Поиск Кабинет

Получение и обратимая агрегация клеток человека, включенных в биосовместимую полисахаридную оболочку

Гены & Клетки: Том VII, №3, 2012 год, стр.: 121-124

 

Авторы

Мухамадеева Р.А., Мавлютова И.И., Бондарь О.В.

ДЛЯ ТОГО ЧТОБЫ СКАЧАТЬ СТАТЬЮ В ФОРМАТЕ PDF ВАМ НЕОБХОДИМО АВТОРИЗОВАТЬСЯ, ЛИБО ЗАРЕГИСТРИРОВАТЬСЯ

Методом динамического рассеяния света исследованы процессы осаждения катионного (хитозана) и анионного (альгиновой кислоты) полисахаридов на поверхности нормальных и опухолевых клеток человека. Предложен способ формирования многослойной полимерной оболочки, образуемой путем электростатической адсорбции полисахаридов на поверхности плазмалеммы клеток. По данным конфокальной микроскопии полимерная оболочка равномерно покрывает клетки и имеет толщину в 1–5 мкм. В условиях эксперимента модификация полисахаридами угнетает жизнеспособность фибробластов кожи человека, но не проявляет цитотоксичности для клеток HeLa. Предложен подход к контролируемой и обратимой агрегации модифицированных клеток путем их кросс-сшивки ионами кальция. Образующиеся при этом многоклеточные агрегаты имеют сферическую форму и размер от 100 до 500 мкм. Предложенные подходы и методы являются альтернативой микроинкапсуляции клеток и представляют интерес для создания трехмерных моделей клеток и технологий их доставки in vivo.

На сегодняшний день трансплантация клеток является перспективным подходом в лечении многих заболеваний и травм [1]. Исследования последних лет показывают, что различные клетки, в частности, фибробласты [2], эпителиальные клетки [3], Шванновские клетки [4], а также мультипотентные мезенхимные стромальные клетки [5, 6] обладают значительным потенциалом для обеспечения регенерации большинства тканей человека.

Эффективность методов клеточной терапии напрямую зависит от оптимальной локализации и «приживаемости» трансплантируемых клеток. Для повышения эффективности доставки клеток применяют различные подходы, например, включение клеток в биосовместимые гидрогелевые матриксы или микрокапсулы [7]. Предложены способы инкапсуляции стволовых клеток в микросферы на основе альгиновой кислоты и коллагена в качестве систем доставки в поврежденные ткани [8, 9].

Перспективной альтернативой микроинкапсуляции является подход, основанный на послойной модификации клеток тонкой полимерной оболочкой, защищающей клетку от факторов внешней среды и не препятствующей транспорту питательных веществ/метаболитов [10, 11]. Нами разработаны способы модификации клеток человека в идрогелевую оболочку из природных полисахаридов и контролируемой агрегации модифицированных клеток для получения сфероидов в качестве трехмерных моделей культур клеток.

Материал и методы

В работе использовали: хитозан, пропидия йодид, DAPI (4’,6-diamidino-2-phenylindole), кальцеинAM (Sigma-Aldrich, США), альгинат натрия, люцифер желтый Acros Organics.

Клетки аденокарциномы эпителия шейки матки (HeLa) и первичные фибробласты кожи человека культивировали соответственно в средах DMEM и α-MEM, содержащих 10% сыворотки крови плода коровы, 2 мМ L-глутамина, 100 ед/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина при 37°С в атмосфере 5% СО2. После достижения монослоя клетки трипсинизировали, отмывали от среды и суспендировали в фосфатно-солевом буфере (ФСБ, рН 7,4) в концентрации около 1 млн клеток на 1 мл.

Хитозан и альгинат адсорбировали на поверхности плазматической мембраны, последовательно выдерживая клетки в растворах полимеров и осаждая центрифугированием. Процедуру повторяли 4–6 раз для формирования многослойных оболочек на поверхности клеток. На каждом этапе адсорбции регистрировали электрокинетический потенциал (дзетапотенциал) клеток методом электрофоретического светорассеяния на анализаторе Zetasizer NanoZS (Malvern, США) в U-образной кювете при pH 7,4.

Для анализа цитосовместимости полисахаридной оболочки модифицированные клетки культивировали в стандартных условиях 4 сут. Живые и нежизнеспособные/погибшие клетки окрашивали соответственно кальцеином-AM и пропидия йодидом и визуализировали с помощью инвертированного флуоресцентного микроскопа Axio Observer A1 (Carl Zeiss, Германия).

Для визуализации полисахаридной оболочки клеток к альгиновой кислоте ковалентно пришивали флуоресцентную метку люцифер желтый с помощью карбодиимидной реакции. Модифицированные клетки фиксировали в растворе параформальдегида; ядра клеток окрашивали DAPI.

Модифицированные полисахаридной оболочкой клетки с альгинатом в верхнем слое агрегировали путем ионотропной кросс-сшивки в присутствии хлорида кальция при комнатной температуре при перемешивании. Образующиеся агрегаты фиксировали в растворе параформальдегида. Фиксированные клетки и агрегаты, нанесенные на предметные стекла в среде заключения, анализировали на конфокальном лазерном сканирующем микроскопе Leica TCP SP2 (Leica Microsystems, США) с использованием иммерсионного объектива.

