Поиск Кабинет

Посттравматические реакции спинного мозга крысы при трансплантации клеток обонятельной выстилки человека

Гены & Клетки: Том VII, №2, 2012 год, стр.: 92-96

 

Авторы

Шаймарданова Г.Ф., Челышев Ю.А., Лебедев С.В., Савченко Е.А., Викторов И.В., Карасёв А.В., Чехонин В.П.

ДЛЯ ТОГО ЧТОБЫ СКАЧАТЬ СТАТЬЮ В ФОРМАТЕ PDF ВАМ НЕОБХОДИМО АВТОРИЗОВАТЬСЯ, ЛИБО ЗАРЕГИСТРИРОВАТЬСЯ

На модели контузионной травмы спинного мозга крысы на уровне Тh9 исследовано влияние на структуру спинного мозга немедленной трансплантации клеток обонятельной выстилки человека в область повреждения. Без иммуносупрессии введенные клетки присутствуют в белом веществе не менее 7 сут. после трансплантации на расстоянии 2 см от точек введения как в ростральном, так и в каудальном направлениях. Показана их миграция в область очага повреждения и скопление по его периферии. При введении клеток установлено значимое уменьшение области деструкции к 30 и 60 сут. эксперимента в сером и, особенно, в белом веществе. Трансплантация клеток к 30 сут. вызывает существенное снижение размеров патологических полостей в белом веществе с наибольшим проявлением эффекта в передних канатиках. В непосредственной близости от области введения клеток (на расстоянии 3 мм от эпицентра травмы) показано увеличение количества сохранённых миелиновых волокон белого вещества.

Контузионная травма спинного мозга (КТСМ) вызывает комплекс патологических сдвигов, включающий гибель нейронов и глиальных клеток, дегенерацию нервных волокон, демиелинизацию, активацию микроглии и макрофагов. Эти нарушения являются причиной устойчивого функционального дефицита, усугубляемого естественными лимитирующими нейрорегенерацию факторами в ЦНС. Среди кажущихся перспективными немногочисленных экспериментальных подходов стимулирования посттравматической регенерации спинного мозга одно из ведущих мест принадлежит клеточной терапии. Трансплантируемые клетки необходимы для восстановления тканевого матрикса и формирования направляющих путей для роста аксонов, поддержания выживания нейронов и глиальных клеток, удлинения аксонов, стимулирования процесса миелинизации. На сегодняшний день одним из критериев отбора клеток, предназначенных для трансплантации, становится возможность трансфекции терапевтическими генами с высокой эффективностью их экспрессии в ткани реципиента. Этим условиям в разной степени удовлетворяют клетки нескольких типов, трансплантируемых при экспериментальной травме спинного мозга. Особый интерес вызывают работы, выполненные с трансплантацией мультипотентных мезенхимных стромальных клеток и нейральных (глиальных) клеток обонятельных структур, обонятельной луковицы и особенно обонятельной выстилки (КОВ). Последние улучшают восстановление функции при травме спинного мозга у грызунов, что послужило основанием для проведения клинических испытаний в некоторых странах [15]. КОВ человека обладают способностью стимулировать регенерацию и миелинизацию поврежденных аксонов спинного мозга крысы и частично восстанавливать двигательную и чувствительную функции [1, 2, 6]. КОВ продуцируют комплекс нейротрофических факторов, белки внеклеточного матрикса и молекулы адгезии нервных клеток. Интерес к КОВ подкреплен возможностью аутотрансплантации, не приводящей к длительному нарушению обоняния. Несмотря на значительное количество исследований с применением клеток данного типа для трансплантаций в спинной мозг, многие вопросы их поведения в ткани реципиента, а также влияние на конкретные события посттравматической дегенерации спинного мозга остаются неясными.

Нашими предыдущими исследованиями на модели КТСМ крысы показано, что трансплантация КОВ человека в область травматического повреждения обеспечивает улучшение двигательной функции в среднем на 11% (по критерию ВВВ) [3]. В настоящей работе на той же экспериментальной модели проведена оценка эффективности трансплантации КОВ человека на основе морфологических критериев.

