Поиск Кабинет

Получение и характеристика индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека из фибробластов кожи пациентов с нейродегенеративными заболеваниями

Гены & Клетки: Том VI, №4, 2011 год, стр.: 82-88

 

Авторы

Некрасов Е.Д., Лебедева О.С., Честков И.В., Сюсина М.А., Федотова Е.Ю., Лагарькова М.А., Киселев С.Л., Гривенников И.А., Иллариошкин С.Н.

ДЛЯ ТОГО ЧТОБЫ СКАЧАТЬ СТАТЬЮ В ФОРМАТЕ PDF ВАМ НЕОБХОДИМО АВТОРИЗОВАТЬСЯ, ЛИБО ЗАРЕГИСТРИРОВАТЬСЯ

Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК) по своим свойствам аналогичны эмбриональным стволовым клеткам и могут быть получены из соматических клеток взрослого организма. Существуют два основных направления практического применения технологий ИПСК – это регенеративная медицина и моделирование заболеваний человека. На сегодняшний день процесс получения ИПСК исследуется во многих лабораториях мира, но пока не существует стандартов в технологии получения ИПСК. Целью данной работы являлась разработка простого, дешевого и технологичного протокола получения ИПСК и создание коллекции линий ИПСК, полученных из клеток пациентов с болезнью Паркинсона, для построения клеточной модели этого заболевания. В результате работы разработан протокол получения ИПСК на основе лентивирусной доставки трансгенов в клетки. Получены линии ИПСК от 3 пациентов, страдающих наследственными формами болезни Паркинсона.

Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК) способны к неограниченному числу делений в культуре in vitro и к дифференцировке во все типы клеток организма. ИПСК получают из соматических клеток взрослого организма, которые репрограммируют до плюрипотентного состояния с помощью набора определенных транскрипционных факторов. Репрограммирование соматических клеток до плюрипотентного состояния было впервые проведено в 2006 г. группой S. Yamanaka. Исследователями был проведен анализ влияния 24 факторов, тем или иным образом вовлеченных в процессы становления или поддержания плюрипотентности. Используя ретровирусные векторы, авторы произвели трансформацию мышиных эмбриональных фибробластов различными комбинациями этих факторов. В результате экспериментальной работы было установлено, что использование комбинации факторов OCT4, SOX2, c-Myc и KLF4 необходимо и достаточно для индукции плюрипотентного состояния в мышиных эмбриональных фибробластах [1]. Та же самая комбинация факторов работает и для клеток человека [2]. Хотя получение линий ИПСК выглядит концептуально и технически простой процедурой, репрограммирование – это процесс, включающий в себя большое количество мало изученных событий. На сегодняшний день этот процесс широко исследуется во многих лабораториях мира, опубликовано множество протоколов получения ИПСК, которые различаются по способу доставки трансгенов в клетки и условиям культивирования клеток в процессе репрограммирования [3].

ИПСК могут стать удобным инструментом для изучения болезней человека, имеющих генетическую предрасположенность, так как их легко можно получить от пациента с необходимым генотипом и использовать для получения неограниченного количества дифференцированных клеток. Хотя модели на животных, вероятно, останутся ключевым методом изучения заболеваний, они имеют ограничения, которые могут быть преодолены с помощью моделирования болезней на основе ИПСК. Таким ограничением, в частности, является отсутствие адекватных моделей на животных для некоторых заболеваний, свойственных только человеку. ИПСК представляют большой интерес для поиска новых лекарств методом высокопроизводительного скрининга, так как из них можно воспроизводимо получать неограниченные объемы дифференцированных клеток определенного типа с заданным генотипом. Например, компания Пфайзер успешно использовала нейроны, полученные из плюрипотентных клеток, в высокопроизводительном скрининге [4].

Цель данной работы заключалась в определении наиболее эффективной стратегии получения ИПСК для задач моделирования заболеваний человека на примере болезни Паркинсона.

