Поиск Кабинет

Полимер-стабилизированные магнитные наночастицы не оказывают токсического воздействия на магнитно-функционализированные клетки

Гены & Клетки: Том VII, №3, 2012 год, стр.: 52-56

 

Авторы

Дзамукова М.Р., Науменко Е.А., Закирова Е.Ю., Дзамуков Р.А., Шилягин П.А., Ильинская О.Н., Фахруллин Р.Ф.

ДЛЯ ТОГО ЧТОБЫ СКАЧАТЬ СТАТЬЮ В ФОРМАТЕ PDF ВАМ НЕОБХОДИМО АВТОРИЗОВАТЬСЯ, ЛИБО ЗАРЕГИСТРИРОВАТЬСЯ

В работе проведён синтез суперпарамагнитных наночастиц оксида железа, стабилизированных полиаллиламин гидрохлоридом, с целью их использования для модификации клеточной поверхности. Магнетизация клеток лёгкого эмбриона коровы не влияла на их жизнеспособность, формирование монослоя и пролиферативную активность, что было подтверждено с применением флуоресцентной и светлопольной микроскопии, проточной цитометрии и теста с бромидом метилтиазолтетразолия. Модифицированные клетки проявляли способность к перемещению под действием постоянного магнитного поля. Описанный одностадийный метод модификации клеточной поверхности является принципиально новым и перспективным подходом к функционализации клеток млекопитающих в клеточной терапии для адресной доставки клеток в орган-мишень и тканевой инженерии для пространственной организации клеток.

Одним из перспективных направлений инженерии клеточной поверхности является получение магнитно-восприимчивых клеток. В связи с этим в биомедицинских исследованиях интенсивно разрабатываются методы по модификации культивируемых клеток наночастицами оксида железа. Магнитные наночастицы (МНЧ) могут найти применение в тканевой инженерии, для неинвазивной визуализации меченых клеток при помощи магнитно-резонансной томографии, а также для повышения эффективности доставки лекарств и для лечения онкологических заболеваний путем магнитной гипертермии [1, 2]. Недавние клинические испытания демонстрируют возможность отслеживания перемещения и распределения введенных магнитно-модифицированных клеток в теле человека [3]. Поскольку интерес к использованию наночастиц оксида железа в последнее время возрастает, то проблема нехватки информации об их взаимодействии с клеткой становится всё более острой [4].

Опубликованные результаты исследований по изучению потенциально токсичного воздействия наночастиц оксида железа на клетки противоречивы. Вероятно, это связано с характером использования наночастиц, что осуществляется либо путем нанесения МНЧ на поверхность клетки [5], либо внедрением их в цитоплазму [6]. Ранее, несколькими группами было установлено, что высокая концентрация МНЧ внутри клеток угнетает их пролиферативную активность [7, 8]. Более того, показано, что в присутствии лизосом в клетке некоторые типы частиц разрушаются, что снижает их эффективность в магнитно-резонансной томографии [6]. Кроме того, постепенная деградация наночастиц в клетке может сказываться на ее метаболизме и приводить к неконтролируемым последствиям. Таким образом, оптимальным способом модификации клетки является присоединение наночастиц к ее поверхности, без нарушения целостности мембраны.

В данном исследовании использовали суперпарамагнитные наночастицы оксида железа (МНЧ), стабилизированные полиаллиламин гидрохлоридом (РАН). Данный полимер придавал наночастицам положительный заряд и препятствовал их агрегации. Положительный заряд необходим для эффективной адсорбции наночастиц на отрицательно заряженной поверхности клетки. В работе использовали культивируемые клетки легкого эмбриона коровы (ЛЭК). Показано, что магнитная модификация при помощи МНЧ является эффективной, но при этом незначительно сказывается на способности к росту и делению функционализированных клеток.

Материал и методы

Получение и характеристика МНЧ. Детально процедура синтеза наночастиц описана ранее [5]. Полученный коллоидный раствор наночастиц фильтровали с помощью шприцевых полимерных фильтров фирмы Millipore с размером пор 220 нм. Гидродинамический диаметр частиц и дзетапотенциал определяли с использованием анализатора Malvern Zetasizer Nano ZS.