Материал и методы

Работа выполнена на 37 крысах весом 250– 300 г. Животных содержали в стандартных условиях со свободным доступом к воде и пище. Животных после КТСМ, проводимой на уровне Th9 под наркозом по ранее описанной методике [4], разделили на опытную (n = 18) и контрольную (n = 19) группы. Сразу после контузии животным опытной группы в две точки ростральнее и каудальнее от эпицентра травмы вводили КОВ человека в количестве 1,5 млн клеток на крысу. Животным контрольной группы проводили аналогичные инъекции, но без клеток. Методики получения, культивирования и введения КОВ описаны ранее [2, 3].

Через 7, 30 и 60 сут. после травмы животных наркотизировали и транскардиально перфузировали охлажденным (4°С) 4% раствором параформальдегида. Забирали фрагмент спинного мозга длиной 5 см вместе с позвонками. Через 12 ч от начала фиксации спинной мозг отделяли от позвонков, разделяли на 5 фрагментов длиной 1 см каждый, нумеровали их с рострального конца для дофиксации и последующей идентификации.

Материал, эксплантированный на 7 сут. после операции, выдерживали в 30% растворе сахарозы и использовали для изготовления криостатных срезов, в которых визуализировали меченые СFDA-SE трансплантированные КОВ с помощью микроскопа Zeiss Axio Imager A1 в режиме флюоресценции. Ядра клеток дополнительно окрашивали специфическим красителем ДНК – DAPI (Sigma) – в концентрации 10 мкг/мл в течение 10 мин. Срезы промывали в PBS (3 раза по 15 мин), заключали в глицерин и просматривали на конфокальном сканирующем микроскопе LSM 510-Meta (Carl Zeiss).

Материал, забранный на 30 и 60 сут. после операции, дофиксировали в глутаральдегиде и четырехокиси осмия, обезвоживали и заливали в эпон 812. На ультрамикротоме LKB III получали полутонкие поперечные срезы спинного мозга для морфометрии и ультратонкие срезы для электронномикроскопического исследования.

На полутонких срезах, окрашенных метиленовым синим, измеряли площадь области деструкции серого и белого веществ в эпицентре и на расстоянии 3, 5, 16 и 24 мм; считали суммарную площадь патологических полостей и количество миелиновых волокон на расстоянии 3 и 5 мм ростральнее и каудальнее эпицентра травмы в 4 зонах белого вещества: 1 зона – вентро-медиальная часть переднего канатика, правая сторона; 2 – то же, левая сторона; 3 – латеральная часть бокового канатика в пределах фронтальной плоскости, проходящей через центральный канал, правая сторона; 4 – то же, левая сторона. Суммарную площадь патологических полостей и количество миелиновых волокон оценивали в площади среза 0,09 мм2 при увеличении ×250. Суммарную площадь поврежденного серого и белого вещества измеряли при увеличении ×40. Морфометрию осуществляли на микроскопе Carl Zeiss JENS NU2.

Ультратонкие срезы контрастировали уранилацетатом и цитратом свинца. В пределах тех же 4 зон с помощью электронного микроскопа JEM-1200 EX подсчитывали количество миелиновых волокон диаметром не более 9 мкм в трех полях зрения при увеличении ×8000. Для статистической обработки результатов применяли t-критерий Стьюдента.

Результаты

КТСМ вызывает глубокие деструктивные изменения, как в сером, так и в белом веществе. Общая их картина на данной модели у крысы детально описана нами ранее [5]. Меченые CFDA-SE трансплантированные КОВ человека выявлены в дорсальном отделе белого вещества (рис. 1) через 7 сут. после КТСМ и одновременного введения клеток. Трансплантируемые КОВ выживают в поврежденной ткани и мигрируют из точки введения на расстояние до 2 см как в ростральном, так и в каудальном направлениях. Кроме того, они мигрируют в область очага и скапливаются преимущественно по его периферии. Меченые CFDA-SE клетки присутствуют в сохраненной ткани белого вещества, проникая также в формирующиеся патологические полости.