Материал и методы

Получение культуры фибробластов из биоптатов кожи человека

После подписания информированного согласия пациентов выполнялась биопсия кожи предплечья. Биоптат хранили в среде DMEM (ПанЭко, РФ), 15% фетальная бычья сыворотка (FBS) (Hyclone, США), 2 мМ глутамин (Hyclone, США), 50 ед./мл пенициллин-стрептомицин (ПанЭко, РФ) (среда того же состава использовалась для дальнейшего культивирования фибробластов) в течение нескольких часов. Эксплантат в капле среды помещали на крышку чашки Петри и острым скальпелем разрезали на небольшие кусочки. Полученные кусочки помещали каждый в отдельную чашку Петри диаметром 35 мм (Corning, США) или по 3–4 в чашку Петри диаметром 6 см (Corning, США) и прижимали сверху стерильным покровным стеклом. На стекло наливали среду для культивирования. Через неделю меняли среду на свежую, стараясь не сдвинуть покровное стекло. Примерно через 3 нед. рассевали получившийся монослой фибробластов 0,25% трипсином (Hyclone, США).

Инфекция клеток лентивирусными векторами

В среду культивирования добавляли клеток Polybrene (Sigma-Aldrich, США) до концентрации 8 мкг/мл. Через час добавляли необходимое количество вирусного супернатанта в среду с клетками.

Определение титра лентивирусных векторов

Клетки Phoenix инфицировали супернатантами, содержащими в себе вирусные векторы, в различных разведениях. Через 48 ч после заражения клетки фиксировали и проводили иммуногистохимический анализ с помощью антител к соответствующему антигену. По проценту окрашенных клеток определяли титр вирусов.

Культивирование эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) и ИПСК человека на фидере

Среда для культивирования ЭСК и ИПСК человека в фидерных условиях имела следующий состав: DMEM/F12 (Hyclone, США), 20% Serum replacement (Invitrogen, США), 2 мМ L-глутамин (Hyclone, США), 0,1 мМ β-меркаптоэтанол (Sigma-Aldrich, США), 1% смесь аминокислот (Hyclone, США), пенициллинстрептомицин (50 ЕД/мл; 50 мкг/мл) (ПанЭко, РФ), bFGF 4 нг/мл (PeproTech, США). В качестве подложки для культивирования (фидера) использовались митотически инактивированные мышиные эмбриональные фибробласты. Смена среды производилась каждый день. Клетки пассировали каждые 5– 7 дней с использованием 1 мг/мл диспазы (Invitrogen, США).

Культивирование ЭСК и ИПСК человека в бесфидерных условиях

Культивирование проводили на среде для бесфидерного культивирования ЭСК человека mTESR1 (Stem Cell Technologies, Канада). В качестве подложки для культивирования использовался Matrigel (BD Biosciences, США). Приготовление покрытых матригелем культуральных чашек и планшетов производилось в соответствии с инструкциями производителя. Смена среды производилась каждый день. Клетки пассировали каждые 5–7 дней с использованием 1 мг/мл диспазы (Invitrogen, США).

Формирование и культивирование эмбриоидных телец

Среда для культивирования эмбриоидных телец имела следующий состав: DMEM/F12 (Hyclone, США), 20% FBS (Hyclone, США), 2 мМ L-глутамин (Hyclone, США), 0,1 мМ β-меркаптоэтанол (SigmaAldrich, США), 1% смесь аминокислот (Hyclone, США), пенициллин-стрептомицин (50 ЕД/мл; 50 мкг/ мл) (ПанЭко, РФ). Формирование эмбриоидных телец проводили следующим образом. Колонии ИПСК снимались диспазой (Invitrogen, США). Для этого удаляли культуральную среду, клетки промывали PBS, добавляли 0,5 мл раствора диспазы 1 мг/мл на 35 мм чашку (Corning, США), инкубировали при 37С в течение 7–10 мин. Затем удаляли раствор фермента, промывали 4 раза DMEM/F12 (Hyclone, США) и добавляли 1 мл культуральной среды. Колонии соскабливали пластиковым наконечником на 5–200 мкл, осторожно диссоциировали на фрагменты (400–600 клеток), центрифугировали, надосадочную жидкость удаляли, осадок суспендировали в среде для культивирования эмбриоидных телец и переносили в чашки Петри с предельно низкой адгезией Ultra Low Adhesion Plates (Corning, США). На следующий день ЭСК формировали плавающие округлые агрегаты. Среда сменялась через день. На 4–5 день культивирования эмбриоидные тельца увеличивались в размере, начинала появляться полость.

Спонтанная дифференцировка ИПСК и ЭСК

Эмбриоидные тельца в возрасте 10–20 дней переносили на покрытые желатином (Sigma-Aldrich, США) чашки Петри в среде для культивирования эмбриоидных телец. Эмбриоидные тельца прикреплялись к желатиновой подложке и начиналась миграция клеток из эмбриоидных телец на поверхность чашки. Через 2–3 нед. образовывались обширные области дифференцированных клеток.