Культура клеток. Клетки ЛЭК, полученные из лаборатории клеточных культур и гибридомной технологии Федерального центра токсикологической, радиационной и биологической безопасности (г. Казань), культивировали (37оC, 5% СО2) в питательной среде RPMI-1640 (Gibco, Италия) с глутамином, с добавлением 10% инактивированной фетальной телячьей сыворотки и раствора пенициллина/ стрептомицина (100 ед. мл-1/100 мг мл-1). Клетки выращивали до 80-90% конфлюентности монослоя, удаляли ростовую среду, промывали фосфатносолевым буфером Дюльбекко (ДФСБ) трипсинизировали 0,25% раствором трипсина-ЭДТА (Sigma. США), центрифугировали при 500 g и ресуспендировали в ДФСБ.

Функционализация клеток ЛЭК МНЧ. Клетки ЛЭК (5×105 мл-1) смешивали со стерильной суспензией МНЧ (0,0125 мг мл-1; 0,025 мг мл -1; 0,05 мг мл-1) в 0,15 М NaCl. После инкубации в течение 3 мин с МНЧ клетки центрифугировали для удаления избытка МНЧ.

Определение жизнеспособности клеток. Ферментативную активность интактных и МНЧфункционализированных клеток ЛЭК определяли с использованием диацетата флуоресцеина (ФДА) [9]. Флуоресцентная микроскопия применялась для оценки жизнеспоспособности окрашенных образцов. Проточный цитометр BD FACSCanto (Biosciences) использовали для количественного определения жизнеспособности ФДА-окрашенных клеток. Экспериментальные данные анализировали при помощи программного обеспечения FACSDiva.

Для определения жизнеспособности клеток использовали МТТ-тест. Суспензию клеток ЛЭК (7000 клеток в 200 мкл среды на лунку) разливали в 96луночные плоскодонные планшеты, 8 лунок оставляли пустыми в качестве контроля, инкубировали 18 ч (37°C, 5% СО2), добавляли 20 мкл МТТреагента (5 мг/мл ДФСБ) и инкубировали 4 ч для метаболизации МТТ. Оптическую плотность измеряли при 560 нм на планшетном фотометре iMark Microplate Absorbance Reader (BioRad Laboratories, США). Оптическая плотность лизата коррелирует с количеством живых клеток.

Скорость роста и характер формирования монослоя наблюдали в процессе культивирования функционализированных и интактных клеток при помощи инвертированного микроскопа (Микромед, Россия). Изображения были получены с использованием программы Scope Photo. Оптические и флуоресцентные микрофотографии были получены при помощи прямого микроскопа Carl Zeiss AxioScope A1 с использованием программы AxioVision. Все эксперименты проведены как минимум в трех повторах, данные представлены в виде среднего ± стандартное отклонение.

Результаты

На первом этапе исследования были синтезированы стабилизированные полиаллиламин-гидрохлоридом (PAH) положительно-заряженные МНЧ. Процесс синтеза основан на преципитации ионов Fe2+ с Fe3+ в щелочной среде и приводит к формированию сферических частиц оксида железа. Поликатион использовали для стабилизации слабо стабильных в воде наночастиц оксида железа и обеспечения их положительно заряженной поверхностью.

Гидродинамический диаметр МНЧ в воде составил около 90 нм. Стабилизация при помощи PAH придала МНЧ положительный дзета-потенциал 38±7 мВ.

Для магнитной функционализации катионными МНЧ использовали клетки ЛЭК. Клетки ЛЭК обладают слабо отрицательным поверхностным зарядом (дзета-потенциал -22±3 мВ), поэтому катионные МНЧ эффективно присоединяются к клеточной мембране (рис. 1).

Оптическая микроскопия показала, что клетки покрыты однородным слоем МНЧ, при этом клетки приобретали коричневую окраску. Наблюдалась прямо пропорциональная зависимость между интенсивностью окраски и концентрацией вводимых МНЧ (рис. 2). При максимальной исследуемой концентрации (0,05 мг/мл-1) на одну клетку в среднем приходилось 10-7 мг МНЧ. При этом магнитные свойства функционализированные клетки ЛЭК приобретали уже при минимальной концентрации (0,0125 мг/мл-1), когда на одну клетку приходилось примерно 0,5×10-7 мг МНЧ. При помощи постоянного магнита их можно было концентрировать из суспензии у стенки сосуда. Скорость перемещения и концентрация клеток около магнита отличились в зависимости от количества МНЧ на клетке. Наибольшая скорость перемещения клеток под действием постоянного магнитного поля наблюдалась у клеток с наибольшим количеством МНЧ на их поверхности (10-7 мг). Так, для концентрации максимально-магнетизированных клеток у стенки сосуда при помощи магнита требовалось около 60 с, а для клеток, на которые в среднем приходилось по 0,5×10-7 мг МНЧ затрачивалось 80 с, тогда как при 0,25×10-7 мг МНЧ на поверхности каждой клетки нужно было около 100 с. Следует отметить, что клетки можно было перемещать при помощи магнита вдоль стенки сосуда.