Диссоциацию агрегатов до исходных модифицированных клеток проводили путем обработки избытком ЕДТА.

Результаты и обсуждение

Для заключения клеток в гидрогелевую оболочку были выбраны биосовместимые полисахариды – хитозан и альгиновая кислота (АК), широко используемые для создания биоматериалов [12]. Полимеры осаждали на поверхности клеток HeLa посредством электростатической адсорбции. Процесс модификации контролировали с использованием метода электрофоретического светорассеяния, который позволяет оценивать электрокинетический (дзетапотенциал) клеток человека в суспензии [13, 14].

На первой стадии модификации поликатион хитозан электростатически адсорбировали на отрицательно заряженной плазмалемме клеток HeLa. Установлено, адсорбируемый хитозан вызывает нейтрализацию отрицательного заряда клеток (–22,5±0,8 мВ) (рис. 1), а в насыщающей концентрации – перезарядку клеток до значения дзетапотенциала +9,7 мВ.

В результате последующей адсорбции АК на поверхности клеток последние вновь приобретают отрицательный дзета-потенциал более –40 мВ. Таким образом, последовательное выдерживание клеток в растворах хитозана и АК сопровождалось перезарядкой клеток вследствие формирования модифицирующих слоев полисахаридов (рис. 1). Это свидетельствует об образовании полимерной оболочки вокруг клеток за счет электростатического взаимодействия противоположно заряженных полисахаридов.

Сходное изменение поверхностного заряда клеток наблюдали при модификации фибробластов кожи человека (данные не показаны).

Присутствие полисахаридной оболочки на поверхности клеток после модификации подтверждено данными лазерной сканирующей конфокальной микроскопии (рис. 2). Выяснено, что все модифицированные клетки окружены индивидуальными оболочками, толщина которых варьирует в среднем от 1 до 4 мкМ. Результаты указывают на то, что противоположно заряженные полисахариды, электростатически взаимодействуя между собой, образуют относительно толстые покрытия вокруг клетки. В нативных условиях эти покрытия, очевидно, представляют собой тонкий слой полисахаридного гидрогеля.

Нами исследовано влияние полимерной оболочки, полученной после 4 и 6 этапов модификации, на жизнеспособность и пролиферацию клеток HeLa и фибробластов кожи. Для этого исходные и модифицированные клетки культивировали в стандартных условиях и далее окрашивали смесью кальцеин-АМ/пропидия йодид для выявления соответственно жизнеспособных и погибших клеток.

На рис. 3 представлены флуоресцентные микрофотографии клеток на 3-й день культивирования. Установлено, что модификация клеток как 4-, так и 6-слойной оболочкой не препятствовала их адгезии и пролиферации. В случае 6-слойной модификации наблюдалось появление небольшого числа погибших клеток (см. рис. 3). По-видимому, в результате последней модификации образуется более плотная оболочка, которая затрудняет высвобождение клеток и их адгезию на поверхности.

Первичные фибробласты проявляли большую чувствительность к модификации, чем клетки HeLa. Так, уже 4-слойная полимерная оболочка вызывала понижение жизнеспособности у значительного числа клеток. При этом большинство клеток оставались заключенными в оболочку и не прикреплялись к поверхности планшета в отличие от контрольных немодифицированных клеток (не показано).

Результаты показывают, что получаемая полисахаридная оболочка частично снижает жизнеспособность клеток человека, и этот эффект более выражен для первичных клеток. Цитотоксичность полимерной оболочки возможно обусловлена как ее прямым действием на целостность и функционирование плазматической мембраны, так и опосредованным ингибированием транспорта питательных веществ в клетку.

Модифицированные клетки содержат в наружном слое альгиновую кислоту – полисахарид, образованный остатками полиуроновых кислот. Известно, что в присутствии ионов двухвалентных металлов, хелатирующих карбоксильные группы, альгиновая кислота образует гидрогель. Кросс-сшивку альгиновой кислоты ионами кальция и бария используют для инкапсулирования различных клеток в полимерные микрочастицы [10]. Нами исследована возможность контролируемой агрегации модифицированных клеток путем кросс-сшивки в присутствии Ca2+.

Добавление к клеткам HeLa, модифицированным 6-слойной оболочкой, 20–100 мМ Ca2+ сопровождалось образованием сферических клеточных агрегатов, размер которых варьировал в диапазоне 100-500 мкм в зависимости от плотности суспензии и концентрации клеток. Типичная микрофотография многоклеточного сфероида, полученного при кросссшивке модифицированных клеток, показана на рис. 4.

При добавлении хелатирующих агентов, таких как ЭДТА, к агрегатам модифицированных клеток, последние полностью диссоциировали; при этом сама процедура обратимой агрегации клеток не уменьшала их жизнеспособность. Предложенный подход представляет собой альтернативу методу микроинкапсуляции клеток и может быть использован в тканевой инженерии для создания трехмерных моделей клеток и технологии их доставки in vivo.

Подняться вверх сайта