К 30 сут. эксперимента на всех изучаемых расстояниях от эпицентра травматического повреждения в группе животных с трансплантацией клеток установлено уменьшение области деструкции серого вещества. Так, в эпицентре площадь этой области на поперечных срезах спинного мозга в опыте более чем в 3 раза меньше, чем в контроле (рис. 2А). Различие по данному показателю к 60 сут. эксперимента уменьшается в большинстве исследованных плоскостей, проходящих на различном расстоянии от эпицентра травмы, площадь области повреждения серого вещества в опыте сохраняется достоверно меньшей, чем в контроле. Эта тенденция прослеживается как в ростральном, так и в каудальном фрагментах (рис. 2Б).

На тех же сроках эксперимента наиболее выраженное уменьшение площади деструкции в опыте выявлено в белом веществе. Однако эти различия статистически значимы только в эпицентре травмы и в непосредственной близости от него (рис. 2В, Г).

Микрокисты формировались в первые сутки и к 5–7 сут. сливались, образуя патологические полости преимущественно в белом веществе. Ранее на данной экспериментальной модели нами отмечено увеличение суммарной площади полостей в ходе развития патологического процесса, что прослежено вплоть до 60 сут. эксперимента [5]. Обращает на себя внимание значительное увеличение этого показателя по мере приближения к эпицентру травмы, что в наибольшей мере проявляется в зонах 1 и 2.

Через 30 сут. после КТСМ на расстоянии 5 мм от эпицентра травмы в передних канатиках (зоны 1 и 2) у животных опытной группы выявлено существенное снижение суммарной площади патологических полостей, по сравнению с контрольной группой. Так, при трансплантации КОВ в зоне 1 каудального фрагмента этот показатель уменьшался в 8 раз (P < 0,05), а в зоне 2 – в 10 раз (р < 0,05). Различия по этому показателю в наружных отделах боковых канатиков (зоны 3 и 4) не зарегистрированы.

Наиболее явные сдвиги показателя суммарной площади патологических полостей в белом веществе спинного мозга прослежены в опытной группе на расстоянии 3 мм от эпицентра. Они наиболее выражены в белом веществе передних канатиков (зона 1 и особенно зона 2). В зоне 1 этот показатель при трансплантации клеток меньше в 3,6 раз (р < 0,05), в зоне 2 – в 16 раз, в зонах 3 и 4 – в 2 раза (р < 0,05).

На расстоянии 3 и 5 мм от эпицентра травматического повреждения, как в ростральном, так и каудальном направлении отмечена выраженная деструкция миелиновых волокон в белом веществе к 60 сут. после повреждения. Она характеризовалась глубокими нарушениями структуры миелиновой оболочки, расслоением миелина и образованием крупных вакуолей по периферии волокон большого диаметра (рис. 3А, В). Присутствовали остатки миелиновой оболочки с фрагментами аксонов или с полностью разрушенными аксонами. В большинстве миелиновых волокон аксоны сохранены, их структура значительно изменена. Считается, что подобные волокна могут проводить импульсы, но с существенно меньшей скоростью [12]. К 60 сут. в опыте, т.е. при ведении КОВ, практически во всех зонах и особенно в боковых канатиках, чаще встречались миелиновые волокна небольшого диаметра и безмиелиновые волокна с незначительными структурными изменениями в виде редких областей повышенной электронной плотности миелина, некоторой его нечеткостью и незначительными участками расслоения, появления небольших вакуолей в периаксональном пространстве с редкими фрагментами внутренних мембран миелина или островков гомогенного материала (рис. 3Г).

На расстоянии 5 мм каудальнее эпицентра не выявлено достоверного преобладания количества миелиновых волокон в опытной группе животных. В этой группе сохраненные миелиновые волокна имели больший диаметр. В зонах 2 и 4 (левая сторона, соответственно передние и боковые канатики) количество сохраненных миелиновых волокон в группе животных с введением клеток меньше, чем в соответствующем контроле. Это уменьшение может быть следствием дополнительной травмы в ходе осуществления процедуры введения КОВ в данную точку.