Для исследования влияния МНЧ на внутриклеточные ферменты, использовали ФДА-тест [10]. Нефлуоресцирующий ФДА проходит через мембрану, где он подвергается ферментативному гидролизу при помощи внутриклеточных эстераз и окрашивает только живые клетки, тогда как в мертвых клетках эстеразы инактивированы, а повреждение мембран препятствует накоплению флуоресцентного красителя внутри цитоплазмы. При помощи флуоресцентной микроскопии было проведено качественное исследование влияния МНЧ на внутриклеточные ферменты. Различий между интактными клетками и МНЧ-функционализированными отмечено не было (рис. 3).

Проточная цитометрия была использована для количественной оценки воздействия различных концентраций МНЧ на жизнеспособность клеток. Как показано на рис. 4, в контрольном образце жизнеспособность клеток составляла 98%, что сравнимо с жизнеспособностью в опытных образцах при концентрациях МНЧ 0,0125 мг/мл-1; 0,025 мг/мл-1; 0,05 мг/мл-1: 94, 95 и 96%, соответственно.

Для оценки цитотоксичности МНЧ по отношению к функционализированным клеткам был проведен МТТ-тест (рис. 5), результаты которого свидетельствовали об отсутствии значимого различия между контрольными и опытными образцами.

Также было установлено, что МНЧ-покрытые клетки не только сохраняют жизнеспособность, но также способны к росту и пролиферации. Как показано на рис. 6А, через 48 ч инкубации магнетизированные и интактные клетки пролиферировали с одинаковой скоростью, при этом наблюдалось незначительное отставание в варианте с наибольшей концентрацией МНЧ (0,05 мг/мл-1). Однако через 72 ч культивирования площадь заполнения лунки во всех вариантах была примерно одинаковой и составляла около 95% (рис. 6Б).

В основе одноэтапного способа магнитной модификации, описанного в данной работе, лежит электростатическое взаимодействие биосовместимых полимер-стабилизированных суперпарамагнитных МНЧ с поверхностью клеток. Следует подчеркнуть, что присоединение наночастиц не требует высокоспецифичного лиганд-рецепторного взаимодействия МНЧ с мембраной клеток [11], что потенциально делает разработанный метод универсальным по отношению ко всем клеткам млекопитающих. Кроме того, данный прямой метод магнитной функционализации не требует предварительного последовательного нанесения на клетку полимерных слоев [12] и позволяет непосредственно покрывать поверхность клетки полимер-стабилизированными наночастицами, что также уменьшает возможное токсическое воздействие. Таким образом, отсутствие токсического эффекта PAH-стабилизированных МНЧ на клетки млекопитающих открывает перспективы их применения в биомедицинских манипуляциях, а именно в клеточной терапии для адресной доставки клеток, а также в тканевой инженерии, для пространственной организации клеток в создаваемой in vitro ткани.

Заключение

Таким образом, в работе впервые детально исследовано влияние PAH-стабилизированных суперпарамагнитных наночастиц оксида железа на жизнеспособность и пролиферативную активность клеток млекопитающих, а именно клетки ЛЭК. Установлено, что МНЧ не оказывают значительного токсического эффекта на модифицируемые клетки в исследованных концентрациях. Магнитно-модифицированные клетки сохраняли не только жизнеспособность, но и способность к активной пролиферации. При этом скорость роста модифицированных клеток практически не отличалась от скорости роста интактных клеток. Таким образом, для получения модифицированных клеток с наиболее ярко выраженными магнитными свойствами целесообразно использовать наибольшую концентрацию МНЧ.

Подняться вверх сайта