Получение ИПСК

Фибробласты кожи, замороженные на первом пассаже, размораживали и сеяли примерно 40 000 клеток в среде для фибробластов на 35 мм культуральную чашку (Corning, США). Через 2 дня после рассева клетки инфицировали четырьмя оригинальными лентивирусными векторами (LeGO-hOCT4, LeGO-hSOX2-IRES-GFP, LeGO-hc-Myc, LeGO-hKLF4) в различных количествах и соотношениях. Через 5 дней после инфекции клетки пересевали 1 к 12 на различные подложки: пластик (Corning, США), желатин (Sigma-Aldrich, США), матригель (BD Biosciences, США) и митотически инактивированные мышиные эмбриональные фибробласты в среде для фибробластов. На следующий после пересева день среду меняли на среду для культивирования ЭСК в фидерных условиях. Затем клетки культивировались в этой среде в течение 10–12 дней (рис.1Б), среда менялась раз в 2 дня. К этому моменту на чашках образовалось множество клонов с различной морфологией. Эти клоны механически пересевали и культивировали раздельно в условиях культивирования ЭСК без фидера. В процессе репрограммирования в среду клеткам добавляли вальпроевую кислоту (VPA) (Sigma-Aldrich, США) до концентрации в среде 1мМ и BIX-01294 (Sigma-Aldrich, США) до концентрации в среде 2 мкМ в течение первой недели после инфекции, в течение третьей недели после инфекции, или не добавляли вовсе.

Дифференцировка ИПСК в нейральные клетки

Для индукции нейрональной дифференцировки ИПСК культивировали до субконфлюэнтности, затем обрабатывали диспазой (Invitrogen, США), как описано выше, и переносили в новую чашку Петри, покрытую желатином и культивировали в DMEM/ F12 (Hyclone, США) с 1% N2 (Invitrogen, США), 2% Serum replacement (Invitrogen, США), 50 нг/мл noggin (PeproTech, США). Среду меняли через день. Через 10–14 дней в культуре начинали появляться розеткоподобные структуры.

Через 2 нед. культивирования розетки, которые могли составлять до 70% клеток, механически отделяли от остальных клеток культуры с помощью пластикового наконечника, а затем либо индуцировали дифференцировку напрямую, либо переводили культуру в суспензионную форму и культивировали в виде нейросфер, в плашках с предельно низкой адгезией Ultra Low Adhesion Plates (Corning, США) в среде DMEM/F12 (Hyclone, США) c добавлением N2 (Invitrogen, США), содержащей 20 нг/мл EGF (PeproTech, США), 20 нг/мл bFGF (PeproTech, США). Нейросферы культивировали в течение двух недель. Для дифференцировки клетки либо со стадии «розеток», либо со стадии нейросфер культивировали на пластике, покрытом желатином (Sigma-Aldrich, США). Для дифференцировки нейронов в базовую среду вместо EGF (PeproTech, США) и bFGF (PeproTech, США) добавляли 10 нг/мл BDNF (PeproTech, США) и 5 нг/мл GDNF (PeproTech, США) и продолжали культивирование в течение 2 нед. для розеток и 7– 10 дней для нейросфер.

Результаты и обсуждение

Система доставки трансгенов в клетки

Для задач моделирования заболеваний человека, то есть исследований in vitro, на первый план выходят такие свойства протокола получения ИПСК как простота, дешевизна и воспроизводимость. На сегодняшний день уже удалось получить ИПСК с помощью множества различных методов доставки трансгенов в клетки: ретровирусные векторы [1, 2], piggyBAC транспозон [5], транзиторная трансфекция плазмидных векторов [6] и др. [7]. Нами был выбран лентивирусный метод доставки транскрипционных факторов в клетки, так как он широко используется в экспериментах по репрограммированию и хорошо отработан. Были сконструированы оригинальные плазмиды на основе LeGO vector system [8] LeGO-hOCT4, LeGO-hSOX2-IRES-GFP, LeGO-hc-Myc, LeGO-hKLF4 для сборки лентивирусных векторов, несущих в себе гены транскрипционных факторов OCT4, SOX2, c-Myc и KLF4, соответственно. В отличие от плазмид лаборатории S. Yamanaka , в наших оригинальных плазмидах трансген фланкирован LoxP сайтами, что позволяет удалить его из геномной ДНК клетки. Сборка лентивирусов LeGO-hOCT4, LeGO-hSOX2-IRES-GFP, LeGO-hcMyc, LeGO-hKLF4 проводилась в упаковочных клетках Phoenix по протоколу сборки лентивирусных векторов, который описан на сайте http://www.lentigo-vectors. de/. Мы сравнили эффективность сборки лентивирусных векторов на основе плазмид лаборатории S. Yamanaka и наших оригинальных плазмид. Новые плазмиды обеспечивают, по сравнению с плазмидами лаборатории S. Yamanaka, на порядок более эффективную сборку лентивирусных векторов, что приводит к более высокому титру вирусных векторов в супернатанте (данные не приведены). Это позволяет отказаться от концентрирования лентивирусных векторов перед использованием, а, следовательно, упростить работу с ними.

