограниченная пролиферация, экспрессия ряда маркеров эмбриональных клеток, в частности, щелочной фосфатазы, Oct 4, а также способность дифференцироваться в производные всех трех зародышевых листков [1]. Считается, что кариотипическая эволюция таких эмбриональных клеток под влиянием уело вий культивирования может быть одной из причин сниже ния плюрипотентных свойств на более поздних пассажах [2].

В то же время, ранние события формирования линий эмбриональных клеток, специфика селекции клеточных кло нов после прохождения «кризиса», типичного для адапта ции клеток к новым условиям их культивирования in vitro [3], до сих пор остаются недостаточно исследованными в связи с ограниченностью количества клеток на этих пассажах. Важность изучения ранних событий обусловлена тем, что традиционно кариотипический анализ выполняется на преобладающих («модальных») клеточных клонах, успешно переживших такой «кризис», что не исключает присутствия «минорных» вариантов и изменений их соотношений в процессах пассирования клеток. Так, кариотипирование независимо полученных 88 ЭСК линий мышей показало, что «нормальный» кариотип, как модальный в большинстве кле ток, обнаруживается только в 53 из них, причем в 52 линиях состав половых хромосом был XY, а у одной линии - XX; все остальные ЭСК линий несли различные типы цитогенетичес ких аномалий [4].

В целях исследований преемственности кариотипичес ких характеристик в разных пассажах ЭГ клеток в настоя щей работе выполнен анализ клеточных популяций ЭГ G1, полученных из полового бугорка 12,5 дневного эмбриона мыши линии BALB/с [5, 6].

Материал и методы

В анализ включены популяции клеток G1, полученные на 15 м и 75 м пассажах после их выделения из полового бу горка 12,5 дневного эмбриона мыши линии BALB/с, а так же три пассажа (35/14, 35/26 и 35/40) сублинии G1 ОА, выделенной из G1 на 35 м пассаже путем селекции на не зависимый рост от сывороточных факторов (1%) (5, 6]. Me тодика получения метафазных пластинок детально описана в работе [6]. Клетки суспендировали и инкубировали 30 мин в растворе KCI (0,56%) при +37°С. Хромосомы фиксирова ли смесью метилового спирта и ледяной уксусной кислоты (3:1), трижды меняя фиксирующий раствор. Препараты рас капывали на холодные мокрые стекла, высушивали и окраши вали красителем Гимза («Merck», Германия). Окрашенные цитогенетические препараты анализировали с помощью микроскопа Carl Zeiss при увеличении в 10ОО раз. Метафаз ные пластинки фотографировали при помощи цифрового фотоаппарата Canon (PowerShot G6, Great Britain). Индиви дуальное типирование хромосом проводили в соответствии с данными Cowell J.K. (7). Анализировали количество хромо сом и их качественный состав; для отдельных метафазных пластинок составляли кариограммы. Подсчет количества хромосом (Хр) в клетках выполняли на фотографиях мета фазных пластинок.

Изменчивость клеточных популяций по числу Хр харак теризовали по следующим показателями: пределам варьи рования, долей клеток с модальным числом Хр и шириной модального класса. В связи с выраженным разнообразием ЭС клеток по количеству Хр учитывали количество клеток (в процентах от общего количества рассмотренных клеток) с близкими числами Хр, которые встречались чаще, чем дру гие, и обозначали его как условно модальное число Хр.

Результаты и обсуждение

Анализ распределения клеток по числу хромосом позво лил выявить их широкое разнообразие во всех исследован ных пассажах клеток (табл.1). По данным, представленным в этой таблице, видно, что клетки на протяжении 75 пасса жей сохраняют высокий уровень гетерогенности по присут ствию различных клонов, отличающихся по числу Хр. Тем не менее, наблюдается определенная предпочтительность по представленности среди них клеток с гиперпента и гипо гексаплоидным набором Хр (см. табл. 1).

Наиболее гетерогенной по присутствию клеток с разным числом Хр оказалась клеточная популяция линии G1 самого раннего из исследованных пассажей, G1 15. По сравнению с другими пассажами в ней выявляется относительно по вышенная частота встречаемости гипергексаплоидных кле ток (см. табл. 1). В пассажах сублинии G1 ОА, полученной путем селекции клеток на среде, обедненной сывороточны ми факторами, по сравнению с 15 м и 75 м пассажами линии G1, обнаруживается некоторая стабилизация клеток по числу Хр с тенденцией к увеличению доли гипотетрапло идных гипопентаплоидных клеток к 35/40 му пассажу сублинии G1 ОА.

Во всех рассмотренных клеточных популяциях наблюда ется высокая частота центрических слияний Хр (робертсонов ских транслокаций, РБ). В исходной линии ЭСК G1 на 15 м пассаже они встречались с частотой 2,1 ±0,3 на одну клет ку. Не уменьшалась частота их встречаемости и у сублинии ОА на 14 м, 26 м и 40 м пассажах (2,2±0,3; 2,2±0,2; 1,9±0,2 соответственно).

В некоторых работах высказываются предположения о том, что повышенная частота таких центрических слияний может быть связана с гиперплоидностью клеток (6). Однако в наших исследованиях не обнаружено прямой связи между числом Хр в клетках и присутствием робертсоновских транс локаций (табл. 2).