Однако на расстоянии 3 мм от эпицентра травмы практически во всех исследованных областях белого вещества количество миелиновых волокон в опытной группе превышало их количество в контроле. В зоне 1 этот показатель при трансплантации клеток больше в 1,5 раза (р < 0,05), в зоне 3 – в 2 раза (р < 0,05). Аналогичная позитивная картина соотношения количества сохранённых миелиновых волокон в контроле и опыте отмечена на соответствующих расстояниях в ростральном направлении от эпицентра травматического повреждения.

На сроке 60 сут. после операции в зонах 2 и 3 на расстоянии 3 мм от эпицентра травмы, как в ростральном, так и в каудальном направлении, с помощью электронного микроскопа установлено увеличение количества миелиновых волокон в опытной группе в 1,6 раза (р < 0,05) с преобладанием волокон диаметром менее 2 мкм.

Обсуждение

В отношении миграционного потенциала и способности поддерживать рост аксонов КОВ не проявляют уникальных свойств [14]. Будучи введенными в грудной отдел интактного спинного мозга иммунодефицитных крыс, КОВ к 7 сут. мигрируют на расстояние не более 1 мм. При этом в условиях гемисекции спинного мозга, на контралатеральной от места введения клеток стороне их способность к миграции уменьшается в 1,5–2 раза [8]. Это снижение миграционного потенциала трансплантируемых клеток может быть следствием формирования глиального рубца. Однако на модели передавливания дорсального отдела спинного мозга крысы показана миграция трансплантируемых КОВ на расстояние в 25 мм в условиях введения клеток через 2 нед. после травмы [7], когда рубец уже сформирован. В наших экспериментах появление трансплантированных в спинной мозг КОВ на удалении от места инъекции может быть связано с их пассивным перемещением вследствие развития отека и напряжения ткани в области травматического повреждения. В отношении КОВ при их трансплантации в спинной мозг допускается возможность подобного неактивного перемещения [7]. В отношении способности к миграции трансплантированных в спинной мозг КОВ наши данные более близки результатам исследования Li et al. [13], полученным на модели бокового амиотрофического склероза у трансгенных по супероксиддисмутазе SOD1(G93A) крыс при трансплантации КОВ в область дорсальных канатиков. Авторы этой работы показали возможность миграции трансплантированных КОВ в спинном мозге реципиента на расстояние 4,2 мм при их выживании в течение более 4 нед. При этом зарегистрировано существенное снижение гибели мотонейронов и стимулирование процесса ремиелинизации.

При травме спинного мозга, при которой область повреждения достаточно обширна, миграционный потенциал трансплантируемых клеток представляется крайне важным для нейрорегенерации. Он особенно значим для сдерживания процесса дегенерации миелиновых волокон и для стимулирования их ремиелинизации на всем протяжении области деструкции, начиная от эпицентра травмы и заканчивая зоной сохраненной ткани с интактными волокнами.

Выявленное нами уменьшение патологической кавитации при трансплантации КОВ человека в спинной мозг крысы согласуется с результатами трансплантации подобных клеток от человека, приматов и грызунов в спинной мозг крысы на моделях контузионной травмы [9], фотохимического повреждения [17], компрессии дорсо-латерального отдела [16] и полной перерезки [10, 11].

Представляется достаточно вероятным, что КОВ человека, благодаря своей способности продуцировать нейротрофические факторы, молекулы адгезии и внеклеточного матрикса, а также стимулировать миграцию шванновских клеток в очаг повреждения спинного мозга, создают благоприятные условия для ремиелинизации и восстановления функции.

Механизм позитивного влияния трансплантации КОВ при травме спинного мозга остается неясным. В последнее время высказывается предположение о проявлении со стороны КОВ свойств иммунокомпетентных клеток и их способности модулировать выраженность процесса воспаления и вторичного повреждения в области травмы спинного мозга [9, 11].

Подняться вверх сайта