Материал для получения ИПСК

ИПСК уже удалось получить из многих типов соматических клеток человека [9–11]. В большинстве случаев мутация, вызывающая патологию, является наследственной, и содержится во всех клетках пациента. В таких случаях разумно использовать фибробласты кожи, так как их легко культивировать и получать от пациентов с помощью несложной и малоинвазивной процедуры – биопсии кожи [11]. Мы выбрали для моделирования болезнь Паркинсона – неизлечимое хроническое нейродегенеративное заболевание, которое характеризуется прогрессирующим разрушением и гибелью дофаминовых нейронов в центральной нервной системе, главным образом, компактной части чёрной субстанции и области голубого пятна головного мозга. Были получены первичные культуры фибробластов из биоптатов кожи трех пациентов мужского пола с диагнозом «болезнь Паркинсона» (рис.1А). Причина заболевания: у первых двух пациентов – мутация G2019S в 41-м экзоне гена LRRK2, третий пациент – ди-гетерозигота по гену PARK2, мутации del 202-203 AG и IVS1+1G/A в различных аллелях. Фибробласты культивировали до 3 пассажа, при этом на первом, втором и третьем пассажах часть культуры криоконсервировали для создания банка первичных клеточных культур и сохранения клеточного материала.

Протокол получения ИПСК

Удалось получить ИПСК человека из фибробластов кожи всех трех пациентов при различных вариациях в протоколе. Было отобрано более 10 клонов ИПСК от каждого пациента, 3 клона от каждого пациента использовали для дальнейшей работы (рис.1В), остальные клоны подвергали криоконсервации. Установлено, что количество и соотношение вирусов при инфицировании клеток изменяет количество клонов ИПСК, получаемых в процессе репрограммирования, на порядки. Наилучший результат достигается при следующих параметрах: LeGO-hOCT4 – MOI 10 (т.е. 10 инфицирующих единиц на 1 клетку), LeGOhSOX2IRES-GFP – MOI 10, LeGO-hc-Myc – MOI 2.5, LeGO-hKLF4 – MOI 5. Установлено, что тип подложки не оказывает значительного влияния на количество клонов ИПСК, получаемых в процессе репрограммирования.

В процессе работы был изучен эффект сайленсинга (замолкания экспрессии трансгенов). мРНК, транскрибируемая с вирусного вектора LeGO-hSox2IRES-GFP, помимо кодирующей части транскрипционного фактора Sox2, также содержит кодирующую часть зеленого флуоресцентного белка (GFP), которому предшествует альтернативный сайт посадки рибосомы (IRES). Это приводит к тому, что с одной мРНК транслируются сразу два белка, что позволяет отслеживать транскрипционную активность трансгенов. Визуальный мониторинг наличия флуоресценции GFP в репрограммированных клетках позволил установить, что экспрессия трансгенов с вирусных конструкций происходит со 2 по 12 день после инфекции.

Был изучен эффект воздействия комплекса химических соединений VPA и BIX-01294 на репрограммирование фибробластов в плюрипотентное состояние, эти соединения по литературным данным значительно повышают эффективность репрограммирования [12, 13]. Добавление указанных химических соединений на первой неделе после инфекции приводило к увеличению количества клонов более чем на порядок, в то время как их добавление на третьей неделе не вызывало значительного увеличения количества клонов ИПСК (рис. 2).

Анализ клонов ИПСК

С целью подтверждения репрограммирования фибробластов кожи до плюрипотентного состояния был проведен анализ экспрессии маркеров, характерных для плюрипотентных клеток: OCT4, SOX2, c-Myc, KLF4, NANOG, FOXD3, HESX1, SALL4, DPPA4, SALL1, SSEA-4, методами ОТ-ПЦР и иммуноцитохимии (рис.1Г). Проведенный анализ показал, что в отобранных клонах экспрессируются гены-маркеры плюрипотентного состояния.