Как правило, центрические слияния наблюдались между гетерологичными хромосомами, только в одной клетке субли нии G1 ОА на 14 м пассаже была обнаружена изохромосома РБ (8;8) (рис. 1). В гетерологичных центрических слияниях принимали участие все без исключения хромосомы; в суб линии G1 ОА на 35/14 м пассаже относительно чаще, чем другие, в таких слияниях участвовали Хр 5, 8, 9, 10, 12 и 14 (см. рис. 1).

Для того, чтобы оценить особенности хромосомного соста ва, отдельные клетки каждого пассажа были кариотипирова ны. Пример результата кариотипирования метафаз сублинии G1 ОА на 35/14 м пассаже представлен в таблице 3. Вид но, что в большинстве случаев Хр присутствуют в метафазных пластинках в 4-6 копиях, за исключением Хр 6, 7 и 12, по которым обнаруживается определенный дефицит копий по сравнению с другими Хр (табл. 3). В относительно избыточном количестве копий представлена Хр 11 (см. табл. 3). Сходные тенденции наблюдаются и в кариотипированных клетках других клеточных популяций линии G1.

Интересно отметить, что увеличение копийности Хр 11 выявлено в большом количестве линий ЭСК мыши, что свя зывают с локализацией в этой Хр гена STAT3, участвующего в STAT3/JAK пути контроля клеточной пролиферации и, соответственно, накоплением клеток с увеличенной копий ностью Хр11 при их отборе в культуральных условиях на высокий уровень пролиферативной активности [8].

Одна из возможных причин относительного дефицита копий Хр 6 и 12 может быть обусловлена тем, что в клетках всех рассмотренных популяций встречается транслокация между этими двумя хромосомами (рис. 2). Необходимо отме тить, что такая же транслокация была выявлена нами ранее в клетках миелом мышей той же линии BALB/с [9].

Транслокация t(6;12) не является типичной транслока цией для клеток миелом; как правило, в них встречаются варианты t(6;15), t(12;15) транслокации между хромо сомами, несущими гены иммуноглобулинов (Хр 6,12) и туе онкоген (Хр 15) [10].

В последние годы показано, что способность ЭСК к само копированию без дифференцировки зависит от экспрессии комплекса генов, таких, как Esrrb, ТЬхЗ и Тс11, Nanog, 0ct4 и Sox2. Экспрессия 0ct4 необходима для предупреждения диф ференцировки клеток в трофоэктодермальном направлении. Nanog и Sox2, по видимому, являются интегральными регу ляторами, подавляющими многие дифференцировочные про граммы, а экспрессия генов Esrrb, ТЬхЗ и Тс11 необходима для блокирования программ клеточной дифференцировки в клеточные линии, производные эпибласта [11].

Nanog локализован в сегменте F2 хромосомы 6, Тс11 -в сегменте Е хромосомы 12, a Esrrb - в сегменте D2 хромо сомы 12. ТЬхЗ локализован в сегменте F Хр 5, a Sox2 -в сегменте В Хр 3 (www.ncbi.nlm.nih.gov).

Таким образом, транслокация t(6; 12) объединяет три ключевых гена из пяти имеющихся, блокирующих клеточную дифференцировку и способствующих самокопированию кле ток в отношении сохранения плюрипотентности. Интересно отметить, что в сегменте С Хр 12 локализован псевдоген Nanog PS2.

Судя по дифференциальной исчерченности перестро енной хромосомы (см. рис. 2), разрыв в Хр 12 проходит по сегменту Е, в котором локализован ген Тс11. В Хр 6 разрыв попадает на сегмент С, расположенный существенно выше локализации Nanog.

На основании полученных данных можно предположить, что присутствие одной и той же транслокации t(6;12) в клетках миелом, а также во всех рассмотренных популяциях ЭГ G1 в определенной степени может быть связано со способное тью опухолевых и ЭГ клеток сохранять полипотентность и избегать терминальных стадий дифференцировки.

Миеломы состоят из клеток потомков высокоспециали зированных В лимфоцитов, способных к таким специали зированным клеточным синтезам, как продукция иммуно глобулинов. Если предполагать наличие определенной связи между транслокацией t(6;12) и нарушением событий цито дифференцировки, то речь может идти только о поздних ее этапах.

Не исключено, что присутствие транслокации t(6;12) в миеломах и ЭГ клеток связано с общим происхождением клеток от линии мышей BALB/с, а также с тем, что для ЭГ клеток этого происхождения присутствие t(6;12) типично только для исследованной линии клеток ЭГ G1. Выяснение этих вопросов является предметом дальнейших исследо ваний.

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что в исследованных клеточных популяциях разных пассажей ЭГ G1, несмотря на селекцию в отношении неза висимости от сывороточных факторов, высокую гетероген ность по сочетанию клеток с разным числом Хр, постоянные процессы генерации популяционно генетического разнооб разия, о чем свидетельствуют широкие спектры робертсо новских транслокаций, а также наличие гипероктаплоидных клеток даже на 75 м пассаже ЭГ клеток G1, эта линия име ет свои кариотипические особенности. К основным из них, по видимому, относятся высокая частота встречаемости ро бертсоновских транслокаций (около 2 на клетку), преем ственность близости числа Хр к пента и гексаплоидному набору, а также присутствие транслокации t(6;12).

Можно предположить, что выявленные особенности сви детельствуют о наличии линейноспецифичных механизмов генерации генетической изменчивости, необходимой для адаптации клеток к росту в культуральных условиях в недиф ференцированном состоянии.

Подняться вверх сайта