Во время репрограммирования происходят значительные изменения не только в паттерне экспрессии генов, но также наблюдаются значительные изменения хроматина, которые могут приводить к хромосомным перестройкам. Для подтверждения отсутствия трансформации полученных ИПСК был проведен анализ кариотипа клонов методом GTGдифференциального окрашивания. Отобранные для дальнейшего изучения клоны имеют нормальный кариотип 46 XY (данные не приведены).

Для функционального подтверждения плюрипотентного статуса репрограммированных из фибробластов клеток нами был использован анализ на формирование клетками эмбриоидных телец и дифференцировку в клетки, принадлежащие трем зародышевым листкам.

Полученные ИПСК способны формировать эмбриоидные тельца и дифференцироваться в различные типы клеток. В культуре спонтанно дифференцировавшихся клеток присутствовали группы клеток, положительно окрашивающиеся на маркер клеток эктодермы – панцитокератин, мезодермы – десмин и энтодермы – α-фетопротеин (рис. 3). Таким образом, полученные репрограммированные клетки проявляли функциональные свойства плюрипотентных клеток – были способны дифференцироваться в клетки – производные трех зародышевых листков.

Для диффренцировки ИПСК в нейроны мы применили протокол, ранее разработанный нами для дифференцировки ЭСК человека, с использованием рекомбинантных белков: noggin (антагонист BMP4), а также факторов экспансии нейрональных предшественников bFGF и EGF. В соответствии с протоколом, ИПСК, полученные из кожных фибробластов, были дифференцированы в нейросферы и, в дальнейшем, в зрелые постмитотические нейроны. Проведенный иммуногистохимический анализ показал, что полученные нейроны имеют не только специфические нейрональные маркеры (β-3-тубулин), но еще экспрессируют характерные для дофаминэргических нейронов ферменты (тирозин-гидроксилаза) (рис. 4).

Заключение

Для целого ряда заболеваний человека эффективные методы терапии пока еще не разработаны. В первую очередь это связано с отсутствием адекватных моделей для изучения патогенеза заболевания и тестирования лекарственных средств. Поиск и разработка новых моделей для таких нейродегенеративных заболеваний человека, как болезнь Паркинсона, Альцгеймера и ряда других является актуальной задачей. Разработанная недавно технология генетического репрограммирования позволяет из легко доступных клеток, например, фибробластов кожи, получить в лабораторных условиях клетки и ткани, в которых проявляется патологический фенотип и, таким образом, получить возможность установить механизмы развития заболевания и способы их устранения. Нами предпринята попытка разработки таких моделей для больных Паркинсоном с известными мутациями. Для репрограммирования клеток кожи нами была использована система доставки транскрипционных факторов в клетки, которая имела целый ряд преимуществ по сравнению как с оригинальной системой, созданной в лаборатории S. Yamanaka c соавт. (2007), так и по сравнению с новейшими системами репрограммирования соматических клеток без интеграций в геном [14, 15]. Она проще в использовании и дешевле, при этом позволяет впоследствии удалить интегрированные в геном гены, которые могут представлять наибольший риск нарушения функционирования клетки.

Нами показано, что параметры инфекции лентивирусными векторами (соотношение в экспрессии транскрипционных факторов), а также использование химических соединений на самом начальном этапе репрограммирования оказывают значительное влияние на эффективность получения ИПСК. Необходимо отметить, что временной период применения химических молекул, приводящий к положительному эффекту, совпадает с периодом активности экзогенных транскрипционных факторов. В тоже время, подложка для культивирования и применение химических соединений на поздних этапах репрограммирования не оказывают значительного влияния на эффективность получения ИПСК. Полученные ИПСК охарактеризованы на способность дифференцироваться в клетки – производные трех зародышевых листков. Использование ранее разработанного протокола дифференцировки плюрипотентных клеток в дофаминэргические нейроны показало, что полученные из «больных» ИПСК нейроны количественно и морфологически не отличаются от дофаминэргических нейронов, полученных из нормальных культур ИПСК и ЭСК человека. Необходимы дальнейшие исследования полученных культур для выяснения молекулярных и клеточных механизмов развития патологии.

Подняться вверх сайта